Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die schnelle Konstruktion von künstliche Transkriptionsfaktoren (ATF) mit zugehörigen GFP-Reporter und Quantifizierung des ATF Fähigkeit GFP-Expression mittels Durchflusszytometrie stimulieren.

Zusammenfassung

Synthetische Biologie zielt darauf ab, rational planen und bauen Kunstkreise mit gewünschten Eigenschaften quantitative als auch bieten Werkzeuge, um die Struktur von nativen Regelkreise zu befragen. In beiden Fällen kann die Fähigkeit, die Genexpression in einer schnellen und abstimmbare Mode zu programmieren, ohne Off-Target-Effekte, nützlich sein. Wir haben Hefestämme, die die ACT1 Promotor stromaufwärts einer URA3-Kassette, gefolgt von der Ligandenbindungsdomäne des humanen Östrogen-Rezeptor und VP16 aufgebaut. Durch Transformation dieses Stammes mit einer linearen PCR-Produkt, enthaltend eine DNA-Bindungsdomäne und Auswählen gegen die Anwesenheit von URA3 kann ein konstitutiv exprimiert künstlichen Transkriptionsfaktor (ATF) durch homologe Rekombination erzeugt werden. ATF auf diese Weise konstruiert werden eine einzigartige Zielgens in der Gegenwart eines Induktors aktiviert, wodurch sowohl das Off-Target-Aktivierung und nicht-physiologischen Wachstumsbedingungen mit häufig verwendeten conditi gefunden Beseitigungonal-Gen-Expressionssystemen. Ein einfaches Verfahren für die schnelle Konstruktion von GFP-Reporter-Plasmiden, die spezifisch an ein natives oder künstlichen Transkriptionsfaktors von Interesse reagieren, ist ebenfalls vorgesehen.

Einleitung

Entwicklung von genetischen Schalter in Hefe ist von großem Interesse, sowohl in der akademischen und industriellen Forschung. Im Idealfall können genetische Schalter verwendet werden, um ein bestimmtes Gen (oder eine Gruppe von Genen) nur aktiviert, wenn der Experimentator wünschen übrig. Eines Gens kodierende Sequenz stromabwärts von einem synthetischen Promotors nicht in Abwesenheit einer induzierenden Moleküls ausgedrückt: auf Induktors zusätzlich das Gen sollte rasch ausgedrückt werden. Es wurde erst kürzlich gezeigt, daß ein solcher Schalter kann in Hefe, wobei in Abwesenheit des Induktors, zeigt der Stamm eine Deletion Phänotyp, jedoch in Gegenwart von Induktor wird die Expression im Verhältnis zu der Ebene der Induktor in allen Zellen aktiviert konstruiert werden, ^1,2. Historisch haben bedingten Expressionssysteme in Hefe stark auf nährstoff reaktive DNA-Sequenzen, darunter die MET, FO und GAL-Promotoren (deren Aktivitäten sind empfindlich gegen extrazelluläre Konzentration von Methionin, Phosphat und verlassenGalactose, jeweils). Während Bedingungsausdruck erzielt werden kann, kommt es auf Kosten einer signifikanten pleiotrope Effekte.

Hormonrezeptoren, wie dem menschlichen Östrogen-Rezeptoren haben sich als wirksam schaltet in Eukaryonten ^3,4 sein. In Abwesenheit des Hormons, kann ein Protein mit einem Hormonrezeptor fusioniert im Cytoplasma, wo sie mit dem Hsp90-Chaperon-Komplex interagiert, sequestriert werden. Bei der Bindung der entsprechenden Liganden der Rezeptor eine Konformationsänderung, wodurch es zu der Hsp90-Chaperon-Komplex freigesetzt werden und enthüllt ein Kernlokalisationssignal. Um die Lokalisation Dynamik einer bestimmten Hormonrezeptor-enthaltendes Protein beobachten wir eine C-terminale Fusion Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, einem synthetischen Transkriptionsfaktor, der die Gal4p DNA-Bindungsdomäne, die Ligandenbindungsdomäne des humanen Östrogenrezeptor geschaffen und VP16) mit GFP ^2. Kernlokalisierungs wurde innerhalb von 8 min nach der Zugabe von beobachtetensättigenden Mengen der Induktor ß-Östradiol, zu dem Wildtyp-Hefe ist völlig inert. Bis zu diesem Zeitpunkt die Mehrheit der Zellen deutlich sichtbar aktiv Stellen für Transkriptions GEV Zielgene (über Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung untersucht) sowie ausgereifte mRNAs ^2,5. GEV Zielgene in Ausdruck> 2-fach innerhalb von 2,5 min ^2,6 (gemessen mit Microarrays) erhöht, was zeigt, dass es <2,5 min für die chimären Aktivator in den Zellkern transloziert, binden DNA und aktivieren Transkription.

Während mehrere andere Online-Schalter sind in der Hefe, die verschiedene kleine Moleküle oder Medikamente (einschließlich der klassischen Doxycyclin-basierte Switches von Escherichia coli ^7,8 und ein Indigo-basierte Schalter ⁹ von Arabidopsis thaliana), keiner hat die Geschwindigkeit erreicht, nutzen angewandt wurde, Spezifität oder Dichtheit der Regelung durch die Hormon-basierten Switches ausgestellt. Es ist erwähnenswert tHut schnelle off-Schalter sind auch in Hefe entwickelt, und in der Regel durch Fusion eines Gens auf eine Protease oder Ubiquitin-Ligase-Zielsequenz ^2,10,11,12 arbeiten. Die Fähigkeit, schnell zu entfernen eines Zielproteins aus der Zelle erleichtert die Untersuchung essentieller Gene sowie Gene, die anfällig für genetische Ausblendung bei ¹⁰ gelöscht.

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sind für den Aufbau und Charakterisierung von synthetischen on-Schalter in Hefe. Zuerst wird gezeigt, wie schnell erzeugen genomisch integriert Fusionsproteine ​​bestehend aus einer DNA-bindenden Domäne von Interesse, die Ligandenbindungsdomäne des humanen Östrogen-Rezeptor und VP16 (DBD-EV). Nach unserem Protokoll, wird das Fusionsprotein aus einem ACT1 Promotors exprimiert. Wir zeigen dann, wie man einen verwandten Reporter-Plasmid für die ATF erstellen und testen Sie die Funktionalität mit der Durchflusszytometrie. Obwohl wir uns vorstellen, wobei diese Reporter-Plasmide mit neuen ATFs (Abbildung 1) verwendet, so kann be als Reporter für eine native Transkriptionsaktivator als gut. Schließlich Einzelheiten zum Testen der Wirkung der ATF-Aktivierung auf das Zellwachstum in 96-Well-Platten und zum Engineering induzierbaren genomischen Allele sind vorgesehen.

Protokoll

Figur 2 eine schematische Darstellung des Protokoll-Abschnitte 1-3.

1. Erstellung von ATFs

1. Erstellen Primer für die PCR Amplifikation von DNA-bindenden Domäne von Interesse. Homologie zu der ACT1-Promotor und Hormon-Rezeptor (wie in den 3 und 4 beschrieben) wird durch PCR zugegeben, um eine korrekte Rekombination in dem Stamm yMN15 erleichtern.
2. PCR verstärken DBD von Interesse mit einem High-Fidelity-Polymerase.
3. Transformieren> 1 ug gereinigte PCR-Produkt in Hefe unter Verwendung der Lithiumacetat-Methode ^13.
4. Nach der Transformation, Spin-Zellen bei Höchstgeschwindigkeit für 15 Sekunden in Mikro und entfernen Transformationsmischung.
5. Resuspendieren in ~ 200 ul sterilem Wasser und Platte auf YPD.
6. Am nächsten Tag, Replik Platte von YPD auf 5-FOA-Platten (5-FOA-Platten werden wie in der Cold Spring Harbor Hefe-Handbuch beschrieben ist) ^13.
7. Lassen Wachstum für 2-4 days und restreak mindestens 5-10 Kolonien auf YPD. Durchführen einer Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer in Tabelle 1 und die Sequenz für die Eingliederung zu überprüfen.

2. Erstellung von ATF Plasmid Reporter

1. Bestimmen Sie die Bindungsstelle des ATF (am ehesten von der Literatur kommen).
2. Um die gewünschte Bindungsregion Oligos (oder Ultramers, falls erforderlich). Bestellen Sie als Ober-und Unter Stränge mit der richtigen Überhängen für NotI und XbaI, wie in Tabelle 2 dargestellt.
3. Verdünnen Oligos äquimolaren Konzentrationen (100 &mgr; M).
4. Phosphorylierung mit T4 Polynukleotid-Kinase und dann Glühen in einem Thermocycler. Die Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 3.
5. Verdau ~ 1-2 &mgr; g pMN8 mit NotI und XbaI-HF für 1 h bei 37 ° C (Reaktionsbedingungen in Tabelle 4).
6. Gel reinigt das Rückgrat Band.
7. Verdünnen Sie die gereinigten Backbone bis 10 ng / ul.
8. Verdünnen Sie die Doppelstrang-, PhosphorylATED Bindungsstelle, um die Stoffmengenkonzentration von Backbone pro ul 5x.
9. Verwendung von T4-DNA-Ligase zu ligieren, die Bindungsstellen in den verdauten Rückgrat bei Raumtemperatur für 30 min (Tabelle 5).
10. Für die Transformation, fügen die Hälfte der Ligationsreaktion zu 50 ul von Standard-, chemisch kompetente Escherichia coli, wie XL1-Blue oder DH5-Alpha.
11. Hitzeschock-Zellen, die für 45 Sekunden in einem 42 ° C Wasserbad und legen Sie dann auf Eis für 2 min.
12. In 900 ul SOC-Medium der Transformation Reaktion.
13. Wachsen bei 37 ° C für 1 h auf einer Walzentrommel.
14. Verbreiten 100-200 Zellen pro ul LB + AMP (100 ug / ml) Platte und Inkubation über Nacht.
15. Grow up E. coli in LB + AMP Flüssigkeit und Ernte Plasmid-DNA. Sequence überprüfen neuen Reporter-Plasmid von Kolonien Ligation unter Verwendung des Primers 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 '.
16. Trans neuen Reporter-Plasmid in ATF-haltigen Hefe strain von Abschnitt 1 mit Lithium-Acetat-Transformation.

3. Quantifizierung der Wirkung von ATF Induktion über Gene Expression Mit GFP-Reporter

Vorbereitung der Proben:

1. Machen Sie 25 mM β-Estradiol-Lager (10 ml Ethanol + 0,0681 g β-Estradiol). Im Kühlschrank.
2. Wachsen ATF +-Stamm Reporter haltige über Nacht in 5 ml SC-URA.
3. Erhalten neun 250 ml-Schüttelkolben und 25 ml SC-URA zu jedem.
4. In 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM oder 10 uM β-Estradiol. Dies geschieht am einfachsten, indem Sie das 10-fache serielle Verdünnungen der 25 mM β-Estradiol Lager getan. Für eine endgültige Konzentration von 10 uM β-Estradiol, fügen Sie 10 ul der 25 mM β-Estradiol Lager zu 25 ml SC-URA.
5. In 125 ul der Übernachtkulturen in Kolben (1:200 Verdünnung).
6. Für die restlichen zwei Fläschchen, impfen mit einem konstitutiven GFP Herstellung Strain und ein Stamm fehlt GFP. Diese werden für die Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt.
7. Schütteln bei 200 rpm bei 30 ° C für 12-18 Stunden.
   Hinweis: Die optimale Inkubationszeit wird durch die Identifizierung, wenn GFP-Induktion nicht mehr ändert nach Zugabe von β-Östradiol bestimmt.
8. Nehmen Sie 500 ul jeder Kultur und Spin-down in separaten 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
9. Saugen SC-URA.
10. Einmal in 1 ml PBS + 0,1% Tween-20 waschen und absaugen.
11. 1 ml PBS + 0,1% Tween-20 und resuspendieren.
12. 1 ml PBS + 0,1% Tween-20 Falcon-Röhrchen.
13. Hinzufügen der resuspendierten Zellen auf 5-ml-Röhrchen (Endvolumen = 2 ml) (mit 4 ° C für mehrere Tage gelagert werden.)
14. Optional: beschallen Zellen leicht, um etwaige Trennung verklumpte Zellen.
    Durchflusszytometrie-Analyse: Überblick: Die Fluoreszenz von 10.000-100.000 Zellen wird in der Regel pro Probe analysiert. Die Daten können entweder in FlowJo oder mit benutzerdefinierten Skripten in MATLAB oder verarbeitet werdenR. Achten Sie darauf, um die Spannung des GFP-Kanal-Kalibrierung mit GFP-positiven und negativen Kontrollen. Sobald die FCS-Dateien exportiert werden, ein Skript, wie in Abbildung 6 zusammen mit den Funktions fca_readfcs ( http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader können) verwendet, um das zu verarbeiten Daten.
15. Führen Durchflusszytometrie.
    1. Verwenden Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC), Hefe-Zellen zu identifizieren.
    2. Die Durchflussrate auf ~ 3.000 Zellen / sec.
    3. Messen GFP (FITC Kanal).
    4. Sobald die Daten erhoben werden, zu exportieren. FCS-Dateien
16. Legen MATLAB.
17. Verschieben Sie die. FCS-Dateien fcs_readfcs.m und ein Skript ähnlich dem aus Abbildung 6 in den gleichen Ordner.
18. Ändern Sie die aktuelle Arbeitsverzeichnis in den Ordner mit den Daten und Skripte.
19. Führen Sie das Skript aus Abbildung 6 (Hinweis: DieLegende wurde manuell eingegeben werden, um zu produzieren, was in Abbildung 7 zu sehen).

4. Quantifizierung der Wirkung von ATF Induktion auf das Zellwachstum

1. Von gefrorenen Aktien, Streifen sowohl (1) ein ATF-haltigen Stamm und (2) ein ATF-Stamm fehlt (wie yMN15) auf separate YPD-Platten.
2. Nach 2 Tagen Wachstum inokulieren separaten Kulturröhrchen, enthaltend 5 ml YPD-Flüssig mit jedem Stamm und über Nacht wachsen bei 30 ° C
3. Führen Sie 10-fach serielle Verdünnungen einer 0,25 mM β-Estradiol-Stammlösung bis zu 10.000-fach (0,025 uM β-Estradiol) in 100% Ethanol.
4. In 40 ul-Nacht-Kulturen zu 10 ml YPD-Flüssigkeit (1-250 Verdünnung).
5. Für jeden Stamm, füge 96 &mgr; l der verdünnten Zellen auf 18 Wells einer 96-Well-Platte.
6. Hinzufügen von 4 ul β-Östradiol zu den Zellen. Ein wesentlicher Punkt ist, um sicherzustellen, dass jeder auch die gleiche Menge an Gesamt-Ethanol. (Alternativ kann ein mo re konzentrierte Stamm von β-Estradiol verwendet werden und anschließend auf den Punkt verdünnt die Wirkung von Ethanol auf Wachstum ist nicht messbar).
7. Führen Sie in dreifacher Ausfertigung. Drei der Vertiefungen für jeden Stamm sollte Ethanol nur steuert.
8. Decken Sie die 96-Well-Platte in gasdurchlässige Membran.
9. Überwachung Wachstum (OD ₆₀₀₎ in Plattenlesegerät.
10. Quantifizierung der Wachstumsraten mit einer beliebigen Anzahl von Standardmethoden wie das Finden der maximalen Steigung.
    Hinweis: Wir haben gute Erfolge mit der Open-Source-Software-Paket Grofit ^14, die in der R-Programmierumgebung läuft hatte Es ist erwähnenswert, dass, während die Wachstumsraten von 96-Well-Plattentests berechnet, verglichen mit (25 ml Kulturen)-Fläschchen schütteln. sind nicht unbedingt die gleichen (aufgrund beiden Unterschiede in der Physiologie und in der Instrumentierung), haben wir beobachtet, dass die relativen Wachstumsraten sind ähnlich (obwohl dies nicht immer der Fall sein).

tle "> 5. erstellen Inducible Genomic Allele

1. Erhalten pMN10, noncentromeric ein Plasmid mit der ATF-responsive Promotor aus pMN8 zu KanMX (in der entgegengesetzten Orientierung) fusioniert.
2. Beschränkung verdauen die Vektor-Rückgrat und Gel-Extrakt, wie in Abschnitt 2.
3. Glühen, phosphoryliert und Ligats Oligos, die geeignete Bindungsstellen, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
4. Sequenz zu überprüfen. Dieses Plasmid wird nun als DNA-Vorlage für die Erstellung der induzierbaren Allel zu dienen.
5. Erhalten Sie die Hefestamm die entsprechende ATF von Interesse exprimieren.
6. PCR verstärken die KanMX-Promoter Kassette (~ 2 kb) unter Verwendung der Primer aus Tabelle 6.
7. Transformieren Sie das PCR-Produkt in die ATF-exprimierenden Stamm unter Verwendung der Lithium-Acetat-Methode.
8. Platte auf YPD-und Replika Platte auf YPD + G418 am folgenden Tag.
9. Bestätigen geeignete Insertion des Promotors unter Verwendung des Vorwärts-Primers (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') und einen Rückwärtsprimer internen the Gen, dessen Promotor ersetzt wurde. Der Reverse-Primer ist typischerweise entworfen, um zwischen 200-300 bp stromabwärts des ersten ATG ¹⁵ sein. Das endgültige PCR-Produkt wird ~ 1,2 kb.

Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt die Induktion von GFP durch Z ₃ EV, Z ₄ EV oder GEV über die Zeit. Beachten Sie die Erhöhung der GFP-Produktion in Reaktion auf die ATF nonyeast enthaltenden DNA-Bindungsdomänen. Wir haben vor kurzem spekuliert, dass dies ergibt sich aus diesen Faktoren Erreichung Single-Gen-Spezifität in das Genom der Hefe ^ein. GEV Induktion allein führt zur Aktivierung / Repression der Hunderte von Genen, während Z ₃ und Z ₄ EV EV nur die Expression eines Zielgens aktiviert hinter einem synthetischen Promotor, die geeignete Bindungsstellen (5'-GCGTGGGCG-3 'und 5'-gelegt GCGGCGGAGGAG-3 ', respectively) ^ein. Abbildung 7 zeigt die strenge Regulierung des Systems (keine Induktor zu keiner nachweisbaren GFP) und dass alle Zellen als Antwort bekommen Induktor induziert, um die Fähigkeit der Z ₃ EV an GFP in einer Reihe von induzieren β-Östradiol-Konzentrationen ist in Fig. 8 gezeigt.

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Fig. 1 ist. Künstliche Transkriptionsfaktoren interagieren mit Hsp90 in Abwesenheit von β-Östradiol. Wenn β-Östradiol bindet an das ATF, Hsp90 distanziert, so dass das ATF in den Zellkern einzudringen und Expression von Plasmid-Reporter.

Abbildung 2. Schematische Darstellung des Protokolls für Engineering-Stämme, die künstliche Transkriptionsfaktoren und Gebäude / Prüfung verwandten GFP Reporter enthalten.

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Abbildung 3. Die ACT1pr-URA3-EV-Sequenz in dem Stamm yMN15 an der LEU2-Locus.

4. Entwurf von PCR-Primern für die Amplifikation einer DNA-Bindungsdomäne von Interesse mit zusätzlichen Sequenzhomologie, um ein neues Fusionsprotein zu erzeugen, wenn erfolgreich in yMN15 transformiert.

5. GFP-Induktion durch drei ATF-Promotor-Paare in Reaktion auf 1 uM β-Östradiol.

Abbildung 6. Ein MATLAB-Skript für die Verarbeitung der Durchflusszytometrie Daten. Dieses Skript wurde von angepasst http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data .

Abbildung 7. Induktion von GFP durch Z ₃ EV in Reaktion auf 0 μ M β-Estradiol und 1 uM β-Estradiol folgenden 18 Stunden der Induktion. Fluoreszenz war auch meavon Zellen ohne GFP, die strenge Regulierung des Z ₃ EV-System veranschaulichen, sichergestellt ist. Diese Zahl wurde mit der Code in Abbildung 6 erzeugt.

Figur 8. Die Beziehung zwischen Konzentration und Induktor Ausdruck Ausgang mit einem Hill-Koeffizienten von ca. 1 bewertet. (A) Verteilungen der GFP-Expression als Funktion der β-Estradiol-Konzentration. (B) Die mittlere Fluoreszenz der Ausschüttungen aus (A). Die Daten wurden an die Funktion G (D) = g _min + (G _max, G _min) D ⁿ / (K + ⁿ D ^n), wobei D die Dosis β-Estradiol, G _min und G _max sind die minimalen und Höchstwerte GFP, resziehungs, n der Hill-Koeffizient, und K der β-Estradiol-Dosis, die ½ (G _max + G _min) ergibt.

Oligonukleotidsequenz	Name
5'-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 '	DBD Zukunfts prüfen
5'-tccagagac ttcagggtgct-3 '	DBD umge prüfen

Tabelle 1. Primer zur Bestätigung korrekten Fusion DBD von Interesse für den Östrogen-Rezeptor. Der Vorwärts-Primer ist homolog der ACT1-Promotor und der Reverse-Primer ist homolog zu den Östrogen-Rezeptor. Typisch für DBDs (~ 300 bp), das PCR-Produkt <1,5 kb.

Oligonukleotidsequenz	Name
5'-ggccgc ... DBD binging Seite ... t-3 '	Top-Oligo
5'-ctaga ... DNA-Bindungsstelle umzukehren ... gc-3 '	Bottom Oligo
5'-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 '	Top-Oligo + 6x Zif268 Bindungsstellen
5'-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 '	Bottom-Oligo + 6x Zif268 Bindungsstellen

Tabelle 2. S truktur von Primern für die Erstellung von dsDNA enthält Bindungsstellen von Interesse. Um die Z ₃ EV-responsive Promotor zu erstellen, die Oligonukleotide Oligo Top + 6x Zif268 Bindungsstellen und Bottom-Oligo + 6x Zif268 Binding verwendet.Sequenzen für die Erstellung der korrekten DNA-Überhänge sind in Kleinbuchstaben. Die Zif268 Konsens Bindungsstelle, GCGTGGGCG, wird in der oberen Oligo unterstrichen.

Reagens	Menge
T4 Polynukleotid-Kinase-Puffer	5 ul
T4 Polynukleotid-Kinase (@ 10.000 Einheiten / ml)	1 ul
Top Oligo (100 uM)	1,5 ul
Boden Oligo (100 uM)	1,5 ul
Wasser	41 ul

Tabelle 3. Phosphorylieren und Glühen Primer in einem Thermocycler mit 50 ul der oben beschriebenen Reaktion. Es gibt zwei Thermocycler Schritte. Schritt 1: 37 ° C 30 min (Phosphorylierung), und Schritt 2: 95 ° C 30 sec (Schritt um 1 ° C alle 30 Sekunden, bis bei 4 ° C; Glühen).

Reagens	Menge
XbaI	1 ul
NotI-HF	1 ul
Plasmid-DNA	5 ul (1-2 ug)
10x Smart-Cut-Puffer	5 ul
Wasser	38 ul

Tabelle 4. Restriktionsverdau von Plasmid pMN8 mit XbaI und NotI.

Reagens	Menge
T4-Ligase Buffer	2 ul
T4 Ligase	0,2 ul
Backbone @ 10 ng / ul	1 ul
Bindungssequenzen @ 5x Stoffmengenkonzentration / ul	1 ul
Wasser	15,8 ul

Tabelle 5. Ligatbindung Websites in Plasmid-DNA.

Grundierung	Beschreibung
~ 40 bp stromaufwärts des ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 '	Vorwärts-Primer zur Amplifikation KanMX-Promoter
5'-reverse Komplement (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 '	Reverse-primer zur Verstärkung KanMX-Promoter
5'-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 '	Forward-Primer für die Herstellung GCN4 Promoter Swap.
5'-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 '	Reverse-Primer für die Herstellung GCN4 Promoter Swap.

Tabelle 6. PCR verstärken KanMX-Promoter für die Herstellung titratible Allel.

Diskussion

Die hier beschriebenen Hormon-basierte Schalter haben unzählige Anwendungen, von nativen Zellbiologie studieren, um zu testen, ob eine DNA-Bindungsdomäne von Interesse, eine DNA-Sequenz in vivo zielen. Das System hat viele wünschenswerte Eigenschaften, einschließlich einer abgestuften Reaktion auf Induktor, schnelle Action, und strenge Regulierung (dh. Keine messbare Undichtigkeit, siehe Abbildung 7). Es gibt jedoch immer noch Raum für Verbesserung und Erweiterung.

Die jüngsten Arbeiten in der synthetischen Biologie hat Multiplex synthetischen Systemen betont und erweitert das Repertoire der gut charakterisierten, programmierbare DNA Teile ^16. Independent, bedingter Ausdruck von unterschiedlichen Zielgenen erfordert sowohl mehrere Induktoren und DNA-Bindungsdomänen, die sich überlappenden Spezifität fehlt. Die Verfügbarkeit von Engineered und natürlich vorkommende Rezeptoren bietet eine große Anzahl von Teilen, mit denen neue künstliche Transkriptionsfaktoren zu entwickeln. Der Ausbau derRepertoire von zueinander orthogonalen Schalter wurde stark durch gerichtete Evolution gestützte Ansätze ^17,18. Die derzeitigen Bemühungen, den Liganden-Bindungsspezifität von unserer künstlichen Transkriptionsfaktoren umprogrammieren in der Zukunft vorgestellt werden.

Bisher wurden die phänotypischen Auswirkungen der Gen-Deletion / Überexpression sind ausführlich in Hefe ^19,20 sucht. Es hat sich jedoch nicht einfach ist, die Wirkung der Expression von verschiedenen Phänotypen über einen Bereich von Expressionsniveaus zu studieren. Ein Hauptmerkmal des hier vorgestellten Systems ist die abgestufte Natur (Abbildung 8). Während häufig angenommen, die Beziehung zwischen Genexpression und Phänotypen von Interesse nicht notwendigerweise monoton sein. Künstliche Transkriptionsfaktoren wie Z ₃ und Z ₄ EV EV wird die Aufgabe der Bestimmung der phänotypischen Reaktion auf Änderungen in der Genexpression einfach machen.

Schließlich werden die Protokolle diskutierened in diesem Manuskript sind für technische und Charakterisierung künstliche Transkriptionsfaktoren, die an β-Östradiol reagieren, jedoch eine wichtige Alternative zu chemisch reaktionsDomänen ist die Verwendung von auf Licht reagierenden Domänen (wie die PhyB/Pif3, LOV, und BLUF) deren Aktivitäten sind reversibel, ohne die Kultur Wachstumsmedium ^21-23 stören. Lichtsysteme erleichtern räumlich-zeitliche Kontrolle der Genexpression, Protein-Protein-Wechselwirkungen, Ionentransport, und die enzymatische Aktivität, die bereits leistungsfähige ^21-26 bewährt haben.

Zusammenfassend haben wir Methoden für die schnelle Konstruktion von induzierbarer, künstliche Transkriptionsfaktoren in Hefe dargestellt. Dieses Protokoll stellt eine Vorlage für die Konstruktion in Verbindung mit zugehörigen GFP-Reporter, wie auch Methoden für die Analyse der Daten unter Verwendung von Reporter-Durchflusszytometrie und Testen der Wirkung des ATF-Aktivierung auf Wachstum.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Expand High Fidelity PCR System	Roche	11 732 650 001
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Competent E. coli	Life Technologies	18258-012
Estradiol	Tocris Biosciences	2824
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201
PBS	Life Technologies	10010-23
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5
clonNAT	Jena Bioscience	AB-102L
XbaI	NEB	R0145S
NotI-HF	NEB	R3189S
CutSmart Buffer	NEB	B7204S
Glucose	Fisher Scientific	D15-500
Bacto-Peptone	BD Biosciences	211677
Yeast Extract	BD Biosciences	210929
Agarose	BD Biosciences	214010
100% Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
G418	Life Technologies	11811-031
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Lithium acetate dihydrate	Sigma-Aldrich	L-6883
Salmon sperm DNA	Sigma-Aldrich	93283
PEG 3350	Sigma-Aldrich	P-3640
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15	Noyes or Botstein labs
Luria Broth	Sigma-Aldrich	L3397
EQUIPMENT:
LSRII Flow Cyometer	BD Biosciences	Various Models
MATLAB or FlowJo	MATLAB or FlowJo		Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments
R	Open Source		For analyzing growth-rate data from plate reader.
Falcon Tubes	BD Biosciences	352052
1.7 ml Eppendorf  Tubes	GeneMate	C3262-1
250 ml Shake Flasks	Corning	4446-250
96-well, flat-bottom plates	Costar	3635
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)	BioTek	H1MG
Breathe-Easy Membranes	Sigma-Aldrich	Z380059-1PAK
Thermocycler	various companies	Various models
SC-Ura powder	MP Biomedicals	114410622
5-FOA	Zymo Research	F9001-1