Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

Resumo

Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Este protocolo fornece etapas detalhadas sobre como usar o sistema para uma ampla gama de aplicações.

Resumo

Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Esta tecnologia tem mostrado potencial para enfrentar aplicações previamente desafiantes, incluindo, a entrega de pilhas imunes, reprogramação celular, nanotubos de carbono, e entrega ponto quântico. Esta plataforma de microfluidos livre do vector depende de ruptura mecânica da membrana celular para facilitar a entrega citosólica do material alvo. Relata-se o método detalhado de uso para esses dispositivos microfluídicos, incluindo, a montagem do dispositivo, a preparação celular, e operação do sistema. Esta abordagem requer a entrega de uma breve otimização do tipo de dispositivo e as condições de operação para aplicações previamente não-relatados. As instruções fornecidas são generalizáveis ​​para a maioria dos tipos de células e materiais de entrega, este sistema não requer buffers especializados ou etapas modificação química / conjugação. Este trabalho também fornecers recomendações sobre como melhorar o desempenho do dispositivo e de problemas disparar potenciais problemas relacionados com a obstrução, a eficiência de entrega baixos, ea viabilidade celular.

Introdução

A entrega de macromoléculas para o citoplasma da célula é um passo crítico para aplicações terapêuticas e de pesquisa. Nanopartículas de entrega mediada, por exemplo, revelou potencial na terapia de genes ^{de 1,2,} enquanto que a entrega de proteína é uma forma promissora de afectar a função celular, tanto clínicas e laboratoriais ^{3 4} configurações. Outros materiais, tais como medicamentos de pequenas moléculas, pontos quânticos, ou nanopartículas de ouro, são de interesse em aplicações que vão desde o tratamento do câncer ^{de 5,6} para ^7,8 rotulagem intracelular, e única molécula de rastreamento ^9.

A membrana da célula é largamente impermeável a macromoléculas. Muitas técnicas existentes usar nanopartículas poliméricas ^10,11, lipossomas ¹² ou ¹³ modificações químicas para facilitar a ruptura da membrana ou a entrega endocítica. Nestes métodos, a eficiência de entrega e a viabilidade celular são muitas vezes dependentes da estrutura do the molécula-alvo e do tipo de célula. Estes métodos podem ser eficientes na entrega de materiais estruturalmente uniformes, tais como os ácidos nucleicos, mas são muitas vezes mal adaptados para a entrega de mais estruturalmente diversos materiais, tais como proteínas e os nanomateriais ^{14,15 7.} Além disso, o mecanismo de interrupção do endossoma que a maioria destes métodos baseiam-se é muitas vezes ineficaz, deixando, portanto, muito material aprisionado em estruturas vesiculares ^16. Finalmente, os métodos que são muitas vezes desenvolvidos para utilização com as linhas de células estabelecidas, não se traduz bem a células primárias.

Métodos Membrane poração, como eletroporação ^17,18 e sonoporação ^19, são uma alternativa atraente em algumas aplicações, no entanto, eles são conhecidos por causar a viabilidade celular de baixo e pode ser limitada pela carga do material de entrega alvo.

Deformação mecânica rápida de células, uma abordagem microfluídicos para entrega, tem recentemente demonstrated suas vantagens em relação às técnicas actuais no contexto de reprogramação das células ²⁰ e ^{21 de} fornecimento de nanomateriais. Este método baseia-se o desmembramento mecânico da membrana celular para facilitar a entrega citosólica de materiais presentes no tampão circundante. O sistema demonstrou permitindo potencial anteriormente desafiando tipos de células (por exemplo, células imunes primárias e as células-tronco) e materiais (por exemplo, anticorpos e os nanotubos de carbono). Aqui, o processo geral para utilizar estes dispositivos para a entrega intracelular de macromoléculas alvo é descrita. O procedimento é generalizável para a maioria dos tipos de células e materiais de entrega, no entanto, recomenda-se que uma realização de uma breve otimização das condições, conforme detalhado em nossas diretrizes previamente relatados projeto ^20, para todas as aplicações anteriormente não declaradas. Até à data, o sistema tem sido utilizado com sucesso para a entrega de RNA, DNA, as nanopartículas de ouro, quantum dots, nanotubos de carbono, proteínas, e polímeros de dextrano ^20,21.

Protocolo

1. Armazenamento

1. Armazene os reservatórios, suportes, anéis de vedação e dispositivos microfluídicos em etanol 70%. Use um recipiente (por exemplo, jarra ou copo) que tem uma tampa para evitar a evaporação e contaminação por poeira ou partículas de fora. Colocar os dispositivos em um recipiente (1), reservatórios e os O-rings em um segundo recipiente (2), e os detentores na terceira (3).

Nota: O uso do etanol de 70% para o armazenamento é manter a esterilidade. Se os únicos componentes da solução são o etanol e água (ou seja, sem agentes de desnaturação), todos os componentes do sistema deve ser totalmente compatível e não se degrada com o tempo.

2. Alterar solução de etanol em recipientes (2) e (3) antes de cada utilização, para evitar a contaminação cruzada através de experiências e minimizar a presença de partículas indesejáveis ​​que podem causar o entupimento.

2. Experiência Preparação

1. Coloque os recipientes (2) e (3) em um banho de ultra-som for 5-10 min, antes de cada utilização. Isso ajuda a remover as partículas contaminantes a partir de experiências anteriores.
2. Limpe espaço de trabalho na cabine de segurança biológica com solução de etanol a 70%.
3. Spray de todos os materiais (3 recipientes, e pinças) com uma solução de álcool 70% antes de colocá-los dentro da cabine de segurança biológica.

3. Montagem

1. Pouse 2-3 toalhetes baixo fiapos na área de trabalho.
2. Remover reservatórios de plástico a partir de seu recipiente com uma pinça e colocá-las sobre os lenços para facilitar a evaporação da solução de etanol a partir de superfícies internas. Bater levemente os reservatórios sobre a superfície ou sopro de ar através delas a fim de facilitar a remoção da solução de etanol.
3. Insira o-rings em seu slot apropriado dos reservatórios.
4. Retire o suporte e fichas respectivos recipientes e permitir que o etanol evapore (~ 1-2 min).
5. Use uma pinça para colocar o chip virado para cima desejado (ou seja, furos de acesso para cima) no suporte. Levante a titularcom o chip para eyelevel para garantir que o chip está deitado no suporte e ajustar, se necessário, com a pinça. IMPORTANTE: Se o dispositivo não encaixar corretamente em seu suporte, há um risco de que ele vai quebrar durante as etapas subseqüentes.
6. Em seguida, coloque delicadamente os reservatórios no suporte e alinhá-las com os clipes. Tenha cuidado para que o-rings não caem de seus slots durante este processo.
7. Pressione gentilmente os reservatórios até que eles se encaixem no lugar. Assegure-se que ambos os lados dos reservatórios são seguras e que o chip parece estar na posição correcta.

4. Preparação celular

1. Para as células aderentes (linhas primárias ou estabelecidas): células da placa de 1-2 dias antes da experiência de modo a que eles não são confluentes mais do que 80% no dia da experiência.
2. Coloque as células em suspensão (em PBS ou mídia relevante) e apontar para uma concentração operacional de 1,0 x 10 ⁶ células / ml a 1,0 x 10 ⁷ cells / ml. NOTA: Nós não observamos mudanças significativas no desempenho de entrega, devido à concentração de células.
3. Misturar as células e o material de entrega desejado num tubo separado para obter a concentração de material desejado para a experiência. IMPORTANTE: Como o método de entrega descrito depende de difusão para facilitar a entrega, uma concentração maior de material trará entrega superior. Se possível, é recomendado o uso de uma solução 1 mM de o material desejado para ensaios iniciais. Esta concentração pode ser, em seguida, titulada para baixo em futuras experiências, conforme necessário. A concentração mais baixa relatado utilizado com este dispositivo é de 10 nM ^21.

5. Operação

1. Pipeta mistura de células e material de entrega em um reservatório (projeto atual tem um máximo de capacidade de 150 mL). NOTA: A maioria dos projetos de dispositivos são totalmente reversíveis, portanto, sentido do fluxo através dos canais não importa. As amostras podem ser carregados em qualquer um dos dois reservatórios.
2. Prenda a tubulação de pressão para o reservatório cheio e apertar a porca para garantir vedação adequada (dedo apertado é muitas vezes suficiente).
3. Regule a pressão para o nível desejado no regulador. Este controla a velocidade à qual as células de viajar através do dispositivo. Note-se que o fluxo de células não começar até que o botão é pressionado.

NOTA: Num trabalho prévio, o azoto ou o ar comprimido pode trabalhar igualmente bem como o gás de transporte.

4. Elevar dispositivo ao nível dos olhos e orientá-la de modo a que o líquido no reservatório é facilmente visível. NOTA: Acompanhe a coluna de líquido para desligar o sistema antes de o reservatório é esvaziado.
5. Pressione o botão para pressurizar o reservatório e iniciar o fluxo de celular.
6. Quando o nível de líquido é de cerca de 2 mm a partir do fundo do reservatório, desligar rapidamente o regulador de 0 psi até parar o fluxo. IMPORTANTE: Se um falhar para interromper o fluxo antes que o reservatório é esvaziado, se corre o risco de ejetar a amostra do collection reservatório. Observe também que, se a coluna de fluido não está se movendo em um ritmo apreciável, ou diminuiu substancialmente em relação ao seu caudal inicial (por exemplo, 3x mais lento), o dispositivo montado é provavelmente entupida e precisa ser trocado. A operação de um dispositivo obstruído pode levar à morte da célula superior.
7. Recolha as células tratadas a partir do reservatório apropriado e coloque-os no tubo de coleta / placa desejada. IMPORTANTE: Não diluir as células coletadas em todos os buffers, nesta fase, as células rado continuará a captação de material para até 10 min ^20. Após esta janela já passou, diluir as células na mídia / tampão desejado.
8. Para coletar mais células tratadas ou tente condições experimentais alternativos, repita os passos de 5,1-5,7, conforme necessário. Recorde-se que as batatas fritas são reversíveis, por conseguinte, as amostras podem ser montados em qualquer reservatório. Certifique-se de trocar chips como necessário se entupir. Descarte dispositivos entupidos.

6. Desmontagem

1. Desligar suavemente os reservatórios do titular principal, empurrando de lado as armas de clipe.
2. Coloque cada parte no recipiente apropriado (detalhado na seção 1).
3. Coloque chips usados ​​em um recipiente separado para a eliminação.

Resultados

A Figura 1 apresenta um esquema descritivo de o sistema de entrega de microfluidos. Figuras 2a-b ilustram os resultados típicos de tratamento de células HeLa com diferentes modelos de dispositivos, na presença de fluorescência 3 conjugado dextrano ²⁰ kDa. Se o procedimento for seguido corretamente, o desempenho do sistema será sensível ao tipo de dispositivo e velocidade de operação. Portanto, deve-se otimizar essas condições para uma determinada aplicação antes d...

Discussão

Certos aspectos do procedimento experimental descrito (isto é, com excepção de design de chips e a velocidade de funcionamento factores) pode necessitar de ser optimizada, dependendo do tipo de célula e material de entrega que o sistema é aplicado. A discussão que se segue aborda alguns dos fatores mais comuns a considerar ao projetar experimentos.

Para melhorar o sinal de entrega para compostos marcados com fluorescência, é preciso abordar as fontes de fluorescência de fun...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Holder & Plastic reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Rings	McMaster	9452K311
Pressure system to operate device	SQZ Biotechnologies	Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath