Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Resumen

PCR combinada con el análisis de fusión de alta resolución (HRMA) se demuestra como un método rápido y eficiente para determinar el genotipo de pez cebra.

Resumen

El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio del desarrollo, modelado de la enfermedad, y la realización de la detección de drogas. Recientemente se ha introducido una variedad de herramientas genéticas, incluyendo las múltiples estrategias para inducir mutaciones y la generación de líneas transgénicas. Sin embargo, el cribado a gran escala está limitada por los métodos de genotipificación tradicionales, que consumen mucho tiempo y mano de obra intensiva. Aquí se describe una técnica para analizar los genotipos de pez cebra mediante PCR en combinación con el análisis de alta resolución de fusión (HRMA). Este enfoque es rápido, sensible y de bajo costo, con menor riesgo de artefactos de contaminación. La genotipificación por PCR con HRMA se puede utilizar para los embriones o los peces adultos, incluidos en los protocolos de selección de alto rendimiento.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) es un sistema modelo de vertebrados ampliamente utilizada para estudios de desarrollo y modelado de la enfermedad. Recientemente, numerosas tecnologías transgénicas y de mutación se han desarrollado para el pez cebra. Técnicas de transgénesis rápida, generalmente basados ​​en un sistema transposón Tol2 ^1, se han combinado con mejores opciones de clonación para el montaje fragmento de ADN múltiple ^2. Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y de transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se han utilizado para dirigir los loci tanto en las células somáticas y de línea germinal en el pez cebra ^3,4. Estas técnicas pueden generar eficientemente animales modificados genéticamente, con la creación de mutación de alta frecuencia y la transmisión de la línea germinal ^3,4.

A pesar de estos avances, las técnicas de genotipado tradicionales en el pez cebra limitando la plena potencia de las herramientas de mutagénesis y transgénesis. PCR seguida de electroforesis en gel, a veces combinada con restriccioneN enzima de digestión, se utiliza ampliamente para detectar la modificación del genoma, pero consume tiempo y menos sensible para identificar pequeñas inserciones o deleciones. Ensayos con sondas TaqMan tienen altos costos iniciales y requieren una cuidadosa optimización. La secuenciación de los productos de la PCR puede tomar varios días y no es práctico para el cribado a gran escala. Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) sólo puede discriminar SNPs que afectan a una gama limitada de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.

Análisis de alta resolución de fusión (HRMA), un método de análisis post-PCR en tubo cerrado, es un método recientemente desarrollado que es rápido, sensible, de bajo costo, y es susceptible de análisis de gran número de muestras. HRMA se puede utilizar para detectar los SNPs, mutaciones, y los transgenes ^5-7. HRMA está basado en la desnaturalización térmica de los ADN de doble cadena, y cada uno de amplificación de PCR tiene un único disociación (fundir) característica ^5. Las muestras pueden ser discriminados por to su composición de nucleótidos diferente, contenido de GC, o longitud, típicamente en combinación con un colorante fluorescente que sólo se une de doble cadena de ADN ^8. Por lo tanto, HRMA puede distinguir diferentes genotipos en base a las diferentes características en estado fundido de la curva. Debido a HRMA utiliza reactivos de bajo costo y es un proceso de post-PCR de un solo paso, que puede ser utilizado para las estrategias de alto rendimiento. HRMA es no destructivo, por lo siguiente análisis de los amplicones de PCR se pueden utilizar para otras aplicaciones. HRMA se ha aplicado en muchos organismos y sistemas, incluyendo líneas celulares, ratones y seres humanos ^9-11. Su uso ha sido recientemente descrito en el pez cebra para detectar mutaciones inducidas por las nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y talens ^6,12,13.

En este trabajo se describe la forma de realizar HRMA PCR basada en el pez cebra embrionarias y adultas (Figura 1). Este protocolo es adecuado para la detección de SNPs, los transgenes, y mutaciones, incluyendo SINGLE cambios de pares de bases, inserciones o deleciones.

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Protocolo

1. Preparación de ADN

1. Preparar ADN tampón de lisis: 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Añadir fresco proteinasa K a una concentración final de 1 mg / ml en el día de uso ^12.
2. Colección de tejidos:
   1. Para el adulto clip de aleta de los pescados:
      1. Anestesie peces: Coloque el pescado en un 0,004% de MS-222 solución (tricaína). Espere hasta que el movimiento de enmalle se desacelera.
      2. Coloque el pescado en una pila de 5-10 Kimwipes y cortar un pequeño trozo de la aleta de la cola, de unos 2-3 mm, con una hoja de afeitar estéril.
      3. Coloque rápidamente a los peces en un tanque de la etiqueta con agua dulce para la recuperación; etiquetar cuidadosamente tanto el depósito y el tubo correspondiente que contendrá el clip de la aleta. Cambie el agua y alimentar a los peces todos los días.
      4. Levante el clip de la aleta con una punta de pipeta estéril y la transfiere en un tubo relleno con 100 l de tampón de lisis de ADN.
      5. Desechar la punta de la pipeta, y deseche la hoja de afeitar en un recipiente para objetos filosos.
   2. Para clip de la cola del embrión:
      1. Coloque embriones en 0,004% MS-222 solución (tricaína). Espere 2 min.
      2. Corte un pedazo de cola con pinzas bajo un microscopio de disección.
      3. Ponga la cola en un tubo etiquetado lleno de 30 l de tampón de lisis de ADN.
      4. Poner rápidamente el embrión en un tubo que contiene 100 l 4% de paraformaldehído.
      5. Marque los tubos con los embriones y sus tubos de cola correspondientes.
      6. Guarde los tubos con los embriones a 4 ° C durante la noche para la fijación.
      7. Limpie la pinza usando agua Milli-Q y Kimwipes entre cada embrión para minimizar la contaminación.
   3. Para los embriones enteros:
      1. Coloque embriones en 0,004% MS-222 solución (tricaína). Espere 2 min.
      2. Ponga 1-5 embriones en un tubo relleno con 100 l de tampón de lisis de ADN. Dechorionation no es necesario.
3. La digestión de ADN
   Incubar los tubos con tejido (o de aleta de cola clips o embriones) a 55 ° Cdurante 4 horas o hasta el día ^12.
4. Inactivar la proteinasa K
   Tubos de calor a 95 ° C durante 15 min ^12. ADN se debe utilizar para PCR inmediatamente o se almacenó a -20 ° C durante un máximo de 3 meses.

2. PCR

1. Primers diseño ya sea manualmente o mediante imprimación de software de diseño (por ejemplo Lightscanner Primer Software de Diseño-Biofire). Productos de la PCR para HRMA son generalmente 50-200 pb; productos de PCR para la detección de SNP deben ser más pequeñas, típicamente 50-80 pb.
2. PCR
   1. Realizar reacción de PCR en una placa de 96 pocillos o 384 pocillos.
   2. Utilice 10 l volumen total: 4 l mezcla maestra LightScanner (0,1 U hot-start Taq polimerasa-AB, tampón, dNTPs 0,2 mM, cloruro de magnesio 2 mM, y 1x colorante fluorescente de unión a ADN de doble cadena), 5 pmol de cada cebador, y 1 l de plantilla de ADN genómico extraído de aleta de la cola adulto o 3 l de ADN genómico de la cola embrionaria ^13.
   3. Muestras de cubierta con 30 l de aceite mineral.
   4. Cubra la placa con un sello adhesivo ópticamente transparente.
   5. Optimizar PCR ciclismo condiciones típicas de condiciones son de 95 ° C durante 5 min y 30 ciclos de 10 segundos a 95 ° C, 25 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, terminando con 95 ° C durante 30 segundos y se enfrió a 15 ° C.
   6. Tienda placas PCR a 4 ° C o siguen directamente a HRMA.
   7. Confirmar nuestro producto de PCR mediante el análisis de su tamaño utilizando electroforesis en gel de agarosa durante la optimización inicial de la PCR, y si está indicado, por secuenciación del producto de PCR.

3. HRMA

1. Placas de calor
   1. Coloque la placa en un sistema de análisis de fusión.
   2. Abra el software (Software LightScanner Call-IT 2.0).
   3. Placas de calor de 60-95 º C.
   4. Crear un nuevo archivo de almacenamiento de datos.
2. Analizar los datos HRMA (Figura 2).
   Son posibles varias etapas de análisis. Mostramos el conjunto de datos m más utilizadoanipulations.
   1. Ajuste de subconjuntos
      Haga clic en la pestaña de subconjuntos. Seleccione los pocillos con muestras.
   2. Normalización
      1. Seleccione la pestaña Normalizar en el panel izquierdo. Para eliminar la varianza de fluorescencia, coloque manualmente la doble línea paralela en pre-(inicial) y las regiones posteriores (final) de fusión, como se ilustra (Figura 2 C, puntas de flecha) y normalizar Premelt y fluorescencia después de la fusión en las señales de todas las muestras a 1 y 0 , respectivamente ^14.
      2. Ajuste la posición de las líneas de modo que la región de fusión es en la región entre los pre-y post-fusión en las líneas, pero no se selecciona. En general, el Min Baja y el Bajo Max (y Superior y Superior Min Max) líneas de temperatura se deben colocar aproximadamente 1 ° C de diferencia.
      3. Elija posiciones de temperatura para la normalización de tal manera que todas las muestras tienen (100%) de fluorescencia máxima o total de la región Premelt y mínima o ninguna (0%) de fluorescencia para la región de post-fusión (como mejor como POSble). La normalización debería dar lugar a una línea casi horizontal en la fluorescencia máxima de 1 que se extiende hasta el punto de fusión y luego una línea casi horizontal desde el punto de fusión a la fluorescencia mínima de 0, no debería haber niveles de fluorescencia por encima o por debajo de 1 0 . Por ejemplo, en la Figura 2C, normalizar las curvas de fusión previa usando los rangos de temperatura de 79-80 ° C.
   3. Agrupación / Clustering
      Distinguir los genotipos en función de su temperatura de fusión (Figura 2 C, caja de color verde). Seleccione Agrupación.
      1. Seleccione Autogroup de la lista de selección de Normas en la sección Agrupación.
      2. Seleccione Normal o Alta para la fusión de perfiles con transiciones individuales o múltiples transiciones, respectivamente, desde la lista de selección de sensibilidad en la sección Agrupación.
      3. Seleccionar ComputeGrupos menores de la sección Agrupación.
      4. Vaya al menú Archivo y haga clic en Guardar para guardar los resultados.

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Resultados

El protocolo se puede realizar durante un solo día o separado en pasos lo largo de varios días (diagrama de flujo de trabajo se muestra en la Figura 1). La extracción de ADN es seguido por la masa fundida y el análisis de los amplicones de PCR. Las temperaturas de la masa fundida del amplicón dependen del tamaño y contenido de GC, pero generalmente comienzan y las temperaturas extremas de 50 ˚ C y 95 ˚ C son apropiadas (Figuras 2A y 2B). Una vez que se realiza l...

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Discusión

PCR combinada con HRMA es una tecnología de gran alcance para el genotipado de pez cebra. Las ventajas de este enfoque son su velocidad, robustez, y la sensibilidad para detectar incluso mutaciones puntuales. El protocolo de todo, desde el análisis hasta derretir curva fin-clip, se puede realizar en menos de ocho horas por un solo individuo. Además, la técnica es susceptible de cribado de alto rendimiento; no requiere el uso de bromuro de etidio, y se sella para todos PCR y pasos de análisis que ayuda a minimizar l...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates	Bio-Rad Laboratories	HSP9665	www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive Seals	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	www.bio-rad.com
96-well LightScanner Instrument	BioFire	LSCN-ASY-0040	www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0	BioFire		www.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0	BioFire		www.biofiredx.com
LightScanner Primer Design Software	BioFire		www.biofiredx.com
Vector NTI Software	Invitrogen		www.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde