JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için sistemin nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı adımlar sağlar.

Özet

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknoloji daha önce zorlu uygulamaları ele potansiyel göstermiştir; dahil, primer immün hücrelerin, hücre yeniden programlanması, karbon nanotüp ve kuantum nokta teslim teslimat. Bu vektör içermeyen mikroakışkan platformu hedef maddenin sitosolik sağlanmasının kolaylaştırılması için, hücre zarının mekanik parçalama dayanır. Burada, montaj cihazı, hücre hazırlama ve sistem çalışması dahil olmak üzere, bu mikroakışkan cihazlar için kullanımının detaylı bir yöntem tarif eder. Bu teslim yaklaşım cihaz tipi ve daha önce bildirilmemiş uygulamalar için çalışma koşulları kısa bir optimizasyon gerektirir. Bu sistem, özel tamponlar veya kimyasal modifikasyon / çekimi adımlar gerektirmez olarak verilen talimatlar çoğu hücre tipi ve dağıtım malzemeleri genellenebilir bulunmaktadır. Bu çalışma aynı zamanda sağlamaks cihazın performansını artırmak ve tıkanma, düşük bir uygulama randımanı, ve hücre canlılığı ile ilgili potansiyel sorunları sorunsuz çekmek için nasıl öneriler.

Giriş

Hücre sitoplazmaya makromoleküllerin teslim tedavi ve araştırma uygulamalarında önemli bir adımdır. Protein teslim 3 klinik ve laboratuar hem de 4 ortamlarında hücre fonksiyonunu etkileyen gelecek vaat eden bir araçtır ise Nanopartikül aracılı teslim, örneğin, gen terapi 1,2 potansiyel göstermiştir. Bu tür küçük moleküllü ilaçlar, kuantum noktaları veya altın nano partiküller gibi diğer malzemeler, 5,6 kanser tedavileri ikinci izleme 9, hücre içi etiketleme 7,8 ve tek bir molekül kadar uygulamalarda ilgi çekicidir.

Hücre zarı makromoleküllere ölçüde geçirimsizdir. Birçok mevcut olan tekniklerin büyük membran bozulması ya da endositoksik iletilmesini kolaylaştırmak için 10,11 polimerik nano parçacıklar, lipozomlar 12 ya da kimyasal değişiklikler 13 kullanır. Bu yöntemlerde, teslimat verimlilik ve hücre canlılığı th yapısına genellikle bağlıdıre hedef molekül, ve hücre türü. Bu yöntemler, böyle bir nükleik asit gibi, yapısal olarak tek tip malzemeler, doğum sırasında etkili olabilir, ancak genellikle bu tür proteinlerin ve 14,15 nanomalzemelerin 7 daha fazla yapısal olarak farklı malzemeler, teslimat için kötü uygundur. Ayrıca, bu yöntemlerin çoğu güveniyor endozom bozulma mekanizması dolayısıyla kesecik yapılarda 16 sıkışıp çok malzemeyi bırakarak, genellikle verimsiz. Son olarak, sık sık kurulan hücre hatları ile kullanım için geliştirilen yöntemler primer hücrelerde iyi tercüme etmeyin.

, Elektroporasyon 17,18 ve 19 sonoporation membran gözeneklendirme yöntemleri, bazı uygulamalarda, cazip bir alternatif olmakla birlikte, düşük hücre canlılığı neden olduğu bilinmektedir ve hedef dağıtım malzemesinin şarj ile sınırlı olabilir.

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon, teslimat microfluidic yaklaşım, son zamanlarda vardır demonstrbir hücrenin yeniden programlanması 20 ve nano malzeme teslimat 21 bağlamında, mevcut tekniklere göre avantajları ×. Bu yöntem, çevreleyen tamponu içinde bulunan maddelerin sitosolik iletilmesini kolaylaştırmak için hücre zarı o mekanik parçalama dayanır. Sistem daha önce hücre tipleri zorlu (primer immün hücreler ve kök hücreleri) ve malzemeleri (örneğin antikorlar ve karbon nanotüpler) potansiyeli sağlayan göstermiştir. Burada, hedef makromoleküllerin hücre içi iletimi için bu cihazların kullanımı için genel prosedür tarif edilmektedir. Ancak, daha önce bildirilmemiş uygulamalar için, bizim daha önce bildirilen tasarım kuralları 20 ayrıntılı olarak bir, koşulların kısa bir optimizasyon yapması tavsiye edilir; prosedür çoğu hücre tipleri ve dağıtım malzemeleri genellenebilir. Bugüne kadar, sistem RNA, DNA, altın nano-tanecikleri, kuantum noktaları, karbon nanotüp, protein verilmesi için başarılı bir şekilde kullanılmıştırs ve dekstran polimerleri 20,21.

Protokol

1.. Depolama

  1. % 70 etanol rezervuarları, sahipleri, O-halkaları ve microfluidic cihazlar saklayın. Toz veya dışındaki parçacıkların buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için bir kapağa sahip bir kap (örneğin kavanoz veya kabı) kullanın. Üçüncü olarak, bir kap (1), rezervuar ve O-halkaları, ikinci bir kap (2) içinde ve sahipleri aygıtları yerleştirin (3).

Not: depolama için% 70 etanol kullanılması sterilite korumaktır. Çözeltinin tek bileşenleri, etanol ve su (yani hiçbir denatüre ajanlar) ise, bütün sistem bileşenleri uyumlu olmalı ve zamanla düşer değildir.

  1. Kapların (2) etanol çözeltisi değiştirmek ve (3) deney boyunca çapraz kontaminasyonu önlemek ve tıkanmaya neden olabilecek istenmeyen parçacıkların varlığını en aza indirmek için her kullanımdan önce.

2. Deney Hazırlama

  1. Bir yer kaplar (2) ve (3) bir ultrason banyosunda foHer kullanımdan önce r 5-10 dk. Bu, daha önceki deneylerden herhangi bir kirletici partikülleri temizlenmesine yardımcı olur.
  2. % 70 etanol çözeltisi ile biyogüvenlik kabini temiz çalışma alanı.
  3. Biyogüvenlik kabini içine yerleştirmeden önce% 70 etanol çözeltisi ile tüm malzemeleri (3 kaplar ve cımbız) püskürtün.

3. Montaj

  1. Çalışma alanında 2-3, az tüylü mendil aşağı ayarlayın.
  2. Cımbız ile kaptan plastik rezervuar çıkarın ve iç yüzeylerinden etanol çözeltisi buharlaşmasını kolaylaştırmak için silme bezlerinin üzerinde ayarlayın. Yavaşça yüzeyi üzerinde rezervuarlar dokunun ya da etanol çözeltisi çıkarılmasını kolaylaştırmak için bunların içinden hava darbe.
  3. Rezervuar üzerindeki uygun yuvaya O-halkalarını takın.
  4. İlgili kaplardan tutucu ve cips çıkarın ve etanol (~ 1-2 dk) buharlaşmasına izin verin.
  5. Tutucuya istenilen çip yüzü yukarı (up yani giriş delikleri) yerleştirmek için cımbız kullanın. Tutucu kaldırınçip emin çip tutucuya yatık olmasına yapmak ve gerekirse cımbız ile ayarlamak için göz hizası için birlikte. ÖNEMLİ: Cihaz tutucusuna doğru girmiyorsa, bu takip eden adımları sırasında kıracak bir risk vardır.
  6. Sonra, yavaşça tutucuya rezervuarları yerleştirin ve klipleri ile düzenleyiniz. O-ringler, bu süreçte kendi yuvalarından dışarı düşmemesi dikkatli olun.
  7. Yerine oturana kadar hafifçe rezervuar bastırın. Rezervuarların her iki tarafın güvenli ve yonga doğru konumda olması için görünür olduğundan emin olun.

4. Hücre Hazırlanması

  1. Yapışık hücrelerle (birincil veya kurulmuş hat) için: 1-2 gün önce deney plaka hücreler deney gününde en fazla% 80 konfluent şekildedir.
  2. (PBS veya ilgili ortam içinde) süspansiyon içinde hücrelerin koyun ve 1.0 x 10 6 hücre / ml 7 cel 10 x 1.0 arasında bir çalışma konsantrasyonu için amaçls / ml. NOT: Biz nedeniyle hücre konsantrasyonu teslimat performansında önemli bir değişiklik gözlenmedi değil.
  3. Deney için istenen malzeme konsantrasyonunu elde etmek için ayrı bir tüp içinde hücreleri ve arzu edilen malzeme dağıtım karıştırın. ÖNEMLİ: tarif dağıtım yöntemi teslim kolaylaştırmak için difüzyon dayandığından, daha yüksek bir malzeme konsantrasyon yüksek teslim verecektir. Mümkünse, ilk denemeler için arzu edilen bir malzeme 1 uM çözüm kullanmak tavsiye edilir. Gerektiği gibi bu konsantrasyon daha sonra gelecek deneylerde aşağı titre edilebilir. Bu cihaz ile kullanılan düşük bildirilen konsantrasyonu 10 nM 21'dir.

5. Operasyon

  1. Pipet bir rezervuar (güncel tasarım maksimum 150 ul kapasitesine sahiptir) içine hücreleri ve teslimat malzeme karışımı. NOT: Çoğu cihaz tasarımları nedenle kanallardan akış yönü önemli değil tamamen geri dönüşümlüdür. Örnekler, iki ya da rezervuar halinde yüklenebilir.
  2. Dolu hazneye basınçlı boru takın ve uygun sızdırmazlık (parmak sıkı genellikle yeterlidir) sağlamak için somunu sıkın.
  3. Regülatör üzerinde istenilen seviyeye basıncını ayarlayın. Bu hücreler cihazı ile seyahat hızını kontrol eder. Düğmesine basılana kadar hücre akışı başlamaz unutmayın.

