الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Summary

وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. يوفر هذا البروتوكول خطوات تفصيلية حول كيفية استخدام النظام لمجموعة واسعة من التطبيقات.

Abstract

وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. وقد أظهرت هذه التقنية في معالجة التطبيقات المحتملة صعبة سابقا؛ بما في ذلك، والتسليم إلى الخلايا الأولية المناعي، وإعادة برمجة الخلية، وأنابيب الكربون، والكم نقطة التسليم. تعتمد هذه المنصة خالية من ناقلات ميكروفلويديك على اضطراب الميكانيكية للغشاء الخلية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من المواد المستهدفة. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لاستخدام لهذه الأجهزة ميكروفلويديك بما في ذلك، والتجمع الجهاز، وإعداد الخلايا، وتشغيل النظام. هذا النهج يتطلب التسليم الأمثل موجزة عن نوع الجهاز وظروف التشغيل للتطبيقات يبلغ عنها سابقا. الإرشادات المتوفرة هي تعميم لمعظم أنواع الخلايا والمواد التسليم وهذا النظام لا يتطلب مخازن المتخصصة أو خطوات التعديل الكيميائي / الاقتران. هذا العمل كما توفرق توصيات بشأن كيفية تحسين أداء الجهاز والمتاعب اطلاق النار على المشاكل المحتملة المتعلقة انسداد، الكفاءة تسليم منخفضة، وبقاء الخلية.

Introduction

تسليم الجزيئات إلى السيتوبلازم الخلية هو خطوة حاسمة في التطبيقات العلاجية والبحوث. جسيمات متناهية الصغر بوساطة التسليم، على سبيل المثال، أظهرت المحتملة في العلاج الجيني ^1،2، بينما التسليم البروتين هو وسيلة واعدة لتؤثر على وظيفة الخلوية في كل من السريرية والمختبرية ^{3 4} الإعدادات. غيرها من المواد، مثل المخدرات جزيء صغير، نقاط الكم، أو جزيئات الذهب، هي ذات فائدة في تطبيقات تتراوح بين علاجات السرطان ^5،6 إلى ^7،8 وضع العلامات داخل الخلايا، وجزيء واحد تتبع ^9.

غشاء الخلية غير منفذ إلى حد كبير الجزيئات. العديد من التقنيات القائمة استخدام الجسيمات النانوية البوليمرية ^{10،11، 12} الجسيمات الشحمية، أو التعديلات الكيميائية ¹³ لتسهيل اضطراب الغشاء أو تسليم endocytotic. في هذه الأساليب، وكفاءة التسليم وخلية حيوية تعتمد غالبا على هيكل اله الجزيء المستهدف ونوع من الخلايا. ويمكن لهذه الأساليب أن تكون فعالة في إيصال المواد موحد هيكليا، مثل الأحماض النووية، ولكن في كثير من الأحيان غير ملائمة لإيصال أكثر تنوعا من الناحية الهيكلية المواد، مثل البروتينات والمواد النانوية ^{14،15 7.} وعلاوة على ذلك، فإن آلية تعطيل جسيم داخلي أن معظم هذه الطرق تعتمد على كثير من الأحيان غير فعالة، وبالتالي ترك الكثير من المواد المحاصرين في الهياكل حويصلة ^16. أخيرا، الأساليب التي غالبا ما يتم تطويرها للاستخدام مع خطوط الخلايا التي أنشئت لا تترجم بشكل جيد إلى الخلايا الأولية.

طرق غشاء poration، مثل التثقيب الكهربائي ^17،18 وsonoporation ^19، وبديلا جذابا في بعض التطبيقات، ولكن من المعروف أنها تسبب انخفاض بقاء الخلية، ويمكن أن تكون محدودة من قبل المسؤول عن تسليم المواد المستهدفة.

تشوه الميكانيكية السريع للخلايا، واتباع نهج ميكروفلويديك إلى التسليم، في الآونة الأخيرة demonstrated مزاياه أكثر التقنيات الحالية في سياق إعادة برمجة الخلية ²⁰ وتسليم المواد متناهية الصغر ^21. يعتمد هذا الأسلوب على تعطيل الميكانيكية س غشاء الخلية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من المواد الموجودة في المخزن المؤقت المحيطة بها. وقد أثبت نظام تمكين المحتملة في تحدي سابقا أنواع الخلايا (مثل الخلايا المناعية الأولية والخلايا الجذعية) والمواد (مثل الأجسام المضادة وأنابيب الكربون النانوية). هنا، يتم وصف الإجراء عامة لاستخدام هذه الأجهزة للتسليم داخل الخلايا من الجزيئات المستهدفة. هذا الإجراء هو تعميم لمعظم أنواع الخلايا والمواد التسليم، ومع ذلك، فمن المستحسن أن أحد إجراء التحسين وجيزة من الظروف، كما هو مفصل في المبادئ التوجيهية لدينا تصميم ذكرت سابقا ^20، لأي طلبات غير المبلغ عنها سابقا. حتى الآن، تم استخدام النظام بنجاح لإيصال الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، وجزيئات الذهب، نقاط الكم، أنابيب الكربون النانوية، والبروتينق، والبوليمرات ديكستران ^20،21.

Protocol

1. تخزين

1. تخزين خزانات، وأصحاب والحلقات والأجهزة ميكروفلويديك في الايثانول 70٪. استخدام الحاويات (مثل جرة أو كوب) التي لديها غطاء لمنع التبخر وتلوث الغبار أو الجزيئات خارج. وضع الأجهزة في حاوية واحدة (1) والخزانات وO-حلقات في حاوية الثانية (2)، وأصحاب في الثالثة (3).

ملاحظة: استخدام الايثانول 70٪ للتخزين هو الحفاظ على العقم. إذا كانت مكونات فقط من الحل هي الايثانول والماء (أي لا وكلاء تغيير طبيعة)، وينبغي أن تكون جميع مكونات النظام متوافق تماما ولن تتحلل بمرور الوقت.

2. تغيير الحل الايثانول في حاويات (2) و (3) قبل كل استعمال لمنع انتقال التلوث عبر التجارب والتقليل من وجود جزيئات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسبب انسداد.

2. تجربة إعداد

1. حاويات المكان (2) و (3) في حمام بالموجات فوق الصوتية للص 5-10 دقيقة قبل كل استعمال. هذا يساعد على إزالة أي جزيئات الملوثة من التجارب السابقة.
2. مساحة العمل نظيفة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع 70٪ محلول الإيثانول.
3. رش جميع المواد (3 حاويات، وملاقط) بمحلول الإيثانول 70٪ قبل وضعها داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.

3. جمعية

1. المنصوص عليها 2-3 مناديل منخفضة من الوبر في منطقة العمل.
2. إزالة خزانات البلاستيك من الحاويات مع ملاقط وتضعها على مناديل لتسهيل تبخر حل الإيثانول من الأسطح الداخلية. بلطف الاستفادة من الخزانات على السطح أو نفخ الهواء من خلالهم لتسهيل إزالة الحل الايثانول.
3. إدراج O-حلقات في الفتحة المناسبة على الخزانات.
4. إزالة حامل ورقائق من الحاويات منها والسماح لتتبخر الإيثانول (~ 1-2 دقيقة).
5. استخدام ملاقط لوضع رقاقة المطلوب وجها حتى (أي الثقوب الوصول لأعلى) في حامل. رفع حاملمع رقاقة لeyelevel للتأكد من رقاقة والاستلقاء في حامل وتعديل إذا لزم الأمر مع ملاقط. هام: إذا لم يصلح الجهاز بشكل صحيح على حامله، هناك خطر في أن كسر أثناء الخطوات اللاحقة.
6. المقبل، وضع بلطف الخزانات على حامل ومواءمتها مع لقطات. كن حذرا بأن الحلقات لا تسقط من فتحاتها أثناء هذه العملية.
7. اضغط برفق لأسفل على الخزانات حتى ينقرون في مكانها. تأكد من أن كلا الجانبين من خزانات آمنة وأن رقاقة يبدو أن في الموضع الصحيح.

4. إعداد الخلية

1. لخلايا ملتصقة (خطوط الأولية أو المنشأة): لوحة الخلايا 1-2 أيام قبل التجربة بحيث لا تزيد عن 80٪ متموجة في يوم التجربة.
2. وضع الخلايا في التعليق (في برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام ذات الصلة) وتهدف للتركيز التشغيل من 1.0 × 10 ⁶ خلية / مل إلى 1.0 × 10 ⁷ سلليرة سورية / مل. ملاحظة: إننا لم يلحظ تغييرات كبيرة في الأداء التسليم بسبب تركيز الخلية.
3. مزج الخلايا والمواد تسليم المطلوب في أنبوب منفصلة للحصول على تركيز المواد المطلوبة للتجربة. هام: لأن طريقة التسليم وصفها يعتمد على نشرها لتسهيل التسليم، وتركيز المواد أعلى عائد أعلى التسليم. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام حل 1 ميكرومتر من المواد المطلوبة للمحاكمات الأولية. ويمكن بعد ذلك معاير هذا التركيز عليها في التجارب المستقبلية حسب الحاجة. تركيز أقل ذكرت المستخدمة مع هذا الجهاز هي 10 نانومتر ^21.

5. عملية

1. خليط من خلايا ماصة والمادية التسليم في خزان (التصميم الحالي لديه القدرة القصوى 150 ميكرولتر). ملاحظة: معظم التصاميم الجهاز هي عكسها تماما وبالتالي لا يهم اتجاه تدفق من خلال القنوات. قد يتم تحميل العينات في أي من الخزانات اثنين.
2. إرفاق أنابيب الضغط إلى الخزان شغل وتشديد الجوز لضمان ختم الصحيح (ضيق الإصبع غالبا ما يكون كافيا).
3. ضبط الضغط إلى المستوى المطلوب على منظم. هذا يتحكم في السرعة التي تنتقل عبر خلايا الجهاز. لاحظ أنه لا يبدأ تدفق الخلية حتى يتم الضغط على زر.

ملاحظة: في الأعمال السابقة، والنيتروجين أو الهواء المضغوط عملت بشكل جيد على قدم المساواة مع الغاز الناقل.

4. رفع الجهاز إلى مستوى العين وتوجيهه بحيث السائل في الخزان مرئيا بسهولة. ملاحظة: تعقب العمود السائل لاغلاق النظام قبل أن يتم تفريغ الخزان.
5. اضغط على زر للضغط الخزان ويبدأ تدفق الخلية.
6. عندما يكون مستوى السائل حوالي 2 مم من قاع الخزان، سرعان ما تتحول المنظم ل0 رطل لوقف التدفق. هام: إذا كان واحد فشل في وقف تدفق قبل يتم إفراغ الخزان، واحد مخاطر إخراج عينة من collectioن الخزان. نلاحظ أيضا أنه إذا كان عمود السائل لا يتحرك بوتيرة ملحوظة، أو قد تباطأ نسبيا إلى حد كبير في معدل التدفق الأولي (مثل 3X أبطأ)، وربما انسداد الجهاز شنت ويحتاج إلى تبادلها. يمكن تشغيل الجهاز انسداد يؤدي إلى موت الخلايا أعلى.
7. جمع الخلايا المعالجة من خزان المناسبة ووضعها في أنبوب جمع المطلوب / لوحة. هام: لا تمييع الخلايا التي تم جمعها في أي مخازن في هذه المرحلة، ذلك لأن الخلايا porated سوف تستمر في امتصاص المواد لمدة تصل إلى 10 دقيقة ^20. بعد أن مرت هذه النافذة، وتمييع الخلايا في وسائل الاعلام المطلوب / العازلة.
8. لجمع الخلايا المعالجة أكثر أو محاولة الظروف التجريبية البديلة، كرر الخطوات من 5،1-5،7 حسب الحاجة. نذكر بأن رقائق قابلة للعكس، وبالتالي عينات يمكن تركيبه في أي الخزان. ومن المؤكد أن تبادل رقائق حسب الحاجة إذا كانت تسد. تجاهل الأجهزة المسدودة.

6. التفكيك

1. بلطف فصل الخزانات من صاحب الرئيسية عن طريق دفع جانبا مقطع الأسلحة.
2. وضع كل جزء في حاوية التخزين المناسبة (المفصل في القسم 1).
3. وضع الرقائق المستخدمة في وعاء منفصل للتخلص منها.

النتائج

يحتوي الشكل 1 تخطيطي وصفية للنظام التسليم ميكروفلويديك. أرقام 2A-B توضيح نتائج نموذجية من علاج خلايا هيلا مع تصاميم مختلفة في الجهاز وجود fluorescently مترافق 3 كيلو دالتون ديكستران ^20. إذا تم اتباع الإجراء بشكل صحيح، سوف أداء النظام تكون حساسة لنوع ال?...

Discussion

قد تحتاج بعض جوانب الإجراءات التجريبية وصفها (أي عوامل أخرى من تصميم رقاقة وسرعة التشغيل) ليكون الأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا والمواد التسليم يتم تطبيق نظام ل. المناقشة التي يلي عناوين بعض العوامل الأكثر شيوعا التي يجب مراعاتها عند تصميم التجارب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Holder & Plastic reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Rings	McMaster	9452K311
Pressure system to operate device	SQZ Biotechnologies	Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath