Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

Resumen

Un ensayo de huevo-en-gusano (EIW) es un método útil para cuantificar el comportamiento de puesta de huevos. Las alteraciones de la postura de huevos pueden ser una respuesta de comportamiento del organismo modelo Caenorhabditis elegans A sustancias ambientales potencialmente nocivas, tales como las producidas por bacterias patógenas.

Resumen

C. elegans comportamiento de puesta de huevos se ve afectada por señales ambientales tales como la osmolaridad ¹ y la vibración ^2. Ante la falta total de alimentos C. elegans también dejan la puesta de huevos y retienen los huevos fertilizados en el útero ^3. Sin embargo, el efecto de diferentes fuentes de alimentos, especialmente bacterias patógenas y en particular de Enterococcus faecalis, en el comportamiento de puesta de huevos no está bien caracterizado. El ensayo de huevo-en-gusano (EIW) es una herramienta útil para cuantificar los efectos de diferentes tipos de bacterias, en este caso E. faecalis, en el comportamiento de puesta de huevos.

EIW ensayos implican contando el número de huevos retenidos en el útero de C. elegans ^4. El ensayo consiste en EIW blanqueo etapas, grávido adultos C. elegans para quitar la cutícula y se separan los huevos retenidos desde el animal. Antes de blanqueo, los gusanos están expuestos a las bacterias (o cualquier tipo de señal ambiental) Durante un período de tiempo fijo. Después del blanqueo, uno es muy fácilmente capaz de contar el número de huevos retenidos en el interior del útero de los gusanos. En este ensayo, un aumento cuantificable en la retención de huevo después de E. la exposición faecalis se puede medir fácilmente. El ensayo EIW es un ensayo de comportamiento que puede ser utilizado para la detección de bacterias potencialmente patógenas o la presencia de toxinas del medio ambiente. Además, el ensayo de EIW puede ser una herramienta para la detección de drogas que afectan neurotransmisor de señalización ya que el comportamiento puesta de huevos es modulada por los neurotransmisores como la serotonina y la acetilcolina ^5-9.

Introducción

Caenorhabditis elegans, un gusano redondo microscópica, de vida libre, es un organismo modelo utilizado tradicionalmente para estudiar los procesos de desarrollo y la señalización celular, debido a su anatomía transparente, el desarrollo bien caracterizado, totalmente secuenciado del genoma, en tiempo de generación corto, y la homología genética de los seres humanos . Más recientemente, C. elegans se ha convertido en un organismo modelo en el campo de la toxicología del medio ambiente y la inmunidad innata ^{10, 11.}

Estos gusanos hermafroditas auto-fertilizantes alcanzan la madurez sexual a los dos o tres días de la eclosión del huevo. Durante su ciclo de vida, C. elegans pasa por cuatro estadios larvales (L1-L4), antes de llegar a la edad adulta. Un aislado hermafrodita puede producir, en promedio, 300 crías dentro de los tres días de la fecundidad alta. En la madurez reproductiva C. elegans hermafroditas, los huevos fertilizados son retenidos dentro del útero durante varias horas antes de ser establecido. Lanúmero normal de los huevos almacenados en el útero a la vez (durante el pico fecundidad) es de entre diez y quince ^12. El número de huevos en el útero es una función tanto de la tasa de producción de huevos y la tasa de puesta de huevos. Los huevos fertilizados son expulsados ​​del útero por la contracción de los músculos vulvares dieciséis dispuestas alrededor de la abertura de la vulva ^13. Motoneuronas Hermafrodita específicos (HSN 's) y neuronas motoras VC sinapsis en los músculos vulvares que afectan a la contracción muscular y por lo tanto la puesta de huevos comportamiento ^5,7,13,14. La expulsión de los huevos desde el útero se produce debido a la actividad coordinada de las neuronas y los músculos.

Cultivos de laboratorio de C. elegans se plantean típicamente en una dieta de no patógenas de Escherichia coli OP50. En el medio natural, C. elegans entran en contacto con una variedad de fuentes de alimentos, tales como bacterias patógenas, que pueden ser potencialmente dañinos. Cuando se expone a sustancias nocivas enel medio ambiente, C. elegans retienen los huevos hasta que se convierte en el medio ambiente más favorable. Es de suponer que esta retención de huevo es un esfuerzo para proteger a sus crías.

En este huevo en el ensayo, C. gusano (EIW) elegans están expuestos a las bacterias potencialmente patógenas, Enterococcus faecalis, que se encuentra en el medio ambiente. La exposición a formas patógenas de E. faecalis puede causar una infección intestinal persistente e incluso la muerte en C. elegans ^15. La exposición a otras formas de bacterias patógenas han sido demostrado que afectan a la retención de huevo ^16,17, sin embargo, el efecto no se cuantificó. Además, el efecto de las cepas patógenas de E. ligeramente faecalis, cepas que no son inmediatamente letal, en el comportamiento de puesta de huevos no se ha estudiado.

EIW ensayos implican contando el número de huevos retenidos en el útero de C. elegans ^4. A pesar de que C. elegansson transparentes, los huevos se acumulan en el útero pueden ser difíciles de cuantificar en un animal intacto. El ensayo consiste en EIW blanqueo grávido adultos C. elegans que fueron expuestos a las bacterias por un período fijo de tiempo. La solución de cloro se disuelve la cutícula exterior dejando detrás de los huevos. Los huevos son de refracción a los efectos de cloro debido a la presencia de una cáscara de huevo. Después del blanqueo, uno es muy fácilmente capaz de contar el número de óvulos liberados desde el útero de los gusanos a blanqueo.

El ensayo descrito es un método simple, barato y rápido para cuantificar el número de huevos en el útero de una sola vez, y por lo tanto cuantificar los efectos de E. faecalis sobre la retención de huevos. Este ensayo se puede utilizar para cuantificar el efecto de otros tipos de bacterias, toxinas ambientales o fármacos sobre la retención de huevo. Este ensayo también tiene el potencial para ser utilizado como una pantalla para la patogenicidad bacteriana.

Protocolo

1) Preparación de nematodos Medio de Crecimiento (NGM)

1. Para hacer 50 platos, añadir 1,5 g de NaCl, 8,5 g Agar ultrapura, y 1,25 g de peptona al 1 Lflask.
2. Añadir 487,5 ml de H ₂ O al matraz. Agitar suavemente para mezclar y cubrir la apertura del frasco con un trozo de papel de aluminio.
3. Esterilizar la solución en autoclave a condiciones estándar (121 psi, 120 ° C, 20 min).
4. Dejar que la solución se enfríe a 45 ° C en un baño de agua.
5. A la solución, agregue el siguiente en orden: 500 l de colesterol a 5 mg / ml solución madre (en etanol), 500 l 1 M _CaCl2, 500 l 1 M _MgSO4, y 12,5 ml _KPO4 tampón (54,15 g KH ₂ PO ₄ y 17,8 g K ₂ HPO ₄ en 500 ml de H ₂ O), como se describe en el ^18.
6. Uso de pipetas estériles, añadir 10 ml de solución de agar a cada 60 mm de placa de Petri de poliestireno. Permita que el medio a solidificarse a temperatura ambiente Overnight.

2) Preparación de B caldo de E. coli Medios

1. Para hacer cinco 100 ml de cultivos, añadir 5,0 g de Bacto triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 5,0 g de NaCl a un vaso de precipitados.
2. Añadir agua destilada estéril hasta un volumen final de 500 ml. Calentar la solución en una placa caliente, mientras se agita, hasta que los solutos se han disuelto.
3. Verter 100 ml de caldo de B en cinco botellas de vidrio (por lo menos 200 ml de volumen).
4. Esterilizar en autoclave las soluciones en condiciones normales (121 psi, 120 ° C, 20 minutos).
5. Permitir caldo B se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso.

3) Siembra C. Placas Mantenimiento elegans

1. Después de permitir que NGM placas se sequen a temperatura ambiente durante al menos una semana, uno inocular 100 ml de caldo de cultivo B con unas pocas colonias de E. coli (OP50).
2. Crecer E. cultura coli a 37 ° C durante la noche.
3. Pipeta una o dos gotas (aproximadamente 10081; l) de OP50 cultura en el centro de cada placa de NGM. Las placas se apilan normalmente tapa hacia arriba. Cuando pipeteado (siembra), comenzar con la pipeta la cultura sobre la placa en la parte inferior de la pila. Su forma de trabajo de cada pila. Trate de no mover las placas después de la siembra, ya que es importante que la cultura no se acerque demasiado a los bordes de la placa.
4. Permitir a las placas sembradas se sequen a temperatura ambiente durante al menos una semana antes de usar.
5. Placas sembradas se almacenan (invertida) en recipientes de plástico sellados a temperatura ambiente.

4) Mantenimiento C. elegans cepas

1. Para mantener bien alimentados C. stocks elegans, un gusano utilizan elegir para pasar tres L4s o adultos grávidas a una nueva, sin semillas NGM placas cada 3-4 días.
2. Placas Tienda (invertida) preferentemente dentro de un incubador a 15 - 22 º C. Culturas en los ensayos descritos fueron almacenadas a 20 ° C. C. elegans desarrollo es dependiente de la temperatura. Como maintenana vez que aumenta la temperatura, el tiempo entre las etapas de desarrollo disminuye.

5) Preparación de agar de tripticasa de soja (TSA) E. faecalis Cultura Medios

1. Para 50 placas, mida 500 ml de agua destilada estéril en un frasco y llevar a ebullición, mientras se agita, en una placa calefactora.
2. Añadir 20 g de agar TSA en polvo a un matraz y permita que la solución para disolver.
3. Esterilizar en autoclave las soluciones en condiciones normales (121 psi, 120 ° C, 20 minutos).
4. Dejar que la solución se enfríe a 45 ° C en un baño de agua.
5. Uso de pipetas estériles, añadir 10 ml de solución de agar a cada 60 mm de placa de Petri de poliestireno. Permita que el medio se solidifican a temperatura ambiente durante la noche.

6) Preparación de caldo de soja tripticasa (TSB) E. faecalis Cultura Medios

1. Para hacer 250 tubos de cultivo, mida 500 ml de agua destilada estéril en un frasco y acogedor en una placa calefactora con agitación.
2. Añadir 15 g de polvo de agar TSB al matraz y permitir que el polvo se disuelva.
3. Esterilizar en autoclave las soluciones en condiciones normales (121 psi, 120 ° C, 20 minutos).
4. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente, a continuación, pipeta 2 ml en tubos de ensayo, 5 ml estériles.

7) Elaboración de medios de infusión cerebro corazón (BHI), con estreptomicina, por E. faecalis Cultura

1. Medir 500 ml de agua destilada estéril en un frasco y llevar a ebullición, mientras se agita, en una placa calefactora.
2. Añadir 26 g de medio BHI en el matraz y permita que la solución para disolver.
3. Esterilizar en autoclave las soluciones en condiciones normales (121 psi, 120 ° C, 20 minutos).
4. Deje que la solución se enfríe a 45 ° C en un baño de agua.
5. Utilizando una técnica estéril, añadir 0,5 ml de una solución madre de estreptomicina y agitar para mezclar 10 mg / ml.
6. Añadir 10 ml de la solución a cada uno de 60 mm de placa de Petri de poliestireno.
7. Permita que el medio para solidificar a temperatura ambiente durante la noche. Placas Tienda (invertida) a 4 ° C hasta pocas horas antes de su uso.

8) Mantener E. faecalis cepas

1. Para mantener E. stocks faecalis, use un asa estéril de racha colonias individuales en placas de agar de soja tríptico separados (TSA).
2. Los cultivos a 37 ° C durante la noche. Placas Tienda (invertida) en una bolsa sellada o caja a temperatura ambiente durante varias semanas.

9) Preparar E. Placas faecalis para EIW Ensayo

1. Inocular 2 ml de un cultivo TSB con una colonia de E. faecalis y se incuba durante la noche a 37 ° C.
2. Pipetear 20 l de E. cultura faecalis en el centro de una placa de BHI-estreptomicina preparado, y se incuban durante la noche a 37 ° C.

10) Preparación de E. Placas coli para EIW ensayo (placas de control)

1. Inocular un ml B-bro 100ª cultivo con una colonia de E. OP50 coli y se incuban durante la noche a 37 ° C
2. Pipetear 20 l de la cultura OP50 en el centro de una placa de NGM cabeza de serie y permitir que las placas sembradas se sequen a temperatura ambiente durante la noche.

11) Egg en el Ensayo Gusano

1. Elige 15-20 organizado-L4 C. elegans (Figura 1) en el centro de un césped de bacterias en un preparado BHI-Strep-E. placa faecalis. Tenga cuidado de no transferir una gran cantidad de OP50 a la placa BHI. Elija el mismo número de L4s a un control NGM-OP50 plato.
2. Incubar las placas durante 40 horas a 20 ° C.
3. Prepare una solución de lejía al 20%. Mezclar una lejía comercial (6,0% de hipoclorito de sodio) con el volumen apropiado de agua destilada.
4. Añadir 10 l gotas de lejía por diez lugares distintos en una tapa de plástico (de un gusano o placa bacteriana).
5. Con una selección de gusano, transferir un gusano en cada gota de lejía. Agite suavemente la punta de larecoger en la gota cloro para asegurarse de que el gusano se ha lavado de la final de la selección (confirmar al ver la gota en un microscopio).
6. Permitir la cutícula para disolver durante aproximadamente 10 minutos o hasta que los gusanos se abrieron de golpe, la expulsión de los huevos (Figura 2). Tenga cuidado de no trasladar los huevos a la plancha.
7. El uso de un microscopio de disección, contar los huevos en cada gota de lejía.

Resultados

Este ensayo permite cuantificar el número de huevos retenidos en C. elegans después de la exposición a E. faecalis. L4 escena gusanos (caracterizado por el espacio abierto transparente por encima de su vulva, Figura 1) fueron expuestos a E. faecalis a través de la edad adulta. Después de cuarenta horas de exposición a E. faecalis, se llevó a cabo el blanqueo. A medida que la cutícula se desintegró en la gota de lejía, los huevos se hicieron más evidentes

Discusión

Los pasos más importantes en la realización con éxito este ensayo son: 1) el uso de acciones bien alimentados de C. elegans, 2) cultivar tipos individuales de bacterias en la placa de ensayo, 3) identificar con precisión por etapas L4 gusanos para la exposición a E. faecalis, 4) mantener el tiempo de exposición a E. faecalis consistentes en todos los juicios y 5) el tiempo de blanqueo no debe exceder de diez minutos para evitar la desintegración de huevo.

Pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000