Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Zusammenfassung

Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Dieses Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie das System für eine breite Palette von Anwendungen.

Zusammenfassung

Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Diese Technologie hat bei der Bewältigung zuvor anspruchsvolle Anwendungen Potenzial gezeigt, einschließlich der Lieferung in primären Immunzellen, Zell Umprogrammierung, Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Quantenpunkt-Lieferung. Dieser vektorfreien mikrofluidischen Plattform stützt sich auf mechanische Zerstörung der Zellmembran zu cytosolische Abgabe des Zielmaterials zu erleichtern. Hier beschreiben wir die detaillierte Verfahren für die Verwendung dieser Mikrofluidvorrichtungen einschließlich Vorrichtungsanordnung, Zellpräparation und den Systembetrieb. Dieser Liefer Ansatz erfordert eine kurze Optimierung von Gerätetyp und Betriebsbedingungen für die zuvor gemeldet Anwendungen. Die Anweisungen gelten verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien wie dieses System nicht spezialisierten Puffer oder chemische Modifikation / Konjugation Schritte erfordern. Diese Arbeiten stellen auchs Empfehlungen, wie die Geräteleistung zu verbessern und störungs schießen mögliche Probleme zu Verstopfung, geringe Liefer Effizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zusammen.

Einleitung

Freisetzung von Makromolekülen in die Zelle Zytoplasma ist ein kritischer Schritt in der therapeutischen und Forschungsanwendungen. Nanopartikel-vermittelte Abgabe, zum Beispiel, hat Potenzial in der Gentherapie ^1,2 gezeigt, während Protein-Lieferung ist ein vielversprechendes Mittel beeinflussen die Zellfunktion sowohl in klinischen und Labor ^{3 4} Einstellungen. Andere Materialien, wie zum Beispiel Medikamente aus kleinen Molekülen, Quantenpunkte oder Gold-Nanopartikel, sind von Interesse in Anwendungen von Krebstherapeutika ^5,6 bis ^7,8 intrazelluläre Markierung und ^{Einzelmolekül-Tracking-9.}

Die Zellmembran weitgehend undurchlässig für Makromoleküle. Viele existierende Techniken verwenden, polymere Nanopartikel ^10,11, Liposomen ¹² oder chemische Modifikationen ¹³ bis Membran Störung oder endozytotische Lieferung zu erleichtern. Bei diesen Verfahren sind die Abgabeeffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen oft abhängig von der Struktur der the Zielmolekül und der Zelltyp. Diese Verfahren können bei der Lieferung von strukturell einheitlichen Materialien wie Nukleinsäuren effizient sein, aber für die Lieferung von mehr strukturell unterschiedlichen Materialien, wie Proteinen und ^14,15 Nano ⁷ sind oft ungeeignet. Darüber hinaus ist der Mechanismus, der Endosomen Störung meisten dieser Verfahren beruhen auf häufig ineffizient vor, sodass viel Material in Vesikel-Strukturen ¹⁶ gefangen. Schließlich, Methoden, die oft für die Verwendung mit etablierten Zelllinien entwickelt, sind nicht gut zu übersetzen, um Primärzellen.

Membranporenbildung Methoden wie Elektroporation ^17,18 Sonoporation und ^19, sind eine attraktive Alternative in einigen Anwendungen, jedoch sind sie bekannt, die Lebensfähigkeit der Zellen gering verursachen und kann durch die Ladung der Ziel Lieferung Material begrenzt werden.

Schnelle mechanische Verformung von Zellen, einer mikrofluidischen Ansatz zur Lieferung, hat vor kurzem, EinzelhandelATED seine Vorteile gegenüber aktuellen Techniken im Rahmen der Neuprogrammierung Zelle ²⁰ und ²¹ Nanomaterial Lieferung. Dieses Verfahren beruht auf mechanischen Störung o der Zellmembran zu cytosolische Abgabe von in der Umgebung vorhandenen Materialien Puffer erleichtern. Das System hat gezeigt, wodurch Potenzial in zuvor Herausforderung Zelltypen (zB primäre Immunzellen und Stammzellen) und Materialien (zB Antikörper und Kohlenstoffnanoröhren). Hierbei wird die allgemeine Vorgehensweise, um diese Geräte für intrazellulären Transport von Makromolekülen Ziel verwenden beschrieben. Das Verfahren ist verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien, jedoch ist es empfehlenswert, dass man führen eine kurze Optimierung der Bedingungen, wie in unserem zuvor berichtet, Design-Richtlinien ²⁰ beschrieben, für alle bisher nicht gemeldet Anwendungen. Bisher hat das System erfolgreich für die Lieferung von RNA-, DNA-, Gold-Nanopartikel, Quantenpunkte, Kohlenstoff-Nanoröhren, Protein verwendets und Dextran-Polymere ^20,21.

Protokoll

1. Lagerung

1. Lagern Sie die Behälter, Halter, O-Ringe und mikrofluidischen Systemen in 70% Ethanol. Verwenden Sie einen Behälter (zB Glas oder Becher), die einen Deckel, um Verdunstung und Kontamination durch Staub oder Partikel zu verhindern außen hat. Zeigen die Geräte in einem Behälter (1), Vorratsbehälter und O-Ringe in einem zweiten Behälter (2), in dem dritten Halter (3).

Anmerkung: Die Verwendung von 70% Ethanol für die Lagerung ist, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Wenn die einzigen Komponenten der Lösung sind Ethanol und Wasser (dh keine Denaturierung Agenten), sollten alle System-Komponenten kompatibel sein und wird nicht im Laufe der Zeit verschlechtern.

2. (3) vor jedem Gebrauch, um eine Kreuzkontamination zu verhindern und über Experimente minimieren die Anwesenheit von unerwünschten Partikeln, die dazu führen können verstopfen ändern Ethanol-Lösung in Behältern (2) und.

2. Experiment Vorbereitung

1. Ort Behälter (2) und (3) im Ultraschallbad for 5-10 Minuten vor jedem Gebrauch. Dies hilft, entfernen Sie alle Schmutzpartikel aus früheren Experimenten.
2. Saubere Arbeitsbereich in Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol-Lösung.
3. Spray alle Materialien (3 Behälter und Pinzette) mit einer 70% igen Ethanollösung, bevor Sie sie in der biologischen Sicherheitsschrank.

3. Montage

1. Stellen Sie nach unten 2-3 fusselarm Tücher in den Arbeitsbereich.
2. Entfernen Sie die Plastikbehältern aus ihrem Behälter mit einer Pinzette und legen Sie sie auf den Tüchern um die Verdunstung von Ethanol-Lösung von inneren Oberflächen erleichtern. Klopfen Sie die Behälter auf der Oberfläche oder blasen Luft durch sie hindurch, um das Entfernen der Ethanollösung zu erleichtern.
3. Legen Sie die O-Ringe in ihre entsprechenden Steckplatz auf der Reservoirs.
4. Entfernen Sie den Halter und Chips von den jeweiligen Behältern werden und Ethanol verdampfen (~ 1-2 min).
5. Pinzette, um die gewünschte Spanfläche-up (dh Zugangslöcher oben) in den Halter zu platzieren. Heben Sie den Haltermit der Chip auf Augenhöhe, um sicherzustellen, dass der Chip flach liegt in der Halterung und stellen Sie gegebenenfalls mit der Pinzette. WICHTIG: Wenn das Gerät nicht korrekt in der Halterung passen, besteht die Gefahr, dass es während der nachfolgenden Schritte zu brechen.
6. Weiter ist, setzen die Stauseen auf der Halterung und richten Sie sie mit den Clips. Achten Sie darauf, dass die O-Ringe nicht aus ihren Schlitzen während dieses Prozesses fallen.
7. Drücken Sie vorsichtig auf den Reservoirs, bis sie einrastet. Damit beide Seiten der Behälter sicher sind und dass der Chip wird in der richtigen Position befinden.

4. Zellpräparation

1. Für adhärente Zellen (primäre oder etablierte Linien): Platte-Zellen 1-2 Tage vor dem Experiment, dass sie nicht mehr als 80% konfluent auf dem Tag des Experiments sind.
2. Platzieren Zellen in Suspension (in PBS oder relevanten Medien) und Ziel für eine Betriebskonzentration von 1,0 x 10 ⁶ Zellen / ml bis 1,0 x 10 ⁷ cells / ml. HINWEIS: Wir haben keine signifikanten Änderungen in der Lieferleistung durch Zellkonzentration beobachtet.
3. Mischen Zellen und die gewünschte Freisetzungsmaterial in einem separaten Röhrchen, um die gewünschte Stoffkonzentration für den Versuch zu erhalten. WICHTIG: Durch die beschriebene Lieferung Methode beruht auf Diffusion, die Lieferung zu erleichtern, wird eine höhere Materialkonzentration höhere Liefer ergeben. Wenn möglich, empfiehlt es sich, eine 1 uM Lösung des gewünschten Material für erste Versuche zu verwenden. Diese Konzentration kann dann nach unten in zukünftigen Experimenten nach Bedarf titriert werden. Die niedrigste Konzentration berichtet, mit diesem Gerät verwendet wird, ist 10 nM ^21.

5. Betrieb

1. Pipette Mischung von Zellen und Lieferung Material in einem Behälter (aktuelle Design hat eine maximale Kapazität 150 ul). HINWEIS: Die meisten Gerät Entwürfe sind vollständig reversibel daher Strömungsrichtung durch die Kanäle spielt keine Rolle. Proben können in einem der beiden Behälter geladen werden.
2. Bringen Druckschlauch auf die gefüllte Behälter und ziehen Sie die Mutter um die richtige Dichtung (handfest ist oft ausreichend) zu gewährleisten.
3. Stellen Sie den Druck auf das gewünschte Niveau auf dem Regler. Dies steuert die Geschwindigkeit, mit der Zellen durch die Vorrichtung zu reisen. Beachten Sie, dass Zellstrom nicht beginnen, bis die Taste gedrückt wird.

HINWEIS: In früheren Arbeiten wurden Stickstoff oder Druckluft ebenso gut als Trägergas gearbeitet.

4. Heben Gerät auf Augenhöhe und so ausrichten, dass die Flüssigkeit in dem Behälter gut sichtbar ist. HINWEIS: Verfolgen Sie die Flüssigkeitssäule zum Abschalten des Systems, bevor der Behälter geleert.
5. Drücken Sie die Taste, um das Reservoir unter Druck und beginnen Zelle fließen.
6. Wenn der Flüssigkeitspegel beträgt ca. 2 mm vom Boden des Behälters, schnell drehen den Regler auf 0 psi to Fluss zu stoppen. WICHTIG: Wenn einer ausfällt, um den Fluss zu stoppen, bevor der Behälter geleert wird, riskiert ein Auswerfen der Probe aus dem collection-Reservoir. Beachten Sie auch, dass, wenn die Flüssigkeitssäule bewegt sich nicht in einer nennenswerten Geschwindigkeit oder im Wesentlichen gegenüber ihrer Ausgangsstrom (Beispiel 3x langsamer) verlangsamt wird, wird das montierte Gerät wahrscheinlich verstopft und muss ausgetauscht werden. Der Betrieb eines verstopften Gerät kann zu höheren Zelltod führen.
7. Sammeln Sie die behandelten Zellen aus dem entsprechenden Behälter und legen Sie sie in der gewünschten Sammelrohr / Platte. WICHTIG: die gesammelten Zellen in beliebigen Puffern verdünnen zu diesem Zeitpunkt nicht, wie die porated Zellen wird weiterhin Material für bis zu 10 min ²⁰ Aufnahme. Nachdem dieses Fenster verstrichen ist, verdünnt, die Zellen in dem gewünschten Medium / Puffer.
8. Um mehr behandelten Zellen sammeln oder versuchen alternative Versuchsbedingungen, wiederholen Sie die Schritte von 5,1 bis 5,7, wie gebraucht. Erinnern, dass die Chips reversibel sind, kann daher Proben entweder Behälter montiert werden. Achten Sie darauf, Chips austauschen, wie gebraucht, wenn sie verstopfen. Entsorgen verstopft Geräte.

6. Demontage

1. Die Behälter von der Haupthalter vorsichtig trennen, indem neben die Clip-Arme.
2. Legen Sie jedes Teil in der entsprechenden Vorratsbehälter (in Abschnitt 1 dargestellt).
3. Zeigen verwendeten Chips in einem separaten Behälter zur Entsorgung bringen.

Ergebnisse

Fig. 1 enthält eine schematische beschreibende des mikrofluidischen Zufuhrsystem. Figuren 2a-b veranschaulichen typische Ergebnisse der Behandlung von HeLa-Zellen mit unterschiedlichen Geräteausführungen in Gegenwart von fluoreszenz konjugierten 3 ^{kDa-Dextran-20.} Wenn das Verfahren korrekt befolgt, wird die Systemleistung empfindlich auf Gerätetyp und Betriebsgeschwindigkeit. Daher sollte man diese Bedingungen für eine bestimmte Anwendung, bevor zu anspruchsvollen Versuc...

Diskussion

Bestimmte Aspekte der beschriebenen experimentellen Verfahren (dh andere als Chip-Design-und Betriebsgeschwindigkeit Faktoren) müssen je nach Zellentyp und Freisetzungsmaterial das System angewendet wird, um optimiert werden. Die Adressen, die folgt einige der häufigsten Faktoren, die bei der Gestaltung Experimente Diskussion.

Um die Liefersignal für fluoreszenzmarkierten Verbindungen zu verbessern, muss man zu den Quellen der Hintergrundfluoreszenz zu adressieren. Oberflächenbi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Holder & Plastic reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Rings	McMaster	9452K311
Pressure system to operate device	SQZ Biotechnologies	Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath