Azionamento a distanza magnetica micrometrici Sonde per<em&gt; In situ</em&gt; Mappatura 3D di biofilm batterici Proprietà fisiche

Riepilogo

Questo documento mostra un metodo originale basato sul comando a distanza di particelle magnetiche seminate in un biofilm batterico e lo sviluppo di pinzette magnetiche dedicate per misurare in situ le proprietà meccaniche locali del materiale vivente complesso costruito dai microrganismi alle interfacce.

Abstract

Adesione batterica e crescita su interfacce portano alla formazione di strutture tridimensionali eterogenei cosiddetti biofilm. Le cellule vive in queste strutture sono tenute insieme da interazioni fisiche mediate da una rete di sostanze polimeriche extracellulari. Biofilm batterici impatto molte attività umane e la comprensione delle loro proprietà è fondamentale per un migliore controllo del loro sviluppo - mantenimento o l'eradicazione - a seconda del loro esito avverso o benefico. Questo documento descrive una nuova metodologia che mira a misurare in situ le proprietà fisiche locali del biofilm che era stato finora esaminato solo dal punto di vista macroscopico e materiale omogeneo. L'esperimento qui descritto comporta l'introduzione di particelle magnetiche in un biofilm cresce a seme sonde locali che possono essere azionati a distanza senza disturbare le proprietà strutturali del biofilm. Pinzette magnetiche dedicati sono stati svipato per esercitare una forza definita su ciascuna particella incorporato nel biofilm. La configurazione è montato sulla scena di un microscopio per consentire la registrazione di immagini intervallati di periodo particella tirando. Le traiettorie delle particelle vengono estratti dalla sequenza e tirando i parametri viscoelastici locali sono derivati ​​da ciascuna curva spostamento particella, fornendo così la distribuzione 3D-spaziale dei parametri. Acquisendo informazioni sul profilo meccanico biofilm è essenziale dal punto di vista di un ingegnere per scopi di controllo biofilm ma anche dal punto di vista fondamentale per chiarire la relazione tra le proprietà architettoniche e la biologia specifica di queste strutture.

Introduzione

Biofilm batterici sono comunità di batteri associati con superfici biologiche o artificiali ^1-3. Essi formano da un meccanismo di adesione crescita accoppiato con la produzione di matrice extracellulare ricca di polisaccaride che protegge e stabilizza l'edificio ^4,5. Questi biofilm non sono assemblaggi semplicemente passivi di cellule attaccati alle superfici, ma organizzati e complessi sistemi biologici dinamici. Quando i batteri passano da planctoniche allo stile di vita biofilm, cambiamenti nell'espressione genica e fisiologia cellulare sono stati osservati, nonché una maggiore resistenza agli antimicrobici e ospitare le difese immunitarie essere all'origine di molte infezioni persistenti e croniche ^6. Tuttavia, lo sviluppo controllato di queste strutture viventi offrono anche opportunità per applicazioni industriali e ambientali, come biorisanamento dei siti di rifiuti pericolosi, bio-filtrazione di acqua industriale o formazione di bio-barriere per la protezione del suolo e delle acque sotterranee da Contaminzione.

Mentre caratteristiche molecolari specifiche per modo biofilm della vita sono sempre descritti, i meccanismi che guidano lo sviluppo della comunità e la persistenza rimangono poco chiari. Usando i recenti progressi sulle misurazioni microscala utilizzando elettrochimica scansione o microscopia a fluorescenza, questi organismi viventi hanno dimostrato di presentare una notevole strutturale, chimica e biologica eterogeneità ^7. Tuttavia, fino ad ora, meccanica biofilm sono state principalmente esaminati macroscopicamente. Ad esempio, l'osservazione di stelle filanti biofilm deformazioni dovute a variazioni dei tassi di flusso del fluido ^8,9, compressione monoassiale di pezzi biofilm risalita dal terreno di agar o coltivate sul coperchio scorre ^10,11, taglio del biofilm raccolti dall'ambiente e poi trasferito in un parallelo Piastra reometro ^12,13, spettroscopia a forza atomica con una perla di vetro e rivestito con un biofilm batterico collegato a un cantilever AFM ¹⁴ o MICR dedicatoocantilever metodo per misurare la resistenza alla trazione di frammenti biofilm staccati ^15,16 sono state attuate negli ultimi dieci anni, fornendo informazioni utili sulla natura viscoelastica del materiale ^17. Tuttavia, sembra probabile che le informazioni sul biofilm in situ proprietà meccaniche è perso quando il materiale viene rimosso dal suo ambiente nativo, che è spesso il caso in questi approcci. Inoltre, il trattamento del biofilm come materiale omogeneo trova la informazioni sulla possibile eterogeneità delle proprietà fisiche all'interno della comunità. Pertanto, le esatte implicazioni della meccanica della struttura nella formazione di biofilm e le caratteristiche biologiche come l'espressione genica patterning o gradienti chimici possono difficilmente essere riconosciuti. Per progredire verso una descrizione microscala dei biofilm proprietà fisiche, sono necessari nuovi strumenti dedicati.

Dettagli Questo documento un approccio originale concepito per raggiungeremisurazione dei parametri meccanici locali in situ, senza disturbare il biofilm e consentendo disegno della distribuzione spaziale delle proprietà del materiale microscala e poi l'eterogeneità meccanica. Il principio dell'esperimento poggia sul drogaggio di un biofilm cresce con microparticelle magnetiche seguita dalla loro carico a distanza usando pinzette magnetiche nel biofilm maturo. Spostamento delle particelle in applicazione della forza magnetica controllata ripreso sotto il microscopio permette locale derivazione parametro viscoelastico, ogni particella di reporting proprio ambiente locale. Da questi dati, il profilo meccanica 3D del biofilm può essere disegnato, rivelando territoriali e ambientali condizione dipendenze. L'intero esperimento verrà mostrato qui su E. biofilm coli fatta da un ceppo geneticamente modificato che trasporta una derepressi plasmide F-like. I risultati dettagliati in un recente articolo ¹⁸ forniscono una visione unica degli interni della meccanica biofilm intatti.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Batteri, Cultura e sospensione Preparazione

1. Scegliere la colonia appena cresciuta da una piastra di agar lisogenia Broth (LB), inoculare in 5 ml di terreno LB liquido contenente 100 μ g / ml ampicillina e 7,5 μ g / ml di tetraciclina e incubare per 5 a 6 ore a 37 ° C su una piattaforma di agitazione.
2. Poi, aggiungere 100 μ l di coltura batterica in 5 ml di terreno minimo (M63B1) supplementato con 0,4% di glucosio e le stesse concentrazioni di antibiotico. Incubare questa coltura durante la notte appena diluito a 37 ° C su una piattaforma di agitazione.
3. Dopo 16 ore di incubazione, aggiungere 100 microlitri della cultura durante la notte per 5 ml M63B1, 0,4% di glucosio. Mantenere il tubo a 37 ° C per la piattaforma di agitazione fino a 0,5 OD è raggiunto. La sospensione è quindi pronto per l'iniezione nel canale esperimento per la formazione di biofilm.

2. Preparazione particelle magnetiche

1. Prendere 10 particelle magnetiche microlitri -2,8 μ m di diametro - dal magazzino e lavarli 3x in 190 microlitri terreno minimo con l'aiuto di un rack campioni magnetico.
2. Regolare la concentrazione di particelle a 5 x 10 ⁶ perline / ml. Tipicamente 50 microlitri della soluzione di sfere lavato viene miscelato con un ulteriore 950 μ l di M63B1 con 0,4% di glucosio.

Preparazione Canale 3. Biofilm e crescita

1. Montaggio del canale
   1. Tagliate due quadrati (800 μ m di lunghezza per lato) capillari in vetro borosilicato lunghi 10 centimetri avere due lunghi otto centimetri pezzi.
   2. Incollate i due pezzi capillari su due vetrini - tagliate a metà prima - 2 cm di distanza con 1 centimetro sbalzo su entrambe le estremità come in figura 1 utilizzando un collante cianoacrilato ad azione rapida (la cosiddetta super-colla).
   3. Sterilizzare l'intera configurazione e il tubo richieste per un ulteriore canale di connessione.
   4. Raccogliere tutti i materiali sterili sottouna cappa a flusso laminare: i) il canale montato e trappola 1, ii) il tubo e connettori, iii) le due trappole per bolle - filtro bolla comunemente usato per fissare bambini-gocciolamento alimentazione (trappola 1) e la bolla trappola fatta in casa come 4 cm tubo di diametro maggiore (trap 2), iv) morsetti, v) 30 ml siringhe riempito con M63B1, 0,4% di glucosio, e vi) la bottiglia degli scarti.
   5. Collegare l'intero setup con connettori Luer Lock o giunzioni nel seguente ordine: 50 ml M63B1 siringa controllata dalla pompa a siringa, il filtro bolla pediatrica, trappola per bolle in casa, capillare (Figura 1, pannello B), e il tubo per la bottiglia degli scarti. Poi riempire il setup con M63B1 sterile, 0,4% di glucosio, accendendo la pompa a siringa ad una velocità di circa 10 ml / h, superiore ai tassi sperimentali. Monitorare con attenzione ed eliminare tutte le bolle nel circuito.
   6. Fluire il mezzo attraverso il sistema per 10-15 minuti; mescolare contemporaneamente 1 ml di sospensione batteri a OD 0.5 dalla sezione1.3 con 1 ml di soluzione tallone lavato preparata nella sezione 2.2.
   7. Attaccare (ma non chiudere) morsetti per il tubo in due posizioni: prima e dopo i capillari. Spegnere il flusso.
   8. Introdurre la miscela batterico-tallone nel capillare dopo il gorgogliatore fatto in casa utilizzando una siringa da 1 ml, avendo cura di tenere il tubo finisce per impedire l'entrata di aria. Ricollegare il tubo e chiudere i morsetti.
   9. Ripetere la stessa procedura per il secondo capillare e visualizzate tutte le provette per bolle.
   10. Trasferire l'apparecchio al microscopio e lasciare riposare per 15-20 minuti per consentire ai batteri di insediarsi e attaccare alla superficie del capillare. Installare il capillare sul palco microscopio con il contenitore di rifiuti ad un livello leggermente superiore. Posizionare la pompa a siringa sul piano di lavoro accanto al microscopio. Elevare il gorgogliatore prima del capillare leggermente superiore rispetto al piano capillare per catturare bolle.
2. Biofilm Growth
   1. Regolare la portata della pompa siringa e avviare il flusso, il biofilm ora svilupparsi sulla superficie capillare nel periodo necessario - di solito 24 o 48 ore in questi esperimenti.
   2. Focus sul piano di base capillare e avviare la registrazione time-lapse delle immagini di esempio - di solito una frequenza di acquisizione di 2 immagini / min adeguatamente segnalare la crescita biofilm. Questo monitor video biofilm crescita post-controllo (vedi estratti in Video 1, 2 e 3).

4. Pinzette magnetiche installazione

1. Avvitare le pinzette magnetiche sulla micromanipolatori XYZ controllati manualmente e avvitare i micromanipolatori sul palco microscopio per regolare la posizione delle pinzette relativamente al capillare. Collocare le pinzette come in Figura 2 per garantire l'adeguato gradiente di campo magnetico è generato nella zona di osservazione.
2. Collegare le pinzette to il generatore di funzioni tramite l'amplificatore di potenza per generare un periodo di 40 secondi di tempo in 24 sec segnale zero e 16 sec di 4 A corrente continua con un trigger inviato al campo luminoso luce otturatore dopo 20 sec per la sincronizzazione del segnale fornire una sequenza di eventi come in Figura 3.
   Nota: Queste due operazioni possono essere realizzati in qualsiasi momento tra installazione capillare e misurazione inizio. Vedere esperimento schizzo panoramica nella Figura 4.

5. Creep Curve di acquisizione

1. Utilizzare il controllo del movimento xy al palco microscopio a portare il bordo del polo magnetico sinistro e il bordo sinistro del capillare nello stesso campo di osservazione. Prendere l'origine del referenziale analisi all'incrocio tra xey assi definiti dal bordo del capillare e il bordo del polo, rispettivamente (vedere la Figura 2).
2. Regolare la posizione verticale del capillare con messa a fuoco fine cmanopola ontrol della posizione microscopio. Aereo genere il primo esame si trova tra 4 a 7 μ m sopra il fondo capillare. Video 1 corrisponde al campo xy che ha il suo angolo superiore sinistro all'origine della referenziale spaziale.
3. Innescare la sequenza 40 sec di eventi descritti nel paragrafo 4.2 e Figura 3 accendendo il generatore di corrente e, allo stesso tempo, attivare manualmente l'immagine sequenza di acquisizione video 1.
4. Spostare il capillare nel campo destro vicino da un μ m traduzione 250 del palco microscopio a fianco e operare come al punto 5.3 per generare Video 2 di fetta 2 e così via per ottenere i video richiesti. Tipicamente 3 a 4 campi di 250 x 250 μ m ² sono raccolti lungo l'asse x prima del cambio di aereo e ripetendo le stesse operazioni per il nuovo piano.

6. Calibrazione Forza

1. Preparare una soluzione di glicerolo mescolando 39,8 g di glicerolo con 190 μ l di acqua bi-distillata e 10 ml di particelle magnetiche in un 2 x 10 ⁹ particelle / ml e riempire un canale sperimentale con questo composto e mettetelo sul palco microscopio come descritto per il campione biofilm.
2. Dopo aver installato le pinzette magnetiche come indicato al punto 4, applicare la forza magnetica come indicato nella sezione 5.4 e creare immagini time-lapse per estrarre ogni velocità della particella singola (v) e la sua posizione nel capillare per ricavare il file di calibrazione. Questo file deve contenere la forza applicata in funzione della sua posizione nella zona di analisi del capillare secondo la legge di Stokes, F = 6πRηv (R: raggio della particella).

7. Analisi

1. Utilizzare un software "particella tracker" per ottenere i file di testo con le posizioni delle particelle in ogni fotogramma per tutte le pile di immagini acquisite, come indicato al punto 5. Uso dig dell'immagine frequenza di acquisizione pila, calcolare lo spostamento delle particelle in funzione del tempo (ad esempio la figura 5 e Video 4).
2. Utilizzo del file di calibrazione forza, convertire le curve spostamento a curve compliance (conformità totale del materiale - J (t) - in funzione del tempo) secondo la formula conformità:
   
   che dà il rapporto tra deformazione del materiale e lo stress applicare una particella sonda di raggio R incorporato in un, mezzo viscoelastico omogeneo incomprimibile come precedentemente stabilito dal Schnurr e collaboratori ^19.
3. Regolare le curve di conformità scorrimento al Burgers modello generale per i materiali viscoelastici e ricavare i parametri viscoelastici, J _0, J _1, η _0, η ₁ per ogni particella ( Figura 6) secondo la formula dei Burgers:
   
   Nota: Questa analisi fenomenologica è già stato impiegato per una vasta gamma di materiali, tra cui materiali biologici come il biofilm per interpretare i dati reologici macroscopici ^20-22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Un'analisi tipica fornirà la distribuzione spaziale dei parametri viscoelastici in scala micron su un biofilm vivere senza disturbare l'arrangiamento originale. I risultati tipici sono mostrati in figura 7 dove i valori di J ₀ - la cedevolezza elastica - sono date in funzione del l'asse z lungo la profondità e l'asse y lungo una dimensione laterale del biofilm. Ogni punto corrisponde a una sfera che l'analisi della curva di creep ha fornito un valore di J _0. I...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Questa particella magnetica semina e tirando attivato in situ mappatura 3D dei parametri viscoelastici di un biofilm cresce nel suo stato originale esperimento. Questo approccio ha rivelato l'eterogeneità meccanica del E. coli biofilm cresciuto qui e ha dato indizi per precisare le componenti del biofilm che sostengono i biofilm proprietà fisiche, suggerendo fortemente una implicazione fondamentale della matrice extracellulare e più precisamente il grado di reticolazione.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline.
Table 2: Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1 mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3 mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	Standard medium used to grow bacteria.
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum medium used to grow bacteria.
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose.
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth.
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH - particle tracker plugin