הפעלה של שלט מגנטי של בדיקות מיקרומטר<em&gt; באתר</em&gt; 3D מיפוי של תכונות פיסיקליות biofilm חיידקים

Summary

מאמר זה מציג את המתודולוגיה מקורית המבוססת על actuation מרחוק של חלקיקים מגנטיים זורעים בbiofilm חיידקים וההתפתחות של פינצטה המגנטית ייעודית למדידה באתרו את התכונות מכאניות המקומיות של החומר החי המורכב שנבנה על ידי מיקרו אורגניזמים בממשקים.

Abstract

הידבקות חיידקים וצמיחה בממשקים להוביל להיווצרות של biofilms מבנים הטרוגנית תלת ממדים שנקרא. תאי מגורים במבנים אלה מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות פיזיות מתווכות על ידי רשת של חומרים פולימריים תאיים. biofilms חיידקים להשפיע על פעילות אנושית רבות וההבנה של המאפיינים שלהם היא קריטית לשליטה טובה יותר של ההתפתחות שלהם - תחזוקה או חיסול - תלוי בתוצאה השלילית או חיובית שלהם. מאמר זה מתאר מתודולוגיה חדשנית במטרה למדוד באתרו את התכונות פיזיות המקומיות של biofilm שהיה, עד עכשיו, בדק רק מבחינה חומרית מקרוסקופית והומוגנית. הניסוי המתואר כאן כרוך בהחדרת חלקיקים מגנטיים לbiofilm גדל זרע בדיקות מקומיות שיכול להיות מופעלים מרחוק מבלי להפריע את המאפיינים המבניים של biofilm. פינצטה המגנטית ייעודי היתה developed להפעיל כוח מוגדר על כל חלקיק המוטבע בbiofilm. ההתקנה היא רכוב על הבמה של מיקרוסקופ כדי לאפשר ההקלטה של ​​תמונות של התקופה מושך חלקיקי זמן לשגות. אז מסלולי החלקיקים המחולצים הרצף מושך ופרמטרי viscoelastic המקומיים נגזרים מכל עקומת עקירת חלקיקים, וכך לספק את הפצת 3D-המרחבי של הפרמטרים. השגת תובנות הפרופיל המכני biofilm הוא חיוני מנקודת המבט של מהנדס למטרות בקרת biofilm, אלא גם מנקודת מבט בסיסית כדי להבהיר את הקשר בין המאפיינים האדריכליים והביולוגיה הספציפית של מבנים אלה.

Introduction

biofilms חיידקים הם קהילות של חיידקים הקשורים למשטחים ביולוגיים או מלאכותיים ^1-3. הם יוצרים על ידי מנגנון הידבקות צמיחה בשילוב עם הייצור של תאי מטריקס פוליסכריד עשיר שמגן ומייצב את המבנה ^4,5. biofilms אלה אינם מכלולים פשוט פסיביים של תאים נדבקו למשטחים, אבל מאורגן ומערכות ביולוגיות מורכבות דינמיות. כאשר חיידקים לעבור מפלנקטון לאורח החיים biofilm, שינויים בביטוי גנים ופיזיולוגיה של תאים הם נצפו, כמו גם התנגדות מוגברת לantimicrobials ולארח הגנה חיסונית להיות במקור של זיהומים מתמשכים וכרוניים רבים ^6. עם זאת, הפיתוח המבוקר של מבני חיים אלה מציעים גם הזדמנויות ליישומים תעשייתיים וסביבתיים, כגון bioremediation של אתרי פסולת מסוכנים, ביו סינון של מים או היווצרות של ביו מחסומים כדי להגן על קרקע ומי תהום מcontamin תעשייתייםation.

בעוד תכונות מולקולריות ספציפיות לדרך biofilm החיים מתוארות יותר ויותר, את המנגנונים המניעים את התפתחות הקהילה והתמדה עדיין אינם ברורים. שימוש בהתקדמות שחלה באחרונה במדידות microscale באמצעות אלקטרוכימיים סריקה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ארגוני חיים אלה הוכחו תערוכה ניכרת מבני, כימי וביולוגית ההטרוגניות ^7. עם זאת, עד עכשיו, מכניקת biofilm נבדק בעיקר macroscopically. למשל, התבוננות בסרטי biofilm עיוות עקב שינויים בשיעורי זרימת נוזל ^8,9, דחיסת uniaxial של חתיכות biofilm להרים ממדיום אגר או גדלה על הכיסוי מחליק ^10,11, גזירה של biofilm שנאסף מהסביבה ולאחר מכן הועבר למקביל rheometer צלחת ^12,13, ספקטרוסקופיה כוח אטומי באמצעות חרוז זכוכית ומצופה עם biofilm חיידקים מצורפים AFM שלוחה ¹⁴ או MICR ייעודישיטת ocantilever למדידת חוזק המתיחה של שברי biofilm מנותקים ^15,16 יושמו במהלך עשר השנים האחרונות, ומספקת מידע שימושי על טבע viscoelastic של החומר ^17. עם זאת, סביר להניח שמידע על תכונות מכאניות biofilm אתרו הולך לאיבוד כאשר החומר מוסר מהסביבה המקורית שלו, שהייתה קורים לעתים קרובות בגישות אלה. יתר על כן, הטיפול של biofilm כחומר הומוגני מחמיץ את המידע על ההטרוגניות האפשרית של התכונות פיזיות בקהילה. לכן, ההשלכות של מכניקת המבנה בהיווצרות biofilm ותכונות ביולוגיות כגון דפוסים ביטוי גנים או הדרגתיים כימי המדויקות בקושי יכולות להיות מוכרות. כדי להתקדם לכיוון תיאור microscale של התכונות פיזיות biofilm, כלים ייעודיים חדשים נדרשים.

מאמר זה מפרט את הגישה מקורית יזום כדי להשיגמדידה של פרמטרים מקומיים מכאניים באתר, מבלי להפריע את biofilm ומאפשר ציור של הפריסה המרחבית של תכונות חומר microscale ולאחר מכן ההטרוגניות מכאנית. העיקרון של הניסוי נשען על הסימום של biofilm גדל עם microparticles המגנטי ואחרי הטעינה מרחוק שלהם באמצעות פינצטה מגנטית בbiofilm הבוגר. עקירת חלקיקים תחת יישום כוח מגנטי מבוקר צילם מתחת למיקרוסקופ מאפשרת גזירת פרמטר viscoelastic מקומית, כל חלקיק דיווח הסביבה המקומית משלה. מתוך נתונים אלה, הפרופיל המכני 3D של biofilm ניתן להסיק, חושף dependences מצב מרחבית וסביבתי. כל הניסוי תוכלו לראות כאן על E. biofilm coli שנעשה על ידי זן מהונדס גנטי נושא פלסמיד כמו F-derepressed. התוצאות מפורטות במאמר האחרון ¹⁸ מספקות חזון ייחודי של הפנים של מכניקת biofilm ללא פגע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. חיידקי תרבות והכנת השעיה

1. פיק מושבה גדלה טרי מצלחת אגר Lysogeny מרק (LB), לחסן אותו ב 5 מיליליטר מדיום LB נוזלי המכיל 100 גר '/ מיליליטר אמפיצילין μ ו7.5 גר' / מיליליטר טטרציקלין μ ודגירה אותו במשך 5 עד 6 שעות ב 37 ° C ב רועד פלטפורמה.
2. לאחר מכן, להוסיף 100 l μ של תרבות החיידקים ב5 מיליליטר בינוני מינימום (M63B1) בתוספת גלוקוז 0.4% ואותם ריכוזי האנטיביוטיקה. דגירה לילה תרבות טרי בדילול זה על 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה רועדת.
3. לאחר 16 שעות של דגירה, להוסיף 100 μl תרבות הלילה עד 5 מיליליטר M63B1, גלוקוז 0.4%. שמור את הצינור על 37 C ° לפלטפורמה הרועדת עד 0.5 OD הוא הגיע. ההשעיה היא אז מוכנה להזרקה לתוך תעלת הניסוי ליצירת biofilm.

2. הכנת חלקיקים מגנטית

1. קח 10 חלקיקים מגנטיים μl -2.8 μ מ 'קוטר - מהמניות ולשטוף אותם פי 3 ב190 בינוני מינימום μl בעזרת מתלה מדגם מגנטי.
2. התאם את ריכוז חלקיקים ל5 x 10 ⁶ מיליליטר / חרוזים. בדרך כלל 50 μl של הפתרון חרוז שטף מעורבב עם l 950 μ נוסף של M63B1 עם גלוקוז 0.4%.

3. ערוץ הכנה וBiofilm צמיחה

1. השמה ערוץ
   1. חותך שתי נימי הזכוכית בורוסיליקט מרובעות (800 מ μ אורך צד) 10 סנטימטר ארוכה כדי להשיג חתיכות ארוכות שני 8 סנטימטר.
   2. מדביקים את שני חתיכות נימים בשתי שקופיות זכוכית - לחתוך במחצית ראשונה - מלבד 2 סנטימטר עם הסככה 1 סנטימטר בכל צד כמו באיור 1 באמצעות דבק הפועל במהירות cyanoacrylate (מה שנקרא סופר דבק).
   3. החיטוי וההתקנה כל צינורות הנדרשים לחיבור ערוץ נוסף.
   4. אסוף את כל החומרים סטריליים תחתזרימה למינרית: i) את הערוץ ומלכודת 1 הרכובים, ii) צינורות ומחברים, iii) שתי מלכודות בועה - מסנן הבועה נפוץ המשמש לאבטחה של ילדי האכלת טפטוף (מלכודת 1) ואת מלכודת בועת תוצרת הבית כצינור ארוך 4 סנטימטר בקוטר גדול יותר (מלכודת 2), ד) מהדק, v) 30 מיליליטר מזרקים מלאים בM63B1, גלוקוז 0.4%, וצמי) בקבוק פסולת.
   5. חברו את כל ההתקנה עם connecters Luer נעילה או צמתים לפי הסדר הבא: 50 מיליליטר נשלט על ידי משאבת המזרק, מסנן בועת ילדים, מלכודת בועת תוצרת בית, נימים (איור 1, לוח ב '), והצינור לבקבוק פסולת M63B1 המזרק. ואז למלא את ההתקנה עם M63B1 סטרילי, גלוקוז 0.4%, הפעלת משאבת המזרק בשיעור של כ -10 מיליליטר / שעה, גבוהה יותר מהשיעורים הניסיוניים. לעקוב בזהירות ולחסל את כל הבועות במעגל.
   6. זרימה בינונית באמצעות מערכת ל10-15 דקות; במקביל לערבב 1 מיליליטר של ההשעיה החיידקים ב0.5 OD מסעיף1.3 עם 1 מיליליטר של הפתרון חרוז שטף הכין בסעיף 2.2.
   7. צרף (אבל לא לסגור) מהדק לצינורות בשתי עמדות: לפני ואחרי את נימי הדם. לעבור את הזרימה כבויה.
   8. להציג את תערובת חיידקי החרוז לתוך הנימים לאחר מלכודת בועת תוצרת הבית באמצעות מזרק 1 מיליליטר, מקפיד להחזיק את הצינור מסתיים למניעת כניסת אוויר. לצרף מחדש את הצינור ולאחר מכן לסגור את מהדק.
   9. חזור על אותו ההליך לנימים השניה וסמן את כל הצינורות לבועות.
   10. העבר את המכשיר למיקרוסקופ ולאפשר לו לעמוד על 15-20 דקות כדי לאפשר לחיידקים להתיישב ולצרף אל פני השטח של הנימים. התקן את הנימים לבמה מיקרוסקופ עם מיכל הפסולת ברמה מעט גבוהה יותר. מקם את משאבת המזרק על גבי הדלפק ליד מיקרוסקופ. לרומם את מלכודת הבועה לפני הנימים מעט גבוהות יותר ממטוס הנימים ללכוד בועות.
2. Biofilm Growth
   1. התאם את קצב הזרימה במשאבת המזרק ולהתחיל את הזרימה, biofilm כעת לפתח על פני השטח הנימים במהלך התקופה הנדרשת - בדרך כלל 24 או 48 שעות בניסויים אלה.
   2. פוקוס על המטוס התחתון הנימים ולהתחיל את הקלטת הזמן לשגות של התמונות לדוגמא - בדרך כלל בתדירות רכישה של 2 תמונות / דקה תהיה מספק לדווח על צמיחת biofilm. צגי וידאו biofilm פוסט שליטה זו צמיחה (ראה תמציות בוידאו 1, 2 ו -3).

4. התקנה מלקטת מגנטי

1. בורג פינצטה המגנטית על micromanipulators XYZ נשלט באופן ידני ולדפוק את micromanipulators על הבמה מיקרוסקופ כדי להתאים את המיקום של פינצטה יחסית לנימים. הנח את פינצטה כמו באיור 2 כדי להבטיח את שיפוע השדה מגנטי המתאים מופק באזור התצפית.
2. חבר את t פינצטהo גנרטור הפונקציה באמצעות מגבר הכוח כדי ליצור תקופת 40 שניות של זמן עשויה 24 שניות אפס אות ו16 שניות של 4 נוכחית ישיר עם הדק נשלח לבהיר תריס אור השדה לאחר 20 שניות לסנכרון אות מתן רצף של אירועים כמו באיור 3.
   הערה: ניתן להשיג את שתי פעולות אלו בכל עת בין התקנת נימים ותחילת מדידה. ראה להתנסות סקיצה סקירה באיור 4.

5. הזחילה Curve רכישה

1. השתמש בבקרת תנועת XY של הבמה מיקרוסקופ כדי להביא את הקצה של הקוטב המגנטי השמאלי והשמאלי הקצה של הנימים באותו תחום התצפית. קח את המקור של הקשרים הניתוח בצומת של ה-X וה-Y צירים שהוגדרו על ידי הקצה של הנימים וקצה חתיכת המוט, בהתאמה (ראה איור 2).
2. התאם את המיקום האנכי של הנימים באמצעות קנס ג פוקוסידית ontrol של עמדת מיקרוסקופ. בדרך כלל בדק את המטוס הראשון ממוקם בין 4 עד 7 μ מ 'מעל תחתית הנימים. 1 הווידאו מתאים לשדה XY שיש לו הפינה השמאלית העליונה שלה במקור של הקשרים מרחביים.
3. לעורר את רצף 40 שניות של אירועים שתוארו בסעיף 4.2 ואיור 3 על ידי מעבר על הגנרטור הנוכחי ובה בעת, לעורר באופן ידני את רצף רכישת תמונה של 1 וידאו.
4. הזז את הנימים לשדה הימני השכן על ידי תרגום μ מ '250 של הבמה מיקרוסקופ לשמאל ולפעול כאמורים בסעיף 5.3 ליצור וידאו 2 של פרוסה 2 וכן הלאה כדי להשיג את קטעי הווידאו הנדרשים. 3 עד 4 בדרך כלל תחומי 250 x 250 μ מ ² נאספים לאורך ציר ה-x לפני שינוי המטוס וחוזר על אותן פעולות עבור המטוס החדש.

6. חיל כיול

1. הכן פתרון גליצרול על ידי ערבוב 39.8 גרם של גליצרול עם 190 μ ליטר של מים מזוקקים ודו 10 μl של חלקיקים מגנטיים ב2 x 10 ⁹ מיליליטר / חלקיקים ולמלא את הערוץ ניסיוני בתערובת זו ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ כפי שתואר למדגם biofilm.
2. לאחר התקנת פינצטה המגנטית כאמור בסעיף 4, החל את הכוח המגנטי כאמור בסעיף 5.4 ולהפוך את הזמן לשגות תמונות כדי לחלץ כל חלקיק וחלקיק מהירות (V) ואת עמדתה בנימים כדי להפיק את קובץ הכיול. קובץ זה צריך להכיל את הכוח ליישם כפונקציה של מיקומו באזור של ניתוח של הנימים על פי חוק סטוקס, F = 6πRηv (R: רדיוס של החלקיקים).

7. ניתוח

1. השתמש בתוכנת "חלקיק גשש" לקבל קבצי טקסט עם עמדות חלקיקים בכל מסגרת לכל הערימות של תמונות שנרכשו כאמור בסעיף 5. מנצלg את תדירות רכישת מחסנית התמונה, לחשב את תזוזת החלקיק כפונקציה של זמן (למשל איור 5 ו -4 וידאו).
2. שימוש בקובץ כוח הכיול, להמיר את עקומות עקירה לעקומות ציות (תאימות כוללת של החומר - J (t) - כפונקציה של זמן) על פי נוסחת העמידה:
   
   אשר נותן את היחס בין מאמץ חומר ויישם מתח לחלקיקי בדיקה של R הרדיוס מוטבע במדיום viscoelastic בלתי דחיס, הומוגנית כפי שנקבעו בעבר על ידי Schnurr ועמיתים לעבודה ^19.
3. התאם את עקומות ציות השרץ למודל בורגרס הכללי לחומרי viscoelastic ולגזור את הפרמטרים viscoelastic, J _{0, 1} J, η _0, η ₁ עבור כל חלקיק ( איור 6) על פי הנוסחה 'בורגרס:
   
   הערה: ניתוח הפנומנולוגית זה כבר הועסק בעבר למגוון רחב של חומרים, כולל חומרים ביולוגיים כגון biofilms לפרש נתונים rheology מקרוסקופית ^20-22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ניתוח טיפוסי יספק את הפריסה המרחבית של הפרמטרים viscoelastic בקנה מידת מיקרון בbiofilm חיים מבלי להפריע להסדר המקורי שלה. תוצאות אופייניות מוצגות באיור 7 שבו הערכים של ₀ J - ציות האלסטיות - מקבלים כפונקציה של Z-הציר לאורך העומק ושל ציר ה-Y לאורך ממד רוחב של biofilm. כל נ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

חלקיקים מגנטיים זה זריעה ומושכים ניסוי אפשר במיפוי 3D באתרו של הפרמטרים viscoelastic של biofilm גובר במצבו המקורי. גישה זו חשפה את ההטרוגניות מכאנית של א ' biofilm coli גדל כאן ונתן רמזים להצביע על רכיבי biofilm תמיכה בתכונות פיזיות biofilm, חזק המצביעים על משמעות בסיס?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline.
Table 2: Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3 mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	Standard medium used to grow bacteria.
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum medium used to grow bacteria.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose.
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth.
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH - particle tracker plugin