快速，高效的斑马鱼基因分型采用PCR与高分辨率熔体分析

摘要

PCR结合高分辨率的熔融分析（HRMA）被证明是一种快速，有效的方法，以斑马鱼的基因型。

摘要

斑马鱼是研究开发，造型疾病，并进行药物筛选功能强大的脊椎动物模型系统。最近的各种遗传工具的相继出台，其中包括诱导突变并产生转基因株系多种策略。然而，大规模的筛选是通过传统的基因分型方法，这是耗时耗力的限制。在这里，我们描述的技术来分析斑马鱼的基因型PCR结合高分辨率熔解分析（HRMA）。这种方法快速，灵敏，而且价格便宜，具有污染器物风险较低。基因分型的PCR与HRMA可以用于胚胎或成年鱼，包括高通量筛选的协议。

引言

斑马鱼（ 斑马鱼 ）是脊椎动物模型系统广泛用于开发和疾病模型的研究。最近，众多的转基因和基因突变技术已经开发了斑马鱼。快速的转基因技术，通常根据一个TOL2座子系统¹中，已合并为多个DNA片段组件²改进的克隆选择。锌指核酸酶（ZFN）和转录活化因子样效应物核酸酶（TALENS）已被用于靶向基因座在两个体细胞和生殖系细胞，斑马鱼^3,4。这些技术可以有效地产生转基因动物，具有高频突变的创建和种系传递^3,4。

尽管取得了这些进展，在传统的斑马鱼基因分型技术限制的诱变和转基因工具的全部功能。 PCR然后进行凝胶电泳，有时结合不受限制。Ñ​​酶消化，被广泛用于检测基因组的修饰，但很费时，并确定小插入或缺失不敏感。 TaqMan探针检测具有较高的初始成本，需要仔细优化。 PCR产物的测序可能需要几天时间，并且是不实用的大规模筛选。限制性片段长度多态性（RFLP）分析，只能判别影响的限制性内切酶识别位点的一个有限的范围内的SNP。

高分辨率熔解分析（HRMA），封闭管后的PCR分析方法，是一种最近开发的方法，该方法快速，灵敏，价格低廉，适合于筛选大量样品。 HRMA可用于检测单核苷酸多态性，突变，和转基因^5-7。 HRMA是基于双链DNA热变性，并且每个PCR扩增子具有唯一的解离（熔体）特性^5。样品可以分辨由于吨ø其不同的核苷酸组成，GC含量，或长度，通常在用荧光染料的组合，只有结合双链DNA ^8。因此，HRMA可以基于不同的熔融曲线的特征区分不同基因型。因为HRMA使用廉价的试剂和是一个单步PCR后的过程中，它可用于高通量的策略。 HRMA是破坏性的，所以下面的分析将PCR扩增子可以用于其他应用。 HRMA已在许多生物和系统，包括细胞系，小鼠和人类^9-11中得到应用。它的使用最近在斑马鱼被描述检测由锌指核酸酶（ZFN）和塔伦斯^6,12,13突变。

在本文中，我们将描述如何在胚胎和成年斑马鱼进行基于PCR的HRMA（ 图1）。这个协议是适合于检测单核苷酸多态性，转基因，和基因突变，包括SIngle碱基对的改变，插入或缺失。

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研究方案

1。 DNA的制备

1. 制备的DNA的裂解缓冲液：50mM的KCl，10mM的Tris-盐酸的pH 8.3，0.3％吐温20，0.3％NP40。加入新鲜的蛋白酶K至对使用¹²的天1毫克/毫升的最终浓度。
2. 组织收集：
   1. 对于成年鱼翅夹：
      1. 麻醉鱼：将鱼在0.004％的MS-222（三卡因）解决方案。等到鳃运动减慢。
      2. 把鱼放在一摞5-10的Kimwipes切一小片尾翼，约2-3毫米，用无菌刀片的。
      3. 迅速将鱼与淡水回收标记罐;仔细标注两个油箱和相应的管道将包含翅夹。换水及隔日喂鱼。
      4. 拿起翅片夹，用无菌移液管尖端，并将其转移到充满100μl的DNA的裂解缓冲液的管中。
      5. 丢弃枪头，并丢弃刀片成锐器容器。
   2. 胚胎长尾夹：
      1. 把胚胎成0.004％的MS-222（三卡因）溶液。等待2分钟。
      2. 切下一块尾部用解剖显微镜下用镊子。
      3. 把尾巴放入盛有30微升的DNA裂解液标记管。
      4. 赶紧把胚胎成含100微升4％多聚甲醛管。
      5. 标签管与胚胎和相应的尾管中。
      6. 存储与胚胎试管在4℃过夜固定。
      7. 使用，以减少污染的每个胚胎之间的Milli-Q水和清洁的Kimwipes的钳子。
   3. 对于整个胚胎：
      1. 把胚胎成0.004％的MS-222（三卡因）溶液。等待2分钟。
      2. 放1-5胚胎在充满100微升DNA的裂解缓冲液的管中。 Dechorionation是没有必要的。
3. DNA酶切
   孵育组织（鳍或尾巴夹或胚胎）试管在55℃下4小时到过夜^12。
4. 灭活蛋白酶K
   热管至95℃15分钟^12。 DNA应立即用于PCR，或储存在-20℃下长达3个月。

2。 PCR

1. 手动或通过引物设计软件（ 如 Lightscanner引物设计软件-Biofire）设计引物。 PCR产物为HRMA通常50-200个基点; PCR产物进行SNP检测应该是较小的，通常50-80个基点。
2. PCR
   1. 进行PCR反应在96孔或384孔板。
   2. 使用10μl的总体积：4微升LightScanner母液（0.1ü热启动Taq-AB聚合酶，缓冲液，0.2mM的dNTPs浓度，2mM的氯化镁，和1x荧光双链DNA结合染料）; 5pmol的各引物，从成年尾鳍或胚胎尾部¹³ 3微升基因组DNA提取1微升基因组DNA模板。
   3. 盖样品与30μl的矿物油。
   4. 用光学透明粘合剂密封覆盖板。
   5. 优化的PCR循环条件，典型的条件是95℃5分钟，10秒30个循环的95℃，25秒，60℃，30秒，72℃，结束与95℃30秒，并冷却至15℃。
   6. 商店PCR板在4℃或直接继续HRMA。
   7. 通过在PCR过程中的初始优化利用琼脂糖凝胶电泳的大小的分析证实了我们的PCR产物，以及如果所述，通过PCR产物的测序。

3。 HRMA

1. 热板
   1. 放置板在熔融分析系统。
   2. 打开软件（LightScanner软件呼叫的IT 2.0）。
   3. 从60-95℃，热板
   4. 创建一个新的数据存储文件。
2. 分析HRMA数据（ 图2）。
   分析的多个步骤是可能的。我们显示最常用的一组数据米anipulations。
   1. 子集设置
      单击子集标签。选择井样品。
   2. 正常化
      1. 在左边的面板中选择标准化选项卡。消除荧光方差，手动定位平行双线路的预（初始）和后（最终）熔融区域如图所示（ 图2C，箭头）和归一化所有样品的预熔融后和熔融的荧光信号，以1和0 ，分别为^14。
      2. 调整线的定位，以使熔化区是在该区域的前，后熔线之间，但没有被选中。在一般情况下，下民，下最大（和上最小和上最大）温度线应放置约1°C分开。
      3. 选择温度职位正常化，使得所有样品具有最大或满（100％）的荧光的预熔区和最小或无（0％）荧光为后熔融区域（尽量将POSsible）。正常化应该导致近水平线以1延​​伸，直到熔点，然后近水平线从在0的最小荧光熔融点的最大荧光;不应该有荧光水平高于1或0以下。例如，在图2C中 ，用79-80℃，温度范围内归一化的预熔化曲线
   3. 分组/集群
      区分基于其熔化温度（ 图2C，绿框）的基因型。选择分组 。
      1. 从下分组部分中的标准选择列表中选择Autogroup。
      2. 选择正常或高的单转换或多个过渡分别从灵敏度选择列表下的分组部分熔解图谱。
      3. 选择计算根据分组节组。
      4. 转到文件菜单，然后单击保存以保存结果。

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结果

可以在一天内进行，或在步骤分离出的协议数天（工作的流程图示于图1）。 DNA提取之后，通过PCR扩增子的熔化和分析。的温度为扩增子的熔化取决于大小和GC含量，但一般就50˚C和95˚C端的温度是适当的（ 图2A和2B）。一旦熔体被执行时，荧光熔融曲线的分析通常需要不同的样本曲线的变化的归一化，使用前和后的熔融区域作为标准（ 图2C）。这?...

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讨论

PCR结合HRMA是一种功​​能强大的技术，斑马鱼基因分型。这种方法的优点是它的速度，鲁棒性，以及灵敏度来检测偶数的点突变。整个协议，从翅片夹熔化曲线分析，可在少于八小时由个人执行的。此外，该技术是适合于高通量筛选;不需要使用溴化乙锭;和密封所有PCR和分析步骤，这有助于减少污染的问题。

这种技术的一个关键步骤是PCR扩增子和引物设计。典型的长度为PCR?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates	Bio-Rad Laboratories	HSP9665	www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive Seals	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	www.bio-rad.com
96-well LightScanner Instrument	BioFire	LSCN-ASY-0040	www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0	BioFire		www.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0	BioFire		www.biofiredx.com
LightScanner Primer Design Software	BioFire		www.biofiredx.com
Vector NTI Software	Invitrogen		www.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde