قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

Summary

بيضة في ودودة (EIW) الاختبار هو طريقة مفيدة لتحديد وضع البيض السلوك. يمكن إجراء تعديلات في وضع البيض يكون ردا السلوكية للكائن نموذج انواع معينة ايليجانس للمواد البيئية الضارة المحتملة مثل تلك التي تنتجها البكتيريا المسببة للأمراض.

Abstract

يتأثر C. ايليجانس سلوك وضع البيض من قبل العظة البيئية مثل الأسمولية ¹ والاهتزاز ^2. في غياب الأغذية C. وقف ايليجانس أيضا وضع البيض والاحتفاظ البويضات المخصبة في الرحم بهم ^3. ومع ذلك، فإن تأثير مصادر مختلفة من المواد الغذائية، وخصوصا البكتيريا المسببة للأمراض وخاصة المعوية البرازية، على سلوك وضع البيض لا تتميز بشكل جيد. البيضة في ودودة (EIW) الاختبار هو أداة مفيدة لقياس الآثار المترتبة على أنواع مختلفة من البكتيريا، في هذه الحالة E. البرازية، على سلوك وضع البيض.

المقايسات EIW تنطوي على إحصاء عدد البيض الاحتفاظ بها في رحم C. ايليجانس ^4. مقايسة EIW ينطوي تبيض نظموا، حامل الكبار C. ايليجانس لإزالة إهاب وفصل البيض المدورة من الحيوان. قبل التبييض، ويتعرضون للبكتيريا والديدان (أو أي نوع من جديلة البيئية) لفترة محددة من الزمن. بعد التبييض، واحد هو بسهولة جدا قادرة على الاعتماد على عدد من البيض الاحتفاظ داخل الرحم من الديدان. في هذا الاختبار، زيادة قابلة للقياس الكمي في الاحتفاظ البيض بعد E. التعرض البرازية يمكن قياسها بسهولة. مقايسة EIW هو فحص السلوكية التي يمكن استخدامها للكشف عن الجراثيم المحرضة أو وجود السموم البيئية. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون مقايسة EIW أداة للكشف عن الأدوية التي تؤثر على الموصلات العصبية مما يشير السلوك منذ وضع البيض هو عن طريق التضمين الناقلات العصبية مثل السيروتونين وأستيل كولين ^5-9.

Introduction

انواع معينة ايليجانس، وهو المجهرية، الدودة التي تعيش بحرية، هو كائن نموذج يستخدم تقليديا لدراسة العمليات التنموية وخلية يشير بسبب التشريح مهامها بشفافية، وتنمية تتميز بشكل جيد، تماما التسلسل الجينوم، وباختصار جيل من الوقت، والتماثل الجيني للبشر . وفي الآونة الأخيرة، C. أصبح ايليجانس كائن نموذج في مجال علم السموم البيئية والمناعة الفطرية ^{10، 11.}

هذه الديدان خنثوي التسميد الذاتي تصبح ناضجة جنسيا في غضون 2-3 أيام من الفقس من البيض. خلال دورة حياتها، C. ايليجانس يمر عبر أربع مراحل اليرقات (L1-L4)، قبل أن تصل إلى سن البلوغ. واحدة معزولة خنثى يمكن أن تنتج، في المتوسط، 300 ذرية في غضون ثلاثة أيام من ذروة الخصوبة. في التناسل ناضجة C. ايليجانس المخنثين، يتم الاحتفاظ البويضات المخصبة داخل الرحم لعدة ساعات قبل أن يوضع. الالعدد الطبيعي من البيض المخزنة في الرحم في أي وقت واحد (خلال ذروة الخصوبة) ما بين عشرة وخمسة عشر ^12. عدد البيض في الرحم هي وظيفة كل من معدل إنتاج البيض ومعدل وضع البيض. يتم طرد البويضات المخصبة من الرحم عن طريق تقلص عضلات ستة عشر فرجي رتبت حول فتحة الفرج ^13. motorneurons خنثى محددة (في HSN) وmotorneurons VC المشبك على عضلات فرجي التي تؤثر على انقباض العضلات وبالتالي وضع البيض السلوك ^{5،7،13،14.} طرد البيض من الرحم يحدث نتيجة لنشاط منسقة من الخلايا العصبية والعضلات.

الثقافات مختبر C. عادة ما تثار ايليجانس على نظام غذائي من غير ممرض الإشريكية القولونية OP50. في البيئة الطبيعية، C. ايليجانس تتلامس مع مجموعة متنوعة من مصادر الغذاء، مثل البكتيريا المسببة للأمراض، التي يمكن أن تكون ضارة. عندما تتعرض لمواد ضارة فيالبيئة، C. ايليجانس الاحتفاظ البيض حتى يصبح بيئة أكثر ملاءمة. يفترض هذا احتباس البيض هو محاولة لحماية ذريتها.

في هذه البيضة في دودة (EIW) مقايسة، C. ويتعرض ايليجانس للبكتيريا المسببة للأمراض محتملة، المكورات المعوية البرازية، وهي موجودة في البيئة. التعرض لأشكال المسببة للأمراض من E. البرازية يمكن أن يسبب عدوى معوية الثابتة وحتى الموت في C. ايليجانس ^15. وقد ثبت أن التعرض لأشكال أخرى من أشكال البكتيريا المسببة للأمراض تؤثر على البيض الاحتفاظ ^16،17، ومع ذلك لم يكن كميا تأثير. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير المسببة للأمراض أقل ما يقال سلالات E. البرازية، لم تدرس السلالات التي ليست قاتلة على الفور، على سلوك وضع البيض.

المقايسات EIW تنطوي على إحصاء عدد البيض الاحتفاظ بها في رحم C. ايليجانس ^4. على الرغم من C. ايليجانستتسم بالشفافية، ويمكن البيض تتراكم في الرحم يكون من الصعب تحديد في حيوان سليمة. ينطوي على فحص EIW تبيض حامل الكبار C. ايليجانس التي تعرضت للبكتيريا لفترة محددة من الزمن. الحل التبييض يذوب إهاب الخارجي تاركا وراء البيض. البيض هي الانكسار لآثار التبييض بسبب وجود قشر البيض واقية. بعد التبييض، واحد هو بسهولة جدا قادرة على الاعتماد على عدد البيض التي صدرت من الرحم من الديدان على التبييض.

مقايسة وصف هو وسيلة بسيطة وغير مكلفة، وسريعة لتحديد عدد البيض في الرحم في وقت واحد، وبالتالي تحديد آثار E. البرازية على الاحتفاظ البيض. هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لقياس تأثير أنواع أخرى من البكتيريا، والسموم البيئية أو المخدرات على الاحتفاظ البيض. يحتوي هذا الاختبار أيضا على إمكانية استخدامها كشاشة للالمرضية البكتيرية.

Protocol

1) إعداد وسائط النمو الخيطية (NGM)

1. لجعل 50 لوحات، إضافة 1.5 غرام كلوريد الصوديوم، 8.5 غرام عالى النقاء آجار، و1.25 ز ببتون إلى Lflask 1.
2. أضف 487.5 مل من DH ₂ O إلى القارورة. دوامة بلطف لمزج وتغطية افتتاح قارورة مع قطعة من رقائق الألومنيوم.
3. تعقيم الحل عن طريق التعقيم في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
4. يسمح الحل لتبرد إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي.
5. إلى الحل، إضافة التالية بالترتيب: 500 ميكرولتر من الكولسترول 5 ملغ / مل محلول المخزون (الذائبة في الايثانول)، 500 ميكرولتر 1 M و CaCl _2، 500 ميكرولتر 1 M MgSO _4، و 12.5 مل KPO ₄ العازلة (54.15 ز KH ₂ PO ₄ و 17.8 ز K ₂ هبو ₄ في 500 مل من DH ₂ O) كما هو موضح في ^18.
6. استخدام ماصات معقمة، إضافة 10 مل من محلول أجار لكل 60 مم البوليسترين طبق بيتري. السماح لوسائل الإعلام لترسيخ في درجة حرارة الغرفة overnآيت.

2) إعداد مرق B E. وسائل الإعلام القولونية

1. خمسة لجعل 100 مل الثقافات، إضافة 5.0 غرام من Bacto تريبتون، 2.5 غرام خلاصة الخميرة، 5.0 غرام كلوريد الصوديوم إلى دورق.
2. إضافة عقيمة، الماء المقطر إلى الحجم النهائي من 500 مل. الحرارة الحل على طبق ساخن، مع التحريك، إلى أن حلت المواد المذابة.
3. صب 100 مل من مرق B إلى خمس زجاجات (200 مل على الأقل حجم).
4. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
5. تسمح B مرق لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

3) البذر C. لوحات صيانة ايليجانس

1. بعد السماح لوحات NGM حتى يجف في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد على الأقل، تطعيم واحدة 100 مل B ثقافة مرق مع عدد قليل من مستعمرات E. القولونية (OP50).
2. تنمو E. ثقافة القولونية عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
3. ماصة اثنين واحد قطرات (ما يقرب من 10081؛ ل) من OP50 الثقافة على مركز كل لوحة NGM. وعادة ما تكون مكدسة لوحات من جانب غطاء فوق. عندما pipetting ل(البذر)، تبدأ من قبل pipetting الثقافة على لوحة في أسفل كومة. العمل طريقك كل المكدس. ليس محاولة لنقل لوحات بعد البذر، لأنه من المهم أن الثقافة لا يحصل أيضا على مقربة من حواف اللوحة.
4. السماح لوحات المصنف لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل استخدام.
5. يتم تخزين لوحات المصنف (مقلوب) في حاويات من البلاستيك مختوم في درجة حرارة الغرفة.

4) الحفاظ على C. ايليجانس سلالات

1. للحفاظ على تغذية جيدة C. الأسهم ايليجانس، استخدم دودة اختيار لنقل ثلاثة L4s أو البالغين حامل إلى جديد، المصنف NGM لوحة كل 3-4 أيام.
2. لوحات مخزن (مقلوب) يفضل أن يكون داخل حاضنة عند 15-22 درجة مئوية. تم تخزين الثقافات في المقايسات وصفها في 20 ° C. C. التنمية ايليجانس هو درجة الحرارة التي تعتمد على. كما maintenaNCE ارتفاع درجات الحرارة، والوقت بين مراحل النمو النقصان.

5) إعداد آجار الصويا زيتية (TSA) E. البرازية الثقافة وسائل الإعلام

1. لجعل 50 لوحات، وقياس 500 مل من العقيمة، الماء المقطر في دورق وتقديمهم ليغلي، مع التحريك، على موقد.
2. إضافة 20 غرام من مسحوق TSA أجار إلى قارورة والسماح حل حل.
3. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
4. يسمح الحل لتبرد إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي.
5. استخدام ماصات معقمة، إضافة 10 مل من محلول أجار لكل 60 مم البوليسترين طبق بيتري. السماح لوسائل الإعلام لترسيخ في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

6) إعداد مرق الصويا زيتية (TSB) E. البرازية الثقافة وسائل الإعلام

1. لجعل 250 أنابيب والثقافة، وقياس 500 مل من العقيمة، الماء المقطر في دورق ودافئة على موقد مع التحريك.
2. إضافة 15 غرام من مسحوق أجار TSB إلى قارورة والسماح للمسحوق حل.
3. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
4. يسمح حل لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة، ثم ماصة 2 مل إلى العقيمة، 5 مل أنابيب الاختبار.

7) إعداد الدماغ القلب تسريب (BHI) وسائل الاعلام، مع الستربتوميسين، لE. البرازية الثقافة

1. قياس 500 مل من العقيمة، الماء المقطر في دورق وتقديمهم ليغلي، مع التحريك، على موقد.
2. إضافة 26 غرام من BHI متوسطة إلى القارورة والسماح للحل حل.
3. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول في الظروف القياسية (121 رطل، 120 ° C، 20 دقيقة).
4. يسمح حل لتبرد إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي.
5. باستخدام تقنية معقمة، إضافة 0.5 مل من 10 ملغ / مل الستربتوميسين حل الأوراق المالية ودوامة لخلط.
6. إضافة 10 مل من محلول لكل 60 مم البوليسترين طبق بيتري.
7. السماح لوسائل الإعلام لترسيخ في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. لوحات مخزن (مقلوب) في 4 درجات مئوية حتى ساعات قليلة قبل الاستخدام.

8) المحافظة على E. البرازية سلالات

1. للحفاظ على E. الأسهم البرازية، استخدم حلقة عقيمة إلى خط المستعمرات الفردية على لوحات أجار الصويا زيتية منفصلة (TSA).
2. تنمو الثقافات عند 37 درجة مئوية خلال الليل. لوحات مخزن (مقلوب) في كيس مختوم أو مربع في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.

9) إعداد E. لوحات البرازية لEIW الفحص

1. تطعيم 2 مل ثقافة TSB مع مستعمرة من E. البرازية واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. ماصة 20 ميكرولتر من E. ثقافة البرازية على وسط المعدة لوحة بهي، الستربتوميسين، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

10) إعداد E. لوحات القولونية لEIW الفحص (لوحات التحكم)

1. تطعيم 100 مل B-إخوانهثقافة ال مع مستعمرة من E. القولونية OP50 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية
2. ماصة 20 ميكرولتر من ثقافة OP50 على مركز لوحة NGM غير المصنف والسماح لوحات المصنف لتجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

11) بيضة في الفحص دودة

1. اختيار 15-20 نظموا-L4 C. ايليجانس (الشكل 1) على وسط الحديقة من البكتيريا على استعداد BHI-بكتيريا E.- البرازية لوحة. يجب الحرص على عدم نقل الكثير من OP50 إلى لوحة بهي. اختيار نفس العدد من L4s إلى عنصر تحكم NGM-OP50 لوحة.
2. احتضان لوحات لمدة 40 ساعة عند 20 درجة مئوية.
3. إعداد 20٪ محلول التبييض. خلط مواد التبييض التجارية (6.0٪ هيبوكلوريت الصوديوم) مع حجم مناسب من الماء المقطر.
4. إضافة 10 قطرات ميكرولتر من محلول التبييض لعشرة مواقع متميزة على غطاء من البلاستيك (من دودة أو لوحة البكتيرية).
5. باستخدام معول دودة، دودة نقل واحدة في كل قطرة التبييض. بلطف دوامة غيض مناختيار في قطيرة التبييض للتأكد من وغسلها الدودة قبالة نهاية المعول (تأكيد عن طريق عرض قطيرة تحت المجهر تشريح).
6. السماح للبشرة حل لحوالي 10 دقيقة أو حتى انفجر الديدان مفتوحة، طرد البيض (الشكل 2). يجب الحرص على عدم نقل البيض من لوحة.
7. باستخدام مجهر تشريح، عد البيض في كل قطرة من التبييض.

النتائج

هذا الاختبار يسمح احد لتحديد عدد البيض المدورة ضمن C. ايليجانس بعد التعرض لE. البرازية. نظمت L4 تعرضوا الديدان (التي تتميز مساحة شفافة فوق الفرج، والشكل 1) إلى E. البرازية من خلال مرحلة البلوغ. بعد أربعين ساعة من التعرض للE. البرازية، وتبيض تم ت...

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية في أداء هذا الاختبار بنجاح هي: 1) باستخدام مخزونات تغذية جيدة من C. ايليجانس، 2) زراعة أنواع من البكتيريا واحدة على لوحة فحص، 3) تحديد بدقة نظموا L4 الديدان التعرض للE. البرازية، 4) حفظ الوقت التعرض لE. البرازية متناسقة عبر جميع المحاكمات ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000