التجميعي السريع وفحص عوامل النسخ المنشط كيميائيا مع مراسلون القائم GFP

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء التجارب لبناء السريع للعوامل النسخ الاصطناعي (ATFs) مع صحفيين GFP وما شابه ذلك والكمي للقدرة ATFs لتحفيز GFP التعبير عبر التدفق الخلوي.

Abstract

يهدف البيولوجيا الاصطناعية لتصميم وبناء دوائر بعقلانية الاصطناعية مع الخصائص الكمية المطلوبة، فضلا عن توفير الأدوات اللازمة لاستجواب هيكل دوائر التحكم الأصلية. في كلتا الحالتين، يمكن للبرنامج القدرة على التعبير الجيني بطريقة سريعة والانضباطي، مع عدم وجود آثار خارج الهدف، تكون مفيدة. لقد شيدت سلالات الخميرة التي تحتوي على ACT1 مروج المنبع من شريط URA3 تليها المجال ملزم يجند من مستقبلات هرمون الاستروجين الإنسان وVP16. عن طريق تحويل هذه السلالة مع منتج PCR الخطية التي تحتوي على الحمض النووي ملزم مجال اختيار وضد وجود URA3، يمكن أن تتولد عامل النسخ الاصطناعية أعرب جوهري (ATF) من خلال إعادة التركيب مثلي. ATFs هندسيا في هذا الشكل يمكن تنشيط الجينات المستهدفة فريدة من نوعها في وجود محفز، وبالتالي القضاء على كل من التنشيط بعيدا عن الهدف وظروف النمو nonphysiological وجدت مع conditi استخدامانظم التعبير الجيني اونال. وتقدم أيضا هناك طريقة بسيطة لبناء السريع للالبلازميدات مراسل GFP التي تستجيب تحديدا إلى عامل النسخ الأصلية أو اصطناعية من الفائدة.

Introduction

وضع مفاتيح الوراثية في الخميرة هي ذات أهمية كبيرة في البحوث الأكاديمية والصناعية على حد سواء. في الحالة المثالية، ومفاتيح الوراثية يمكن استخدامها لتنشيط جينات معينة (أو مجموعة من الجينات) فقط عندما المرجوة من قبل المجرب. لا يتم التعبير الترميز تسلسل الجين وضعت المصب من المروج الاصطناعية في حال عدم وجود جزيء حمل: عند إضافة محفز ينبغي التعبير عن الجين بسرعة. وقد تم مؤخرا فقط تبين أن مثل هذا التحول يمكن هندستها في الخميرة، حيث في حالة عدم وجود محفز، يعرض سلالة النمط الظاهري الحذف، ولكن في وجود محفز، يتم تنشيط التعبير بما يتناسب مع مستوى محفز في جميع الخلايا ^1،2. تاريخيا، وقد اعتمدت أنظمة التعبير الشرطي في الخميرة بشكل كبير على تسلسل الحمض النووي المغذيات استجابة، بما في ذلك MET، PHO، والمروجين GAL (التي تعتبر أنشطتها الحساسة لمستويات خارج الخلية من ميثيونين والفوسفات، والجالاكتوز، على التوالي). بينما التعبير الشرطي لا يمكن أن يتحقق، لأنه يأتي على حساب الآثار عديد المظاهر الهامة.

وقد أثبتت مستقبلات هرمون مثل مستقبلات هرمون الاستروجين الإنسان أن تكون مفاتيح فعالة في حقيقيات النوى ^3،4. في غياب هرمون، وهو بروتين تنصهر لمستقبلات هرمون يمكن عزلها في السيتوبلازم حيث يتفاعل مع مجمع كوصي Hsp90. عند ملزم يجند المناسبة، ومستقبلات تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين جزئي، الامر الذي ادى الى ان يفرج عنها من مجمع كوصي Hsp90 والكشف عن إشارة توطين النووية. لمراقبة ديناميات توطين هرمون البروتين التي تحتوي على مستقبلات خاصة، أنشأنا الانصهار C-محطة من Gal4dbd.ER.VP16 (GEV، عامل النسخ الاصطناعية التي تحتوي على المجال ملزمة Gal4p الحمض النووي، والمجال ملزم يجند من مستقبلات هرمون الاستروجين الإنسان وVP16) مع GFP ^2. ولوحظ توطين النووية في غضون 8 دقائق التالية بالإضافة للتشبع مبالغ محفز، ß-استراديول، إلى أي نوع الخميرة البرية خاملة تماما. قبل هذا الوقت، فإن غالبية الخلايا لديها واضحة للعيان مواقع النسخ نشطة لالجينات المستهدفة GEV (يعاير عبر مضان التهجين في الموقع)، وكذلك mRNAs وناضجة تماما ^2،5. زيادة GEV الجينات المستهدفة في التعبير> 2 أضعاف في غضون 2.5 دقيقة ^2،6 (تقاس باستخدام ميكروأرس)، مما يدل على ان الامر يستغرق <2.5 دقيقة للالمنشط خيالية لنقل من إلى النواة، ربط الحمض النووي، وتفعيل النسخ.

بينما العديد من الآخرين على مفاتيح طبقت في الخميرة التي تستخدم مختلف الجزيئات الصغيرة أو المخدرات (بما في ذلك مفاتيح القائم الدوكسيسيكلين الكلاسيكية من الإشريكية القولونية ^7،8 والتبديل القائم على النيلي ⁹ من نبات الأرابيدوبسيس thaliana)، قد حققت أي سرعة، خصوصية، أو ضيق التنظيم التي أظهرتها مفاتيح القائم على الهرمون. ومن الجدير بالذكر رقبعة السريع قد وضعت أيضا إيقاف مفاتيح في الخميرة، وعادة العمل عن طريق دمج الجينات إلى البروتيني أو اليوبيكويتين يغاز استهداف تسلسل ^{2،10،11،12.} القدرة على إزالة بسرعة بروتين الهدف من الخلية يسهل دراسة الجينات الأساسية فضلا عن الجينات التي تكون عرضة لقمع الوراثية عند حذف ^10.

الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول هي لبناء وتوصيف الاصطناعية على مفاتيح في الخميرة. الأولى، وتبين لنا كيفية توليد بسرعة البروتينات الانصهار متكاملة genomically تتكون من مجال الحمض النووي ملزم من الفائدة، ويجند المجال من مستقبلات هرمون الاستروجين الإنسان الملزمة، وVP16 (DBD-EV في). بعد بروتوكول لدينا، يتم التعبير عن انصهار بروتين من المروج ACT1. نحن ثم تظهر كيفية إنشاء مراسل البلازميد وما شابه ذلك لATF واختبار وظائفه باستخدام التدفق الخلوي. على الرغم من أننا نتصور هذه البلازميدات مراسل المستخدمة مع ATFs جديدة (الشكل 1)، وأنها يمكن أن به تستخدم للصحفيين للحصول على المنشط النسخي الأم كذلك. أخيرا، يتم توفير تفاصيل لاختبار تأثير التنشيط ATF على نمو الخلايا في لوحات 96 جيدا وللهندسة الأليلات الجيني محرض.

Protocol

ويقدم الشكل 2 التخطيطي الأقسام بروتوكول 1-3.

1. إنشاء ATFs

1. إنشاء الاشعال PCR لتضخيم الحمض النووي ملزم المجال من الفائدة. يضاف إلى التماثل المروج ACT1 ومستقبلات هرمون (كما هو موضح في الشكلين 3 و 4) من خلال PCR لتسهيل إعادة التركيب الصحيح في سلالة yMN15.
2. PCR تضخيم DBD الاهتمام باستخدام البلمرة الدقة العالية.
3. تحويل> 1 ميكروغرام من الناتج PCR المنقى في الخميرة باستخدام طريقة خلات الليثيوم ^13.
4. بعد التحول، والخلايا تدور في سرعة قصوى لمدة 15 ثانية في ميكروسنتريفوج وإزالة مزيج التحول.
5. ~ resuspend في 200 ميكرولتر من الماء المعقم وعلى لوحة YPD.
6. في اليوم التالي، لوحة طبق الأصل من YPD على لوحات 5 FOA (لوحات مصنوعة 5 FOA كما هو موضح في دليل الخميرة كولد سبرينج هاربور) ^13.
7. يسمح النمو لمدة 2-4 دAYS، وrestreak 5-10 على الأقل المستعمرات على YPD. إجراء PCR مستعمرة باستخدام بادئات في الجدول 1 وتسلسل للتحقق من إدراج.

2. إنشاء ATF البلازميد مراسل

1. تحديد موقع ملزم للATF (على الأرجح أن يأتي من الأدب).
2. الترتيب المطلوب ملزمة المنطقة كما oligos (أو Ultramers، إذا لزم الأمر). كما تأمر أعلى وأسفل مع فروع يتدلى الصحيح لNOTI وXbaI كما هو مبين في الجدول رقم 2.
3. تمييع oligos لتركيزات متساوي المولية (100 ميكرومتر).
4. الفوسفات باستخدام T4 كيناز عديد النوكليوتيد ثم يصلب في thermocycler. ظروف التفاعل في الجدول 3.
5. ملخص ~ 1-2 ميكروغرام من pMN8 مع NOTI-HF وXbaI لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (ظروف التفاعل في الجدول رقم 4).
6. هلام تنقية الفرقة العمود الفقري.
7. تمييع العمود الفقري المنقى إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر.
8. تمييع المزدوج تقطعت بهم السبل، فسفوريلated موقع ملزم إلى 5x التركيز المولي من العمود الفقري لكل ميكرولتر.
9. باستخدام الحمض النووي يغاز T4، ligate مواقع الربط في العمود الفقري هضمها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (الجدول 5).
10. للتحول، إضافة نصف التفاعل ربط إلى 50 ميكرولتر من معيار، القولونية المختصة كيميائيا مثل XL1 أزرق أو DH5 ألفا.
11. خلايا الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية في 42 ° C حمام الماء ومن ثم وضع على الجليد لمدة 2 دقيقة.
12. إضافة 900 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب متوسطة إلى رد فعل التحول.
13. تنمو عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على طبل الدوارة.
14. تنتشر الخلايا 100-200 ميكرولتر لكل LB + AMP (100 ميكروغرام / مل) لوحة واحتضان بين عشية وضحاها.
15. يكبر E. القولونية في LB + AMP الحمض النووي البلازميد السائل والحصاد. تسلسل التحقق من جديد مراسل البلازميد من المستعمرات ربط باستخدام التمهيدي 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 '.
16. تحويل جديدة مراسل البلازميد الى المحتوية على الخميرة شارع ATFعين من القسم 1 باستخدام الليثيوم خلات التحول.

3. قياس تأثير ATF الحث على التعبير الجيني باستخدام GFP مراسل

إعداد العينات:

1. جعل 25 ملي الأسهم β-استراديول (10 مل من الايثانول + 0.0681 غرام من β-استراديول). يحفظ في الثلاجة.
2. تنمو ATF + مراسل المحتوية على سلالة بين عشية وضحاها في 5ML SC-URA.
3. الحصول على تسع 250 مل يهز قوارير وإضافة 25 مل SC-URA على كل منها.
4. إضافة 0 نانومتر، 0.1 نانومتر، 1 نانومتر و 10 نانومتر، 100 نانومتر، 1 ميكرومتر، 10 ميكرومتر أو β-استراديول. يتم ذلك بسهولة عن طريق جعل التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف من 25 ملي الأسهم β-استراديول. لتركيز النهائي من 10 ميكرومتر β-استراديول، إضافة 10 ميكرولتر من 25 ملي الأسهم β-استراديول إلى 25 مل من SC-URA.
5. إضافة 125 ميكرولتر من الثقافات بين عشية وضحاها لقوارير (1:200 تمييع).
6. ل2 القوارير المتبقية، مع تطعيم التأسيسية GFP إنتاج الاجهادن وسلالة تفتقر GFP. هناك حاجة لهذه لمعايرة تدفق عداد الكريات.
7. يهز في 200 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية لمدة 12-18 ساعة.
   ملاحظة: يتم تحديد فترة حضانة الأمثل من خلال تحديد عندما GFP تحريض التغييرات التالية لم تعد إضافة β-استراديول.
8. تأخذ 500 ميكرولتر من كل ثقافة وتدور باستمرار في أنابيب 1.7 مل ميكروسنتريفوج منفصلة.
9. نضح SC-URA.
10. يغسل مرة واحدة في 1 مل PBS +0.1٪ توين 20 ونضح.
11. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني +0.1٪ توين 20 و resuspend.
12. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني +0.1٪ توين 20 لأنابيب فالكون.
13. إضافة خلايا معلق إلى 5 مل أنابيب (الحجم النهائي = 2 مل) (يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أيام).
14. اختياري: خلايا يصوتن برفق لتفكك خلايا أي تجمعت.
    تحليل التدفق الخلوي: نظرة عامة: عادة ما يتم تحليل مضان من الخلايا 10،000-100،000 لكل عينة. يمكن معالجة البيانات إما في FlowJo أو باستخدام البرامج النصية المخصصة في MATLAB أوR. تأكد من معايرة الجهد للقناة GFP باستخدام GFP الضوابط الإيجابية والسلبية. مرة واحدة ويتم تصدير الملفات FCS، برنامج نصي مثل واحد في الشكل (6) جنبا إلى جنب مع fca_readfcs ظيفة ( http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader ) يمكن استخدامها لمعالجة البيانات.
15. أداء التدفق الخلوي.
    1. استخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) لتحديد خلايا الخميرة.
    2. ضبط معدل تدفق إلى ~ 3،000 خلية / ثانية.
    3. قياس GFP (قناة FITC).
    4. مرة واحدة يتم جمع البيانات، تصدير ملفات FCS
16. تحميل MATLAB.
17. نقل ملفات FCS، fcs_readfcs.m، والسيناريو مماثلة لتلك التي من الشكل (6) إلى نفس المجلد.
18. تغيير دليل العمل الحالي إلى المجلد الذي يحتوي على البيانات والبرامج النصية.
19. تشغيل البرنامج النصي من الشكل (6) (ملاحظة: للوقد أسطورة إدخالها يدويا لإنتاج ما رأينا في الشكل 7).

4. قياس تأثير ATF الحث على نمو الخلايا

1. من الأسهم المجمدة، خط خارج على حد سواء (1) سلالة المحتوية على ATF و (2) على سلالة تفتقر ATF (مثل yMN15) على لوحات YPD منفصلة.
2. 2 بعد أيام من النمو، وتطعيم الثقافة أنابيب منفصلة تحتوي على 5 مل من YPD السائل مع كل سلالة وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
3. تنفيذ 10 أضعاف التخفيفات المسلسل من 0.25 ملي محلول المخزون β-استراديول تصل إلى 10،000 أضعاف (0.025 ميكرومتر β-استراديول) في الإيثانول بنسبة 100٪.
4. إضافة 40 ميكرولتر من الثقافات بين عشية وضحاها إلى 10 مل من YPD السائل (1-250 التخفيف).
5. لكل سلالة، إضافة 96 ميكرولتر من الخلايا المخفف إلى 18 بئرا من 96 لوحة جيدا.
6. إضافة 4 ميكرولتر من β-استراديول إلى الخلايا. فإن النقطة الأساسية هي للتأكد من كل بئر لديه نفس القدر من مجموع الايثانول. (بدلا من ذلك، وهو مو إعادة مركزة من الاسهم β-استراديول يمكن استخدامها في وقت لاحق والمخفف لدرجة تأثير الايثانول على النمو ليست قابلة للقياس).
7. أداء في ثلاث نسخ. ثلاثة من آبار لكل سلالة ينبغي أن تكون الضوابط الايثانول فقط.
8. تغطية لوحة 96 جيدا في غشاء نفاذية الغاز.
9. رصد النمو (OD ₆₀₀₎ في قارئ لوحة.
10. قياس معدلات النمو باستخدام أي عدد من الطرق القياسية مثل إيجاد أقصى المنحدر.
    ملاحظة: لقد كان لدينا نجاح جيدة مع حزمة برامج مفتوحة المصدر grofit ^14، والذي يعمل في بيئة البرمجة R ومن الجدير بالذكر أنه في حين أن معدلات النمو حسابها من المقايسات لوحة 96 جيدا مقارنة هزة قوارير (25 مل الثقافات). ليست بالضرورة هي نفسها (سواء بسبب الاختلافات في علم وظائف الأعضاء والأجهزة في)، لقد لوحظ أن معدلات النمو النسبي متشابهة (رغم أن هذا قد لا يكون الحال دائما).

TLE "> 5. إنشاء محرض الجينوم جمع أليل

1. الحصول pMN10، البلازميد noncentromeric مع المروج-ATF استجابة من pMN8 تنصهر لKanMX (في الاتجاه المعاكس).
2. تقييد هضم العمود الفقري النواقل واستخراج الجل كما هو الحال في القسم 2.
3. يصلب، الفوسفات، وتحتوي على oligos ligate مواقع الربط المناسبة كما هو موضح في القسم 2.
4. تسلسل تحقق. وهذا البلازميد الآن بمثابة قالب الحمض النووي لخلق أليل محرض.
5. الحصول على سلالة الخميرة معربا عن ATF المقابلة من الفائدة.
6. PCR تضخيم كاسيت KanMX-المروج (~ 2 كيلو) باستخدام بادئات من الجدول 6.
7. تحويل المنتج PCR في سلالة، معربا عن ATF باستخدام طريقة خلات الليثيوم.
8. لوحة على لوحة YPD وطبق على YPD G418 + في اليوم التالي.
9. تأكيد الإدراج المناسبة من المروج باستخدام التمهيدي إلى الأمام (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') وعكس التمهيدي الداخلية إلى التم استبدال البريد الجين الذي المروج. تم تصميم التمهيدي العكسي عادة ما بين 200-300 سنة مضت المصب من أول ATG ^15. المنتج النهائي هو PCR ~ 1.2 كيلو بايت.

النتائج

ويبين الشكل 5 تحريض GFP بواسطة Z ₃ EV، Z ₄ EV، أو GEV مع مرور الوقت. ملاحظة الزيادة في الإنتاج GFP ردا على ATFs تحتوي على الحمض النووي nonyeast المجالات ملزمة. نحن تكهنت مؤخرا بأن هذه النتائج من هذه العوامل تحقيق خصوصية أحادية الجينات في جينوم الخميرة ^1. GEV الاستقراء وحده يؤدي إلى تنشيط / القمع المئات من الجينات، بينما Z ₃ EV وZ ₄ EV تفعيل فقط التعبير عن الجينات المستهدفة وضعت المصب من المروج الاصطناعية التي تحتوي على مواقع الربط المناسبة (5'-GCGTGGGCG-3 'و5'- GCGGCGGAGGAG-3 "، على التوالي) ^1. يوضح الشكل 7 تنظيم محكم للنظام (لا توجد نتائج محفز في أي كشف GFP) والتي تحصل بفعل كل الخلايا استجابة لمحفز قدرة Z ₃ EV للحث GFP عبر مجموعة من وأظهرت تركيزات β-استراديول في الشكل 8.

الأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 1. عوامل النسخ الاصطناعي تتفاعل مع Hsp90 في غياب β-استراديول، وعندما يربط β-استراديول إلى ATF، Hsp90 تنأى، والسماح للATF لدخول النواة وتفعيل التعبير عن مراسل البلازميد.

الشكل 2. تخطيطي للبروتوكول للسلالات الهندسة التي تحتوي على عوامل النسخ الاصطناعي وبناء / اختبار صحفيين GFP وما شابه ذلك.

load/51153/51153fig3highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg "/>
الرقم 3. تسلسل ACT1pr-URA3-EV في سلالة yMN15 في موضع LEU2.

الشكل 4. تصميم بادئات PCR لتضخيم مجال الحمض النووي ملزم في المصالح مع تسلسل تناظر إضافية لتوليد البروتين الانصهار جديدة عندما تحولت بنجاح في yMN15.

الرقم 5. GFP تحريض من قبل ثلاثة أزواج ATF-المروج مختلفة ردا على 1 ميكرومتر β-استراديول.

الرقم 6. وهناك سيناريو MATLAB لمعالجة تدفق البيانات الخلوي. وقد تم تكييف هذا البرنامج النصي من http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data .

وكان الرقم 7. تحريض GFP بواسطة Z ₃ EV استجابة ل0 μ M β-استراديول و 1 ميكرومتر β-استراديول 18 ساعة التالية للتحريض الإسفار أيضا شركة طيران الشرق الأوسطتقاس من خلايا تفتقر GFP لتوضيح تنظيم محكم للنظام EV Z _3. تم إنشاء هذا الرقم باستخدام رمز في الشكل 6.

الرقم 8. تم تصنيف العلاقة بين تركيز محفز والإخراج التعبير مع معامل هيل من ~ 1 (أ) من التوزيعات GFP التعبير بوصفها وظيفة من تركيز β استراديول. (ب) مضان متوسط ​​التوزيعات من (A). وكانت البيانات يصلح لوظيفة G (D) = G + _دقيقة (G-G _{ماكس دقيقة)} D ^ن / (K + D ^{ن ن)} حيث D هو جرعة β استراديول، G و G _{دقيقة كحد أقصى} هي الحد الأدنى و أقصى القيم GFP، الدقةpectively، n هو معامل هيل، وK هو جرعة β استراديول أن ينتج ½ (G + G _{ماكس دقيقة).}

تسلسل قليل النوكليوتيد	اسم
5'-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 '	DBD تحقق الأمام
5'-tccagagac ttcagggtgct-3 '	DBD تحقق عكسي

الجدول 1. الاشعال لتأكيد الانصهار الصحيح للDBD التي تهم مستقبلات الاستروجين. التمهيدي للمضي قدما هو مثلي المروج ACT1 والتمهيدي العكس هو مثلي لمستقبلات الاستروجين. لDBDs نموذجي (~ 300 سنة مضت)، والمنتج PCR هو <1.5 كيلو بايت.

تسلسل قليل النوكليوتيد	اسم
5'-ggccgc ... DBD موقع نهم ... تي 3 "	أعلى بنسبة ضئيلة
5'-ctaga ... موقع الحمض النووي ملزمة عكس ... GC-3 '	بنسبة ضئيلة أسفل
5'دول مجلس التعاون الخليجي gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG تي 3 '	أعلى بنسبة ضئيلة + 6X Zif268 مواقع الربط
5'-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 '	بنسبة ضئيلة أسفل + 6X Zif268 مواقع الربط

الجدول 2. tructure S الاشعال لخلق dsDNA والتي تحتوي على مواقع الربط من الفائدة. لإنشاء Z _3-EV استجابة المروج، وأليغنوكليوتيد أعلى بنسبة ضئيلة + 6X Zif268 تجليد مواقع وبنسبة ضئيلة أسفل + 6X Zif268 استخدمت تجليد.تسلسل لخلق يتدلى الحمض النووي الصحيح في الصغيرة. وأكد الموقع Zif268 الإجماع الملزم، GCGTGGGCG، في أعلى بنسبة ضئيلة.

كاشف	مبلغ
T4 كيناز عديد النوكليوتيد العازلة	5 ميكرولتر
T4 كيناز عديد النوكليوتيد (@ 10،000 وحدة / مل)	1 ميكرولتر
أعلى بنسبة ضئيلة (100 ميكرومتر)	1.5 ميكرولتر
بنسبة ضئيلة أسفل (100 ميكرومتر)	1.5 ميكرولتر
ماء	41 ميكرولتر

الجدول 3. الفوسفات والاشعال يصلب في thermocycler باستخدام 50 ميكرولتر من رد الفعل المذكورة أعلاه. هناك نوعان من الخطوات thermocycler. الخطوة 1: 37 ° C 30 دقيقة (الفوسفات)، والخطوة 2: 95 ° C 30 ثانية (التنحي 1 ° C كل 30 ثانية حتى عند 4 درجة مئوية؛ يصلب).

كاشف	مبلغ
XbaI	1 ميكرولتر
NOTI-HF	1 ميكرولتر
البلازميد الحمض النووي	5 ميكرولتر (1-2 ميكروغرام)
10X قص الذكية العازلة	5 ميكرولتر
ماء	38 ميكرولتر

الجدول 4. تقييد هضم البلازميد pMN8 مع XbaI وNOTI.

كاشف	مبلغ
T4 يغاز BUFفر	2 ميكرولتر
T4 يغاز	0.2 ميكرولتر
العمود الفقري @ 10 نانوغرام / ميكرولتر	1 ميكرولتر
ملزم متواليات @ 5X تركيز المولي / ميكرولتر	1 ميكرولتر
ماء	15.8 ميكرولتر

الجدول 5. Ligate مواقع الربط في الحمض النووي البلازميد.

كتاب تمهيدي	وصف
~ 40 غليان المنبع من ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 '	التمهيدي إلى الأمام لتضخيم KanMX-المروج
5'عكس تكملة (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 '	عكس الحزب الثوري المؤسسيمير لتضخيم KanMX-المروج
5'-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 '	التمهيدي إلى الأمام لجعل مبادلة GCN4 المروج.
5'-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 '	عكس التمهيدي لصنع مبادلة GCN4 المروج.

الجدول 6. PCR تضخيم KanMX-المروج لصنع أليل titratible.

Discussion

مفاتيح القائم على هرمون الموصوفة هنا لها تطبيقات لا تعد ولا تحصى، من دراسة بيولوجيا الخلية الأم إلى اختبار قدرة مجال الحمض النووي ملزم من الفائدة لاستهداف تسلسل الحمض النووي في الجسم الحي. النظام لديه العديد من الميزات مرغوب فيه، بما في ذلك استجابة لمحفز متدرج، والعمل بسرعة، وتنظيم محكم (أي. أي التسرب قابلة للقياس، انظر الشكل 7). ومع ذلك، لا يزال هناك مجال للتحسين والتوسع.

وقد أكدت الأعمال الأخيرة في البيولوجيا التركيبية الاصطناعية أنظمة مضاعفة وتوسيع مرجع تتميز بشكل جيد وقطع الحمض النووي للبرمجة ^16. مستقلة، التعبير الشرطي من الجينات المستهدفة متميزة يتطلب محرضات متعددة والمجالات ملزمة الحمض النووي التي تفتقر إلى تداخل خصوصية. توافر مستقبلات المهندسة والتي تحدث بشكل طبيعي ويقدم مجموعة كبيرة من قطع الغيار التي لتطوير عوامل النسخ اصطناعية جديدة. توسيعمرجع مفاتيح متعامد بعضها بعضا وقد ساعد الى حد كبير عن طريق التطور الموجه النهج ^17،18. وستعرض الجهود المبذولة حاليا لإعادة برمجة خصوصية ملزم يجند لدينا عوامل النسخ الاصطناعي في المستقبل.

سابقا، فإن عواقب المظهري من الجينات الحذف / من overexpression تم دراستها على نطاق واسع في الخميرة ^19،20. ومع ذلك، لم يتم ذلك مباشرة لدراسة تأثير التعبير عن الظواهر المختلفة على مجموعة من مستويات التعبير. والميزة الأساسية لنظام الواردة في هذه الوثيقة هو طبيعة متدرج لها (الشكل 8). في حين غالبا ما يفترض، والعلاقة بين التعبير الجيني والظواهر من الفائدة قد لا يكون بالضرورة رتيب. سوف عوامل النسخ الاصطناعية مثل Z ₃ EV وZ ₄ EV جعل مهمة يعاير ردود المظهري للتغيرات في التعبير الجيني مباشرة.

وأخيرا، فإن البروتوكولات مناقشةإد في هذه المخطوطة هي للهندسة وتميز عوامل النسخ الاصطناعية التي تستجيب لβ-استراديول، ولكن بديلا هاما إلى مجالات تستجيب كيميائيا هو استخدام المجالات ضوء استجابة (مثل PhyB/Pif3، LOV، وBLUF)، الأنشطة التي هي عكسها دون الحاجة إلى التشويش على نمو ثقافة المتوسط ^​​21-23. الأنظمة القائمة على ضوء تسهيل السيطرة الزمانية المكانية في التعبير الجيني، وتفاعلات البروتين البروتين، والنقل أيون، والنشاط الأنزيمي، والتي أثبتت بالفعل قوية ^21-26.

في الختام، قدمنا ​​طرق البناء السريع للمحرض، عوامل النسخ اصطناعية في الخميرة. يوفر هذا البروتوكول قالب لبنائها بالتزامن مع صحفيين GFP وما شابه ذلك، وكذلك طرق تحليل البيانات باستخدام مراسل التدفق الخلوي ويعاير تأثير التنشيط ATF على النمو.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Expand High Fidelity PCR System	Roche	11 732 650 001
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Competent E. coli	Life Technologies	18258-012
Estradiol	Tocris Biosciences	2824
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201
PBS	Life Technologies	10010-23
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5
clonNAT	Jena Bioscience	AB-102L
XbaI	NEB	R0145S
NotI-HF	NEB	R3189S
CutSmart Buffer	NEB	B7204S
Glucose	Fisher Scientific	D15-500
Bacto-Peptone	BD Biosciences	211677
Yeast Extract	BD Biosciences	210929
Agarose	BD Biosciences	214010
100% Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
G418	Life Technologies	11811-031
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Lithium acetate dihydrate	Sigma-Aldrich	L-6883
Salmon sperm DNA	Sigma-Aldrich	93283
PEG 3350	Sigma-Aldrich	P-3640
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15	Noyes or Botstein labs
Luria Broth	Sigma-Aldrich	L3397
EQUIPMENT:
LSRII Flow Cyometer	BD Biosciences	Various Models
MATLAB or FlowJo	MATLAB or FlowJo		Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments
R	Open Source		For analyzing growth-rate data from plate reader.
Falcon Tubes	BD Biosciences	352052
1.7 ml Eppendorf  Tubes	GeneMate	C3262-1
250 ml Shake Flasks	Corning	4446-250
96-well, flat-bottom plates	Costar	3635
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)	BioTek	H1MG
Breathe-Easy Membranes	Sigma-Aldrich	Z380059-1PAK
Thermocycler	various companies	Various models
SC-Ura powder	MP Biomedicals	114410622
5-FOA	Zymo Research	F9001-1