JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويتجلى PCR جنبا إلى جنب مع تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) كوسيلة سريعة وفعالة إلى التركيب الوراثي الزرد.

Abstract

الزرد هو نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة التنمية، والنمذجة المرض، وإجراء فحص المخدرات. وقد تم مؤخرا عرض مجموعة متنوعة من الأدوات الجينية، بما في ذلك استراتيجيات متعددة لإحداث طفرات وتوليد خطوط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، وفحص واسعة النطاق محدودة بسبب أساليب التنميط الجيني التقليدية، والتي هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. نحن هنا وصف تقنية لتحليل الأنماط الجينية الزرد بواسطة PCR جنبا إلى جنب مع تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA). هذا النهج هو سريعة وحساسة، وغير مكلفة، مع خطر أقل من التحف التلوث. التنميط الجيني بواسطة PCR مع HRMA يمكن استخدامها لأجنة الأسماك أو الكبار، بما في ذلك بروتوكولات الفرز الفائق الإنتاجية.

Introduction

الزرد (دانيو rerio) هو نظام نموذجي الفقارية المستخدمة على نطاق واسع لدراسات التنمية والنمذجة المرض. مؤخرا، تم تطوير العديد من التقنيات المعدلة وراثيا وتحور لالزرد. تقنيات نقل الجينات السريع، وعادة ما يعتمد على نظام ينقول Tol2 1، وقد تم جنبا إلى جنب مع تحسين خيارات متعددة لاستنساخ الحمض النووي التجمع جزء 2. وقد استخدمت nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs) لاستهداف مواضع في كل من الخلايا الجسمية وسلالة الجرثومية في الزرد 3،4. ويمكن لهذه التقنيات بكفاءة توليد الحيوانات المعدلة وراثيا، مع خلق طفرة عالية التردد، ونقل خط الجرثومية 3،4.

على الرغم من هذه التطورات، وتقنيات التنميط التقليدي في الزرد لحد من القوة الكاملة للالطفرات ونقل الجينات الأدوات. يتبع PCR بواسطة الكهربائي للهلام، جنبا إلى جنب في بعض الأحيان مع restrictioن انزيم الهضم، ويستخدم على نطاق واسع للكشف عن تعديل الجينوم، ولكن هو مضيعة للوقت وأقل حساسية لتحديد الإدراج أو الحذف صغيرة. المقايسات TaqMan التحقيق ديك التكاليف الأولية عالية وتتطلب حذرا الأمثل. تسلسل المنتجات PCR يمكن أن يستغرق عدة أيام وليس عملية لفحص واسعة النطاق. تقييد جزء طول تعدد الأشكال (RFLP) التحليل يمكن أن تميز فقط تعدد الأشكال التي تؤثر على مجموعة محدودة من المواقع الاعتراف انزيم التقييد.

تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA)، مغلقة أنبوب آخر-PCR تحليل الأسلوب، هو طريقة تم تطويرها مؤخرا أن يكون سريعا وحساسة، وغير مكلفة، وقابلة للفحص عدد كبير من العينات. HRMA يمكن استخدامها للكشف عن تعدد الأشكال، والطفرات، والجينات المحورة 5-7. ويستند HRMA على تمسخ الحرارية للسلطات الوطنية المعينة المزدوج تقطعت بهم السبل، ولكل AMPLICON PCR لديه تفارق فريد (تذوب) مميزة 5. عينات يمكن تمييز بسبب رس بهم تكوين مختلف النوكليوتيدات، والمحتوى GC، أو طول، وعادة في تركيبة مع صبغة الفلورسنت التي تربط فقط المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي 8. وبالتالي، يمكن التمييز بين الأنماط الجينية HRMA المختلفة استنادا إلى خصائص مختلفة تذوب منحنى. لأن HRMA يستخدم الكواشف منخفضة التكلفة ويبعد خطوة واحدة بعد PCR العملية، فإنه يمكن استخدامها لاستراتيجيات عالية الإنتاجية. HRMA هو غير تدميري، لذلك بعد تحليل يمكن استخدام amplicons PCR لتطبيقات أخرى. وقد تم تطبيق HRMA في العديد من الكائنات الحية والنظم، بما في ذلك خطوط الخلايا والفئران والبشر 9-11. وقد تم مؤخرا وصفت استخدامه في الزرد للكشف عن الطفرات المستحثة بواسطة nucleases إصبع الزنك (ZFNs) وTALENs 6،12،13.

في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية تنفيذ HRMA PCR القائم في الزرد الجنينية والكبار (الشكل 1). هذا البروتوكول هو مناسبة للكشف عن تعدد الأشكال، الجينات المحورة، والطفرات، بما في ذلك الاشتراكيةngle التغييرات قاعدة الزوج، والإدراج، أو حذف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الحمض النووي

  1. إعداد العازلة تحلل الحمض النووي: 50 ملي بوكل، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.3، 0.3٪ توين 20، 0.3٪ NP40. إضافة جديدة بروتين K إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في اليوم من استخدام 12.
  2. جمع الأنسجة:
    1. للبالغين كليب زعنفة السمك:
      1. تخدير الأسماك: ضع السمك في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار حتى يبطئ حركة الخيشومية.
      2. وضع السمك على كومة من 5-10 Kimwipes وقطع قطعة صغيرة من زعنفة الذيل، حوالي 2-3 مم، مع شفرة حلاقة معقمة.
      3. وضع بسرعة الأسماك في خزان المسمى مع المياه العذبة للانتعاش؛ تسمية بعناية كل من خزان وأنبوب المقابلة التي سوف تحتوي على مقطع الزعنفة. تغيير الماء وإطعام الأسماك كل يوم.
      4. التقاط مقطع زعنفة مع طرف ماصة معقمة وتحويلها في أنبوب مملوء 100 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي.
      5. تجاهل غيض ماصة، وتجاهل شفرة حلاقة في وعاء الحادة.
    2. لمقطع ذيل الجنين:
      1. وضع الأجنة في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار 2 دقيقة.
      2. قطع قطعة من الذيل مع ملقط تشريح تحت المجهر.
      3. وضع الذيل في أنبوب المسمى مليئة 30 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي.
      4. وضع الجنين بسرعة في أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪.
      5. أنابيب التسمية مع الأجنة وأنابيب ذيل يناظرها.
      6. تخزين الأنابيب مع الأجنة في 4 درجات مئوية خلال الليل لتثبيت.
      7. تنظيف ملقط باستخدام المياه الملة، س وKimwipes بين كل جنين للحد من التلوث.
    3. للأجنة كاملة:
      1. وضع الأجنة في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار 2 دقيقة.
      2. وضع الأجنة 1-5 في أنبوب مملوء 100 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي. Dechorionation ليست ضرورية.
  3. الهضم الحمض النووي
    احتضان الأنابيب مع الأنسجة (زعنفة الذيل أو مقاطع أو الأجنة) في 55 ° Cلمدة 4 ساعة تصل إلى 12 ليلة وضحاها.
  4. إبطال نشاط بروتين K
    أنابيب الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة 12. وينبغي استخدام الحمض النووي لPCR على الفور، أو تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

2. PCR

  1. الاشعال تصميم إما يدويا أو عن طريق التمهيدي تصميم البرمجيات (مثل Lightscanner التمهيدي تصميم البرمجيات Biofire). المنتجات PCR لHRMA وعادة ما تكون 50-200 سنة مضت ومنتجات PCR للكشف SNP يجب أن تكون أصغر حجما، وعادة 50-80 سنة مضت.
  2. PCR
    1. أداء تفاعل PCR في 96 جيدا أو جيدا 384 لوحة.
    2. استخدام 10 ميكرولتر اجمالى حجم: 4 ميكرولتر مزيج الرئيسي LightScanner (0.1 U الساخنة بدء طق-AB البلمرة، العازلة، 0.2 ملي dNTPs، 2 مم كلوريد المغنيسيوم، و 1X الفلورسنت صبغة ملزمة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل)؛ 5 بمول كل التمهيدي، و1 ميكرولتر قالب الحمض النووي الجيني المستخرجة من زعنفة الذيل الكبار أو 3 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني الذيل الجنينية 13.
    3. عينات الغطاء مع 30 ميكرولتر الزيوت المعدنية.
    4. تغطية لوحة مع ختم لاصقة شفافة بصريا.
    5. تحسين PCR الدراجات ظروف نموذجية الشروط هي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 30 دورات من 10 ثانية في 95 درجة مئوية، 25 ثانية في 60 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 درجة مئوية، وتنتهي مع 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وتبريده ل 15 ° C.
    6. متجر PCR لوحات في 4 درجة مئوية أو متابعة مباشرة إلى HRMA.
    7. تأكيد المنتج PCR لدينا من خلال تحليل حجمه باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام الأولي من خلال التحسين PCR، وإذا أشار، من خلال التسلسل للمنتج PCR.

3. HRMA

  1. لوحات الحرارة
    1. وضع لوحة في نظام تحليل تذوب.
    2. فتح البرنامج (LightScanner البرامج اتصل-IT 2.0).
    3. لوحات الحرارة 60-95 درجة مئوية.
    4. إنشاء ملف تخزين البيانات الجديدة.
  2. تحليل البيانات HRMA (الشكل 2).
    خطوات متعددة للتحليل ممكنة. نعرض مجموعة الأكثر استخداما من البيانات مanipulations.
    1. إعداد فرعية
      انقر فوق علامة التبويب مجموعة فرعية. حدد الآبار مع العينات.
    2. تطبيع
      1. حدد علامة التبويب تطبيع في اللوحة اليمنى. للقضاء على التباين مضان، ضع يدويا خط مزدوج موازية في مرحلة ما قبل (الأولي) ومناطق ما بعد (النهائي) تذوب كما هو موضح (الشكل 2C، النصال) وتطبيع premelt ومضان بعد ذوبان الإشارات من جميع العينات إلى 1 و 0 ، على التوالي 14.
      2. ضبط المواقع من خطوط بحيث المنطقة تذوب في المنطقة بين قبل وبعد ذوبان خطوط، ولكن لم يتم تحديد. بشكل عام، والحد الأدنى والحد الأقصى السفلى السفلى (وأعالي الحد الأدنى والأعلى ماكس) يجب وضع خطوط درجة الحرارة حوالي 1 درجة مئوية عن بعضها البعض.
      3. اختيار المناصب درجة الحرارة لتطبيع مثل أن جميع العينات يكون الحد الأقصى أو كاملة (100٪) مضان للمنطقة premelt والحد الأدنى أو لا (0٪) مضان للمنطقة بعد ذوبان (بأفضل ما نقاط البيعإيصال خدمات الإيداع). التطبيع يجب أن يؤدي في خط شبه أفقي في مضان أقصى 1 الذي يمتد حتى تذوب نقطة ثم خط أفقي بالقرب من نقطة ذوبان في الحد الأدنى من مضان 0؛ لا ينبغي أن يكون هناك مستويات مضان (1) أعلاه أو أدناه 0 . على سبيل المثال، في الشكل 2C، وتطبيع منحنيات premelting باستخدام تتراوح درجة الحرارة من 79-80 درجة مئوية.
    3. تجمع / تجميع
      تمييز الأنماط الجينية على أساس درجة حرارة انصهارها (الشكل 2C، المربع الأخضر). حدد التجمع.
      1. حدد Autogroup من القائمة اختيار المعايير تحت قسم التجمع.
      2. حدد عادي أو مرتفع للذوبان الشخصية مع التحولات واحدة أو متعددة التحولات على التوالي من قائمة اختيار حساسية تحت قسم التجمع.
      3. حدد حسابمجموعات تحت قسم التجمع.
      4. انتقل إلى القائمة ملف وانقر فوق حفظ لحفظ النتائج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بروتوكول لا يمكن أن يؤديها خلال يوم واحد أو فصل في خطوات على مدى عدة أيام (ويظهر الرسم البياني تدفق العمل في الشكل 1). ويتبع استخراج الحمض النووي من قبل ذوبان وتحليل amplicons PCR. درجات الحرارة للذوبان من AMPLICON تعتمد على حجم وGC-المحتوى، ولكن عموما تبدأ درجات الحرارة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

PCR جنبا إلى جنب مع HRMA هي تقنية قوية لالتنميط الجيني الزرد. مزايا هذا النهج هي سرعته، متانة، وحساسية للكشف عن الطفرات حتى النقطة. بروتوكول بأكمله، من زعنفة كليب التحليل لتذوب منحنى، لا يمكن أن يؤديها في أقل من ثماني ساعات من قبل فرد واحد. بالإضافة إلى ذلك، والتقنية هي ق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

نشكر أعضاء Blaschke، جرونوالد، وتوير مختبرات للحصول على المشورة والمساعدة التقنية. ويدعم هذا العمل من قبل مؤسسة PCMC، المعاهد الوطنية للصحة R01 MH092256 وDP2 MH100008، ومارس من الدايمات مؤسسة منحة بحثية # 1-FY13-425، لJLB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Reaction LightScanner Master MixBioFireHRLS-ASY-0002www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT PlatesBio-Rad LaboratoriesHSP9665www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive SealsBio-Rad LaboratoriesMSB1001www.bio-rad.com
96-well LightScanner InstrumentBioFireLSCN-ASY-0040www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0BioFirewww.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0BioFirewww.biofiredx.com
LightScanner Primer Design SoftwareBioFirewww.biofiredx.com
Vector NTI SoftwareInvitrogenwww.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde

References

  1. Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  2. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  3. Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  4. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  5. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
  6. Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
  7. Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
  8. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
  9. Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
  10. Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
  11. Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
  12. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  13. Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
  14. Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
  15. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
  16. Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
  17. Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
  18. Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

84 HRMA PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved