のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動<em&gt;その場での</em細菌バイオフィルム物性&gt; 3Dマッピング

要約

本論文では、細菌バイオフィルムと、その場で界面で微生物によって構築された複雑な生活材料の局所的な機械的特性を測定するための専用の磁気ピンセットの開発に播種磁性粒子の遠隔操作に基づいて、元の方法論を示しています。

要約

インターフェイス上の細菌の付着と成長が3次元不均質な構造、いわゆるバイオフィルムの形成につながる。これらの構造の住居の細胞は、細胞外高分子物質のネットワークが介在する物理的な相互作用によって一緒に保持されている。細菌バイオフィルムは、多くの人間の活動に影響を与え、その性質を理解することは、彼らの開発のより良い制御のために重要である - 保守または根絶 - 彼らの有害または有益な結果に依存。本稿では、今まで、唯一の肉眼的および均質材料の観点から検討、 その場にあったバイオフィルムの局所的な物性を測定することを目指して新たな方法論を説明します。ここに記載された実験は、リモートでバイオフィルムの構造特性を乱すことなく作動させることができるローカルなプローブをシードする成長バイオフィルムに磁性粒子を導入することを含む。専用の磁気ピンセットDEVEたバイオフィルムに埋め込まれた各粒子に定義されている力を発揮するloped。セットアップは、粒子引上げ期間のタイムラプス画像の記録を可能にするために顕微鏡のステージに取り付けられている。粒子軌道はその後引っ張っ配列から抽出され、ローカル粘弾性パラメータは、これにより、パラメータの3次元空間分布を提供し、各粒子変位曲線から誘導される。バイオメカニカルプロファイルに洞察を得ることは、アーキテクチャの特性と、これらの構造の具体的な生物学の間の関係を明確にするために、バイオフィルム制御のためのビューの技術者の視点からだけでなく、根本的な観点から必要不可欠である。

概要

細菌バイオフィルムは、生物学的または人工表面^1-3に関連する細菌の共同体である。彼らは建物^4,5を保護し、安定化多糖類を多く含む細胞外マトリックスの生産と相まって接着成長機構によって構成している。これらのバイオフィルムは、表面に付着した細胞の単に受動的な集合体ではなく、組織化され、動的な複雑な生物系。細菌が浮遊性のバイオフィルムのライフスタイルに切り替えると、遺伝子発現および細胞生理の変化が観察されただけでなく、抗菌剤に対する耐性を増加させ、多くの持続的かつ慢性感染症⁶の原点にあること免疫防御をホストしている。しかし、これらの生活の構造の制御された開発はまた、有害廃棄物処理場のバイオレメディエーション、工業用水やcontaminから土壌·地下水を保護するためのバイオ障壁の形成のバイオろ過などの産業や環境のアプリケーションのための機会を提供ATION。

生活のバイオフィルム方法と特定の分子の機能がますます記載されているが、地域社会の発展と持続性を駆動するメカニズムは不明である。走査型電気化学または蛍光顕微鏡を用いてマイクロスケール測定に関する最近の進歩を用いて、これらの生体組織はかなりの構造的、化学的および生物学的な異質^7を示すこと^が示されている。しかし、今までは、バイオメカニクスは、主にマクロ的に検討されている。例えば、バイオフィルムストリーマの観測は、流体の流量^8,9の変化による変形、バイオフィルム片の一軸圧縮を寒天培地から持ち上げたり、カバーをして^10,11、環境から収集されたバイオフィルムのせん断および並列に転送をスライド上で増殖プレートレオメーター^12,13、AFMカンチレバー¹⁴または専用MICRに付着した細菌バイオフィルムとガラスビーズおよびコーティングを使用した原子間力分光法^15,16は、材料¹⁷の粘弾性の性質に関する有用な情報を提供し、最後の10年間に実施されてきた離脱バイオフィルム断片の引張強度を測定する方法ocantilever。しかしながら、材料はしばしば、これらのアプローチであった場合、その天然の環境から取り出されたとき、その場バイオフィルムの機械的特性の情報が失われる可能性が高いようである。また、均質な材料としてバイオフィルムの治療は、コミュニティ内での物理的性質の可能性のある不均一性に関する情報をミス。したがって、構造バイオフィルム形成における力学とそのような遺伝子発現のパターニングまたは化学的勾配のような生物学的特性の正確な影響はほとんど認められないことができる。バイオフィルムの物理的性質のマイクロスケールの記述に向けて進行し、新たな専用のツールが必要です。

本論文では、達成するために考案さ独創的なアプローチを詳述バイオフィルムを妨害し、マイクロスケールの材料特性の空間分布の描画した後、機械的な不均一性を可能にすることなく、 その場での局所的な機械的パラメータの測定、。実験の原理は、成熟したバイオフィルムの磁気ピンセットを使用してリモートローディングが続く磁性微粒子と成長しているバイオフィルムのドーピングにかかっている。顕微鏡下で画像化され、制御磁気力作用下の粒子変位は、地元の粘弾性パラメータ導出、独自のローカル環境を報告し、各粒子を可能にします。これらのデータから、バイオフィルムの機械的な3Dプロファイルは、空間的および環境条件依存性を明らかにし、引き出すことができる。実験全体を大腸菌にここに表示されます大腸菌バイオフィルムは抑制解除のF様プラスミドを有する遺伝子改変株によって行われた。最近の論文¹⁸に詳細な結果は、無傷のバイオメカニクスの内部のユニークなビジョンを提供します。

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プロトコル

1。細菌培養および懸濁製剤

1. 溶原性ブロス（LB）寒天プレートから新鮮に成長したコロニーを選び、5ミリリットルで100μグラム/ mlのアンピシリンおよび7.5μグラム/ mlのテトラサイクリンを含む液体LB培地をそれに接種し、37℃のオンで​​5〜6時間のためにそれをインキュベート揺れプラットフォーム。
2. その後、最小培地（M63B1）は0.4％グルコースと同じ抗生物質濃度を補っ5ミリリットル中の細菌培養の100μLを追加します。揺れプラットフォーム上で37℃で、この新たに希釈した培養を一晩培養する。
3. インキュベーションの16時間後、5ミリリットルM63B1、0.4％グルコースに一晩培養μlの100を追加します。 0.5 ODに達するまで揺れプラットフォームに37℃でチューブを保管してください。サスペンションは、バイオフィルム形成のための実験チャネルに注入するための準備ができる。

2磁気粒子調製

1. 10μlの磁性粒子を取る -直径2.8μM -在庫から、それらを磁気サンプルラックを用いて190μlの最小培地中で3倍洗う。
2. 5×10 ⁶ビーズ/ mlに粒子濃度を調整します。典型的に洗浄し、ビーズ溶液の50μlを、0.4％グルコースを有するM63B1のさらなる950μリットルと混合される。

3。チャンネルの調製とバイオフィルムの成長

1. チャンネル取り付け
   1. 2長さ8cmの部分を得るために長さ10cm 2の正方形（800μmの辺の長さ）ホウケイ酸ガラスキャピラリーを切った。
   2. 最初の半分にカット- - （SOスーパーグルーと呼ばれる）即効性シアノアクリレート接着剤を使用して、図1のように、どちらかの端に1cmのオーバーハングとは別に2センチメートル2枚のスライドガラス上に2つのキャピラリー部分を接着します。
   3. 全体のセットアップと、さらにチャネル接続に必要な必要なチューブをオートクレーブ。
   4. 下のすべての無菌材料を集める層流フード：I）を搭載し、チャネルとトラップ1、II）、チューブやコネクタ、III）2バブルトラップ - バブルフィルタは一般的に子供の点滴送り（トラップ1）と自家製気泡トラップを保護するために使用大きな直径の長さ4cmの管（トラップ2）のような、iv）のクランプ、v）をM63B1、0.4％グルコース、およびvi）廃液ボトルが充填された30ミリリットルの注射器。
   5. 廃液ボトルにシリンジポンプ、小児バブルフィルタ、自家製の気泡トラップ、キャピラリー（ 図1、パネルB）、チューブによって制御さ50ミリリットルM63B1注射器：次の順序でルアーロックconnectersまたは接合を有する全体のセットアップを接続します。その後、約10ミリリットルの実験の料金よりも高く/時の速度でシリンジポンプの電源を入れる、無菌M63B1、0.4％グルコースをセットアップを埋める。慎重に追跡し、回路内のすべての気泡を除去する。
   6. 10〜15分間システムを介してメディアを流す。同時にセクションからOD 0.5で細菌懸濁液1mlをミックス2.2節で作成洗浄ビーズ溶液1mLで1.3。
   7. 前後の毛細血管：添付します（ただし、閉じないでください）​​2の位置でチューブにクランプします。流れを切ります。
   8. ホーム管は空気流入を防止するために、終了まで保持するように注意しながら、1ミリリットルの注射器を使用して気泡トラップを作った後にキャピラリーに細菌 - ビーズ混合物をご紹介します。チューブを再び取り付けてからクランプを閉じます。
   9. 第2の毛管のために同じ手順を繰り返し、気泡のためのすべてのチューブをご確認ください。
   10. 顕微鏡に装置を転送し、それを解決し、キャピラリーの表面に付着する細菌を可能にするために15〜20分間放置する。わずかに高いレベルでの廃棄物容器に顕微鏡ステージ上に毛細血管をインストールします。顕微鏡の横のカウンターの上にシリンジポンプを配置します。気泡を捕捉する毛管面よりもわずかに高い毛管前に気泡トラップを上昇させる。
2. バイオフィルムグロWTH
   1. シリンジポンプでの流量を調整し、フローを開始し、バイオフィルムは現在、必要な期間の間にキャピラリー表面に発展する - これらの実験では、通常は24または48時間。
   2. キャピラリー底面に焦点を当て、サンプル画像のタイムラプス撮影を開始 - 2画像の通常取得頻度/分を十分にバイオフィルムの成長を報告します。このビデオモニター、バイオフィルムの成長後のコントロール（ ビデオ1、2および3の抽出を参照してください）。

4。磁気ピンセットのインストール

1. 手動で制御のXYZマイクロマニピュレータ上の磁気ピンセットをねじ込み、比較的毛細血管にピンセットの位置を調整する顕微鏡ステージ上でマニピュレーターをねじ込みます。適切な磁場勾配が観察ゾーンにおいて生成されていることを確認するために、図2のようにピンセットを置く。
2. ピンセットをTに接続するO電力増幅器を介してファンクション·ジェネレータは、24秒でゼロ信号及び4の配列を提供する信号同期のための20秒後に明視野光シャッターに送られ、トリガとの直接的な電流の16秒からなる時間の40秒の周期を生成する図3のようなイベント。
   注：これらの2つの操作は、キャピラリーのインストールと測定開始までの任意の時点で達成することができる。 図4の概要スケッチを試して参照してください。

5。クリープ曲線取得

1. 左側の磁極と同じ観察視野内の毛細血管の左端の端を持って来るために顕微鏡ステージのXY移動コントロールを使用します。 （ 図2参照）は、それぞれ、毛細管の端部によって規定されるx軸およびy軸の交点と磁極片の端部で解析参照の起源を取る。
2. ファインフォーカスcを用いてキャピラリーの垂直位置を調整する顕微鏡位置のontrolつまみ。通常、最初に検査面はμ4から7の間メートルキャピラリー底部の上方に位置しています。 ビデオ1は、空間参照の原点にその左上隅を持つXYフィールドに対応しています。
3. ビデオ1の画像取得シーケンスをトリガ手動で、電流発生器に同時に切り替えることにより、セクション4.2および図3に記載されたイベントの40秒シーケンスをトリガする。
4. 左に顕微鏡ステージの250μmの翻訳で隣人右のフィールドに、キャピラリを移動し、スライス2のビデオ2を生成するというように、必要なビデオを得るために、セクション5.3のように動作します。 250×250μm ²の典型的に3〜4のフィールドは平面を変更し、新たな面に対して同じ動作を繰り返す前に、x軸に沿って収集される。

6。フォースキャリブレーション

1. 双方向の蒸留水190μLと2×10 ⁹個/ mlの磁性粒子の10μlのグリセロールの39.8グラムを混合することによってグリセロール溶液を調製し、この混合物を用いて実験的なチャネルを記入し、顕微鏡のステージ上に置きますバイオフィルム試料から調製した。
2. セクション4に示すように、磁気ピンセットをインストールした後、5.4節に示されているように、磁力を適用し、キャリブレーションファイルを導き出すために、毛細管内の各単一粒子速度（V）とその位置を抽出するために、タイムラプス画像を作る。このファイルには、キャピラリの分析ストークスの法則によると、F =6πRηv（：粒子の半径R）のゾーン内の位置の関数として加えられた力が含まれている必要があります。

7。分析

1. セクション5に示すように取得された画像のすべてのスタックの各フレーム内のパーティクルの位置でテキストフ​​ァイルを取得するために「粒子トラッカー」ソフトウェアを使用してください。使うgの画像スタック取得周波数は、時間の関数としての粒子変位（ 例えば、 図5およびビデオ4）を計算する。
2. フォースキャリブレーションファイルを使用して、コンプライアンス曲線に変位曲線を変換する（材料の全コンプライアンス- J（t）は、 -時間の関数として）コンプライアンス式に従って。
   
   これは、材料の歪みとの関係を与え、予めSchnurr及び共同研究者¹⁹によって確立された非圧縮性の、均質な粘弾性媒体に埋め込 ​​まれた半径Rのプローブ粒子のために応力を印加する。
3. 粘弾性材料のための一般的なバーガーモデルにクリープコンプライアンス曲線を調整し、粘弾性パラメータを導出、J _{0、J 1、0η、}各粒子のための_η1（ バーガー'式に基づいて図6）。
   
   注：この現象論的分析は、以前はそのような巨視的なレオロジーデータ^20-22を解釈するバイオフィルムのような生物学的材料を含む広範囲の材料のために採用されている。

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結果

典型的な分析は、元の配置を乱すことなく、生きている生物膜上にミクロンスケールでの粘弾性パラメータの空間分布を提供する。弾性コンプライアンス- -深さに沿っおよびバイオフィルムの横方向寸法に沿ってy軸、z軸の関数として与えられる典型的な結果は、J ₀の値は、図7に示されている。各ポイントは、クリープ曲線分析は、J ₀の値を提供したビーズに対?...

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ディスカッション

この磁性粒子は、播種し、元の状態で成長しているバイオフィルムの粘弾性パラメータをその場で 3Dマッピングで有効になって実験を引っ張って。このアプローチは、Eの機械的な不均一性を明らかにした大腸菌バイオフィルムは、ここで増殖させ、細胞外マトリックスに強く、より正確には架橋の程度の基本的な意味を示唆し、バイオフィルムの物理的特性...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline.
Table 2: Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3 mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	Standard medium used to grow bacteria.
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum medium used to grow bacteria.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose.
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth.
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH - particle tracker plugin