NOT: Bir önceki çalışmada, nitrojen ya da sıkıştırılmış hava taşıyıcı gaz olarak eşit derecede iyi çalıştık.

  1. Göz seviyesine cihazı kaldırın ve rezervuar içindeki sıvı kolayca görünür şekilde onu yönlendirin. NOT: Rezervuar boşaltılır önce sistemi kapatmak için sıvı sütunu takip edin.
  2. Rezervuar basınç ve hücre akışını başlatmak için düğmesine basın.
  3. Sıvı seviyesi rezervuarın altından yaklaşık 2 mm olduğunda, hızlı bir şekilde akışını durdurmak için 0 psi regülatör açın. ÖNEMLİ: Rezervuar boşaltılır önce bir akışını durdurmak için başarısız olursa, bir Collectio gelen örnek püskürtülmesiyle risklerin rezervuar. Ayrıca sıvı kolonu bir kayda değer bir hızda hareket etmiyor, ya da başlangıç ​​akış hızı (örneğin 3x yavaş) esasen göreli yavaşladı ise, monte edilen cihaz, muhtemelen tıkanmış ve takas gerektiğini unutmayın. Tıkanmış bir cihaz işletim yüksek hücre ölümüne yol açabilir.
  4. Uygun hazneden muamele edilmiş hücreleri toplamak ve arzu edilen toplama tüpü / levha yerleştirin. ÖNEMLİ: gözeneklendirilmiş hücreler yukarı 10 dakika 20 için malzeme alımı devam edecek gibi bu aşamada herhangi tamponlarda toplanan hücreleri sulandırmak etmeyin. Bu pencere geçtikten sonra, istenen medya / tampon içinde hücreleri seyreltin.
  5. Gerektiği gibi 5.7 - Daha fazla işlenmiş hücreleri toplamak ya da alternatif deney koşulları denemek için tekrarlayın 5.1 adımları. Cips geri dönüşümlü olduğunu hatırlayın, bu nedenle numuneler rezervuar ya monte edilebilir. Yapışmasına neden gerektiği şekilde fiş alışverişi emin olun. Tıkanmış cihazları atın.

6. Sökme

  1. Yavaşça kenara klip kollarını iterek ana sahibinden rezervuarları ayırın.
  2. (1. bölümdeki ayrıntılı) uygun saklama kabının her parçayı yerleştirin.
  3. Bertaraf etmek için ayrı bir kap içinde kullanılan fiş yerleştirin.

Sonuçlar

Şekil 1, bu mikroakışkan dağıtım sisteminin bir şematik tanımlayıcı içerir. 2a-b Şekil floresan konjuge 3 kDa dekstran 20 varlığında farklı cihaz tasarımları ile HeLa hücrelerinin tedavisi tipik sonuçlar göstermektedir. Prosedür doğru takip edilirse, sistem performansı aygıt türü ve çalışma hızına duyarlı olacaktır. Bu nedenle, daha karmaşık deneylere başlamadan önce, belirli bir uygulama için bu koşulları optimize etmek gerekir. Şeki...

Tartışmalar

Anlatılan deney yöntemi (yonga tasarımı ve çalışma hızı dışında örneğin faktörler) bazı özellikleri sistem uygulanır hücre tipi ve dağıtım materyale bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir. Adreslerinin deneylerini tasarlarken dikkate en yaygın bazı faktörlerin aşağıdaki tartışma.

Floresan etiketli bileşikler için teslim sinyal geliştirmek için, bir eşiğe kaynaklarını ele gerekiyor. Yüzey bağlayıcı ve endositoz, örneğin, kültür ya d...

Açıklamalar

Yazarlar Armon Sharei, Robert Langer ve Klavs F. Jensen Bu makalede kullanılan mikroakışkan cihazlar üretiyor SQZ Biyoteknoloji Şirketi hissedarlar.

Teşekkürler

Biz deney tasarımı ve veri analizi yararlı tartışma T. Shatova teşekkür ederim. G. Paradis yardım ve uzmanlık, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'nde Koch Enstitüsü çekirdek akım sitometri ve Microsystems Teknoloji Laboratuvarı personelinin personel müteĢekkiriz. Bu çalışma Sağlık Hibeler RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek (Çekirdek) tarafından P30-CA14051 ve MPP-09Call-Langer-60 Grants edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Device Holder & Plastic reservoirSQZ BiotechnologiesHolder
LSRFortessa AnalyzerBecton DickinsonN/AFlow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic deviceSQZ BiotechnologiesCell Squeeze
O-RingsMcMaster9452K311
Pressure system to operate deviceSQZ BiotechnologiesPressure System
Tweezers
Ultrasound bath

Referanslar

  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 81Transfeksiyonmikroak kanvekt r cretsizprotein teslimath cre i i teslimatkuantum nokta teslimath cre yeniden programlamasiRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır