Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zusammenfassung

PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) als schnelle und effiziente Methode, um Zebrafisch-Genotyp nachgewiesen.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Entwicklung, Modellierung Krankheit und Arzneimittel-Screening durchführen. Kürzlich wurde eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen eingeführt, darunter mehrere Strategien zur Induktion von Mutationen und zur Erzeugung transgener Linien. Jedoch wird großen Screening durch Genotypisierung traditionellen Methoden, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind begrenzt. Hier beschreiben wir eine Technik, um Zebrafisch-Genotypen durch PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) zu analysieren. Dieser Ansatz ist eine schnelle, empfindliche und preiswert, mit einem geringeren Risiko der Kontamination Artefakte. Genotypisierung mittels PCR mit HRMA für Embryonen oder ausgewachsene Fische verwendet werden, auch im Hochdurchsatz-Screening-Protokolle.

Einleitung

Zebrafisch (Danio rerio), ein Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der weithin Entwicklung und Krankheit Modellierung verwendet. Kürzlich wurden zahlreiche transgenen und Mutationstechniken für Zebrafisch entwickelt. Rapid-Techniken Transgenese, in der Regel auf einem Tol2 Transposonsystem ¹ basiert, haben mit verbesserten Klonen Optionen für mehrere DNA-Fragment Anordnung ² zusammengefasst. Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) verwendet worden, um Loci in beiden somatischen und Keimbahnzellen im Zebrafisch ^3,4 Ziel. Diese Techniken können effizient genetisch veränderte Tiere zu erzeugen, mit Hochfrequenz-Mutation Erstellung und Keimbahn-Übertragung ^3,4.

Trotz dieser Fortschritte, traditionelle Techniken, Genotypisierung im Zebrafisch begrenzen die volle Leistung der Mutagenese und Transgenese-Tools. PCR, gefolgt von Gelelektrophorese, manchmal kombiniert mit EINSCHRÄNKn Enzymverdauung, wird häufig zur Modifikation Genom nachzuweisen, ist jedoch zeitaufwendig und weniger empfindlich gegenüber kleinen Insertionen oder Deletionen zu identifizieren. TaqMan-Sondentests haben eine hohe Anfangskosten und erfordern eine sorgfältige Optimierung. Die Sequenzierung von PCR-Produkten kann mehrere Tage dauern und ist nicht praktisch für große Screening. Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse kann nur unterscheiden SNPs mit Auswirkungen auf eine begrenzte Anzahl von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen.

Hochauflösende Schmelzanalyse (HRMA), eine geschlossene Röhre Post-PCR-Analyseverfahren, ist eine kürzlich entwickelte Methode, die schnell, empfindlich, kostengünstig und zugänglich Screening einer großen Anzahl von Proben. HRMA kann verwendet werden, um SNPs, Mutationen und Transgene ^5-7 zu erkennen. HRMA auf die thermische Denaturierung von doppelsträngigen DNAs basiert, und jedes PCR-Amplicon eine eindeutige Dissoziation (Schmelze) Kennlinie ^5. Die Proben unterschieden werden durch to ihrer unterschiedlichen Nukleotid-Zusammensetzung, GC-Gehalt, oder Länge, in der Regel in Kombination mit einem Fluoreszenz-Farbstoff bindet, die nur doppelsträngige ^DNA-8. Somit kann HRMA verschiedenen Genotypen basierend auf den unterschiedlichen Schmelzkurvencharakteristika unterscheiden. Da HRMA verwendet Low-Cost-Reagenzien und ist eine Einzelschritt-Post-PCR-Verfahren, kann es für Hochdurchsatz-Strategien verwendet werden. HRMA ist nicht destruktiv, so dass folgende Analyse die PCR-Produkte auch für andere Anwendungen verwendet werden. HRMA in vielen Organismen und Systeme, einschließlich Zelllinien, Mäusen und Menschen ^9-11 angewandt. Sein Einsatz hat kürzlich im Zebrafisch beschrieben worden, um Mutationen, die durch Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Talens ^6,12,13 induziert wird.

In diesem Papier beschreiben wir, wie man auf PCR-Basis HRMA in embryonalen und adulten Zebrafisch (Abbildung 1) durchzuführen. Dieses Protokoll ist für die Detektion von SNPs, Transgene, und Mutationen, einschließlich single Basenpaar-Veränderungen, Insertionen oder Deletionen.

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Protokoll

1. DNA-Präparation

1. Vorbereitung DNA Lysepuffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Frisches Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml am Tag der Verwendung ^12.
2. Tissue Sammlung:
   1. Für erwachsene Fischflosse Clip:
      1. Anesthetize Fisch: Den Fisch in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie, bis Kiemenbewegung verlangsamt.
      2. Setzen Sie Fisch auf einem Stapel von 5-10 Kimwipes und schneiden Sie ein kleines Stück der Schwanzflosse, ca. 2-3 mm, mit einer sterilen Rasierklinge.
      3. Schnell stellen die Fische in einem markierten Tank mit Frischwasser für die Wiederherstellung, sorgfältig beschriftet sowohl den Tank und Schlauch, der den entsprechenden fin Clip enthalten wird. Wechseln Sie das Wasser und die Fische füttern jeden zweiten Tag.
      4. Nehmen Sie den Fin-Clip mit einer sterilen Pipettenspitze und übertragen sie in ein Rohr mit 100 ul DNA-Lyse-Puffer gefüllt.
      5. Entsorgen Sie die Pipettenspitze, und entsorgen Sie die Rasierklinge in einen Behälter für scharfe Gegenstände.
   2. Für Embryo Schwanz-Clip:
      1. Zeigen Embryonen in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie 2 min.
      2. Schneiden Sie ein Stück Schwanz mit einer Pinzette unter einem Binokular.
      3. Setzen Sie den Schwanz in ein beschriftetes Röhrchen mit 30 ul DNA-Lyse-Puffer gefüllt.
      4. Setzen schnell den Embryo in ein Röhrchen mit 100 ul 4% Paraformaldehyd.
      5. Beschriften Sie die Röhrchen mit Embryonen und ihre entsprechenden Endrohre.
      6. Die Röhrchen mit Embryonen bei 4 ° C über Nacht zur Fixierung.
      7. Reinigen Sie die Zange mit Milli-Q-Wasser und Kimwipes zwischen jedem Embryo auf Kontamination zu minimieren.
   3. Für ganze Embryonen:
      1. Zeigen Embryonen in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie 2 min.
      2. Setz 1-5 Embryonen in einem Rohr mit 100 ul DNA-Lysepuffer gefüllt. Dechorionation ist nicht erforderlich.
3. DNA-Verdau
   Rohre mit Gewebe (fin oder Schwanz Clips oder Embryonen), bei 55 ° C inkubieren4 Stunden bis zu ¹² über Nacht.
4. Inaktivierung der Proteinase K
   Wärmerohren auf 95 ° C für 15 min ^12. DNA für die PCR sollte sofort verwendet werden oder bei -20 ° C für 3 Monate gelagert.

2. PCR

1. Design-Primer entweder manuell oder durch Primer-Design-Software (zB Lightscanner Primer-Design-Software-Biofire). PCR-Produkte sind in der Regel für HRMA 50-200 bp, PCR-Produkte für die SNP-Nachweis sollte kleiner sein, in der Regel 50-80 bp.
2. PCR
   1. Führen Sie die PCR-Reaktion in einem 96-Well oder 384-Well-Platte.
   2. Verwenden Sie 10 ul Volumen: 4 ul LightScanner Master-Mix (0,1 U Hot-Start Taq-AB-Polymerase, Puffer, 0,2 mM dNTPs, 2 mM Magnesiumchlorid und 1x Leuchtstoffdoppelstrang-DNA-bindenden Farbstoff), 5 pmol von jedem Primer, und 1 ul genomische DNA-Vorlage aus adulten Schwanzflosse oder 3 ul genomischer DNA aus embryonalen Schwanz ¹³ extrahiert.
   3. Titel Proben mit 30 ul Mineralöl.
   4. Die Platte mit einem optisch transparenten Klebesiegel.
   5. Optimierung der PCR-Zyklusbedingungen sind typische Bedingungen 95 ° C für 5 min und 30 Zyklen von 10 s bei 95 ° C, 25 sec bei 60 ° C, 30 sec bei 72 ° C, endend mit 95 ° C für 30 sec und gekühlt 15 ° C.
   6. Speicher PCR-Platten bei 4 ° C oder direkt weiter HRMA.
   7. Bestätigen unsere PCR-Produkt durch Analyse seiner Größe unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese bei der ersten Optimierung der PCR, und, wenn angegeben, durch Sequenzierung des PCR-Produkts.

3. HRMA

1. Wärmeplatten
   1. Zeigen Platte in einem Schmelzanalyse-System.
   2. Öffnen Sie die Software (Software LightScanner Call-IT 2.0).
   3. Wärmeplatten von 60 bis 95 ° C
   4. Erstellen Sie einen neuen Datenspeicher-Datei.
2. Analysieren HRMA Daten (Abbildung 2).
   Mehrere Analyseschritte möglich sind. Wir zeigen die am häufigsten verwendeten Satz von Daten manipulations.
   1. Subset-Einstellung
      Klicken Sie auf Subset-Registerkarte. Wählen Sie die Vertiefungen mit Proben.
   2. Normalisierung
      1. Wählen Sie die Registerkarte Normalisieren in der linken Panel. Um Fluoreszenz Varianz zu beseitigen, manuell positionieren Sie den parallelen Doppellinie in der Vor-(initial) und Post (final) Schmelz Regionen dargestellt (2C, Pfeilspitzen) und normalisieren Vorschmelze und Post-Schmelze Fluoreszenzsignale aller Proben 1 und 0 bzw. ^14.
      2. Einstellen der Positionierung der Leitungen, so daß der Schmelzbereich in dem Bereich zwischen den Pre-und Post-Schmelzeleitungen, aber nicht ausgewählt. Im Allgemeinen ist die Nieder Min-und Max Nieder (und Ober Min-und Max Ober) Temperaturleitungen sollten getrennt aufgestellt werden, etwa 1 ° C.
      3. Wählen Temperatur Positionen für die Normalisierung, so dass alle Proben Maximum oder voll (100%) für die Fluoreszenz Vorschmelze Region und minimale oder gar keine (0%) Fluoreszenz für die Post-Schmelzbereich (am besten wie möglichlich). Die Normalisierung sollte in einer nahezu horizontalen Linie bei der maximalen Fluoreszenz von 1, die bis zum Schmelzpunkt und dann eine nahezu horizontale Linie aus der Schmelze Punkt bei der minimalen Fluoreszenz von 0 erstreckt sich führen, es sollte nicht Fluoreszenzwerte über 1 oder unter 0 sein . Beispielsweise in Fig. 2C, normalisieren die Vorschmelztemperatur Kurven mit Temperaturbereichen von 79-80 ° C.
   3. Gruppierung / Clustering
      Unterscheiden Genotypen basierend auf ihren Schmelztemperatur (2C, grün Kasten). Wählen Sie Gruppierung.
      1. Wählen Sie aus dem Autogroup Standards Auswahlliste unter dem Abschnitt Gruppierung.
      2. Wählen Sie Normal oder Hoch zum Schmelzen Profile mit einzelnen Übergänge oder mehrere Übergänge jeweils von der Empfindlichkeit Auswahlliste unter dem Abschnitt Gruppierung.
      3. Wählen ComputeGruppen unter der Gruppierung Abschnitt.
      4. Gehen Sie auf das Menü Datei und klicken Sie auf Speichern, um die Ergebnisse zu speichern.

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Ergebnisse

Das Protokoll kann an einem einzigen Tag über mehrere Tage durchgeführt wird oder in Stufen getrennt (Flußdiagramm der Arbeit ist in Fig. 1 gezeigt). Die DNA-Extraktion wird durch die Schmelze und Analyse von PCR-Amplikons, gefolgt. Die Temperaturen für die Schmelze des Amplikons sind abhängig von der Größe und der GC-Gehalt, aber in der Regel Anfang und Ende Temperaturen von 50 ˚ C und 95 ˚ C falls (2A und 2B) sind. Sobald die Schmelze durchgeführt wird, die ...

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Diskussion

PCR in Kombination mit HRMA ist eine leistungsstarke Technologie für die Zebrafisch-Genotypisierung. Die Vorteile dieses Ansatzes sind seine Geschwindigkeit, Robustheit und Empfindlichkeit, auch Punktmutationen. Das gesamte Protokoll, aus fin-Clip zum Schmelzkurvenanalyse kann in weniger als acht Stunden von einer einzelnen Person durchgeführt werden. Darüber hinaus ist die Technik zugänglich für Hochdurchsatz-Screening, die Verwendung von Ethidiumbromid nicht erforderlich, und wird für alle PCR und Analyseschritt...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates	Bio-Rad Laboratories	HSP9665	www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive Seals	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	www.bio-rad.com
96-well LightScanner Instrument	BioFire	LSCN-ASY-0040	www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0	BioFire		www.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0	BioFire		www.biofiredx.com
LightScanner Primer Design Software	BioFire		www.biofiredx.com
Vector NTI Software	Invitrogen		www.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde