Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

Riepilogo

Un uovo-in-worm (EIW) saggio è un metodo utile per quantificare la deposizione delle uova comportamento. Alterazioni nella deposizione delle uova può essere una risposta comportamentale del modello di organismo Caenorhabditis elegans A sostanze ambientali potenzialmente nocivi come quelli prodotti da batteri patogeni.

Abstract

C. elegans comportamento di deposizione delle uova è influenzato da stimoli ambientali come osmolarità ¹ e vibrazioni ^2. In totale assenza di cibo C. elegans cessano anche ovodeposizione e conservano le uova fecondate nel loro utero ^3. Tuttavia, l'effetto di diverse fonti alimentari, in particolare i batteri patogeni e in particolare Enterococcus faecalis, sul comportamento ovodeposizione non è ben caratterizzata. L'uovo-a-vite senza fine (EIW) saggio è uno strumento utile per quantificare gli effetti di diversi tipi di batteri, in questo caso E. faecalis, il comportamento di deposizione delle uova.

Saggi EIW coinvolgono contando il numero di uova trattenuto nell'utero di C. elegans ^4. Il saggio EIW coinvolge lo sbiancamento in scena, gravido adulto C. elegans per rimuovere la cuticola e separare le uova trattenuti dal animale. Prima di sbianca, vermi sono esposti a batteri (o qualsiasi tipo di stimolo ambientale) Per un determinato periodo di tempo. Dopo lo sbiancamento, uno è molto facilmente in grado di contare il numero di uova trattenuti all'interno dell'utero dei vermi. In questo saggio, un incremento quantificabile in ritenzione di uova dopo la E. esposizione faecalis può essere facilmente misurato. Il saggio è un saggio EIW comportamentale che può essere usato per individuare batteri potenzialmente patogeni o la presenza di tossine ambientali. Inoltre, il saggio EIW può essere uno strumento per lo screening per i farmaci che influenzano neurotrasmettitore segnalazione dal comportamento di deposizione delle uova è modulato da neurotrasmettitori come la serotonina e acetilcolina ^5-9.

Introduzione

Caenorhabditis elegans, un microscopico, nematodi a vita libera, è un organismo modello tradizionalmente utilizzato per lo studio dello sviluppo delle cellule e dei processi di segnalazione per la sua anatomia trasparente, sviluppo ben caratterizzato, completamente sequenziato genoma, la generazione in tempo breve, e omologia genetica per l'uomo . Più recentemente, C. elegans è diventato un organismo modello nel campo della tossicologia ambientale e di immunità innata ^{10, 11.}

Questi auto-fertilizzanti vermi ermafroditi diventano sessualmente maturi entro due o tre giorni di cova dall'uovo. Durante il suo ciclo di vita, C. elegans passa attraverso quattro stadi larvali (L1-L4), prima di raggiungere l'età adulta. Un isolato ermafrodita in grado di produrre, in media, 300 prole entro tre giorni di picco di fecondità. In riproduttivamente maturo C. elegans ermafroditi, uova fecondate vengono mantenuti all'interno dell'utero per diverse ore prima di essere licenziati. Glinormale numero di uova memorizzati in utero in qualsiasi momento (durante l'alta fecondità) è tra i dieci ei quindici ^12. Il numero di uova in utero è funzione sia del tasso di produzione di uova e il tasso di deposizione. Uova fecondate vengono espulsi dall'utero dalla contrazione dei muscoli sedici vulval disposti intorno all'apertura della vulva ^13. Motoneuroni Ermafrodito-specifici (HSN di) e motoneuroni VC sinapsi sui muscoli vulvari influenzano la contrazione muscolare e quindi la deposizione delle uova comportamento ^5,7,13,14. Espulsione di uova dal dell'utero si verifica a causa di attività coordinata dei neuroni e muscoli.

Culture Lab di C. elegans sono allevati con una dieta di non patogeno Escherichia coli OP50. In ambiente naturale, C. elegans entrano in contatto con una varietà di fonti di cibo, come batteri patogeni, che possono essere potenzialmente dannosi. Quando esposti a sostanze nocive inl'ambiente, C. elegans conservano le uova fino a quando l'ambiente diventa più favorevole. Presumibilmente questo ritenzione uovo è uno sforzo per proteggere la loro progenie.

In questo uovo a vite senza fine (EIW) saggio, C. elegans sono esposti ai batteri potenzialmente patogeni, Enterococcus faecalis, che si trova nell'ambiente. L'esposizione a forme patogeni di E. faecalis possono causare infezione intestinale persistente e persino la morte in C. elegans ^15. Esposizione ad altre forme di batteri patogeni hanno mostrato di influenzare la ritenzione dell'uovo ^16,17, tuttavia l'effetto non è stato quantificato. Inoltre, l'effetto di lieve patogeni ceppi di E. faecalis, i ceppi che non sono immediatamente letale, sul comportamento delle uova non è stato studiato.

Saggi EIW coinvolgono contando il numero di uova trattenuto nell'utero di C. elegans ^4. Anche se C. eleganssono trasparenti, le uova si accumulano in utero possono essere difficili da quantificare in un animale intatto. Il saggio EIW coinvolge lo sbiancamento gravido adulto C. elegans che sono stati esposti ai batteri per un determinato periodo di tempo. La soluzione di candeggina scioglie la cuticola esterna lasciando dietro di sé le uova. Le uova sono refrattiva agli effetti della candeggina per la presenza di un guscio protettivo. Dopo sbianca, uno è molto facilmente in grado di contare il numero di uova rilasciate dall'utero dei vermi su di imbianchimento.

Il saggio descritto è un metodo semplice, economico e rapido per quantificare il numero di uova in utero in una sola volta, e quindi quantificare gli effetti di E. faecalis sulla ritenzione dell'uovo. Il test può essere utilizzato per quantificare l'effetto di altri tipi di batteri, tossine ambientali o farmaci sulla ritenzione uovo. Questa analisi ha anche il potenziale per essere utilizzato come schermo per la patogenicità batterica.

Protocollo

1) Preparazione di nematodi Crescita media (NGM)

1. Per fare 50 piatti, aggiungere 1,5 g di NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, e 1,25 g peptone a un 1 Lflask.
2. Aggiungere 487,5 ml di dH ₂ O a pallone. Agitare delicatamente per mescolare e coprire l'apertura del pallone con un pezzo di foglio di alluminio.
3. Sterilizzare la soluzione in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 min).
4. Lasciar raffreddare la soluzione a 45 ° C in un bagno d'acqua.
5. Per la soluzione, aggiungere quanto segue in ordine: colesterolo 500 microlitri di una 5 mg / ml soluzione madre (disciolto in etanolo), 500 microlitri 1 M CaCl _2, 500 ml 1 M _MgSO4, e 12,5 ml KPO ₄ tampone (54.15 g KH ₂ PO ₄ e 17,8 g di K ₂ HPO ₄ in 500 ml di dH ₂ O), come descritto in ^18.
6. Usando pipette sterili, aggiungere 10 ml di soluzione di agar per ogni polistirolo piastra di Petri di 60 mm. Lasciare i supporti a solidificare a temperatura ambiente overnight.

2) Preparazione di B Brodo E. coli media

1. Per fare cinque culture 100 ml, aggiungere 5,0 g di Bacto Tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 5,0 g di NaCl in un recipiente.
2. Aggiungere sterile, acqua distillata fino ad un volume finale di 500 ml. Riscaldare la soluzione su una piastra calda, mescolando, finché i soluti sono dissolti.
3. Versare 100 ml di brodo B in cinque bottiglie di vetro (almeno 200 ml di volume).
4. Sterilizzare le soluzioni in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 minuti).
5. Lasciare B brodo raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.

3) Semina C. elegans Piastre di manutenzione

1. Dopo aver lasciato piastre NGM ad asciugare a temperatura ambiente per almeno una settimana, inoculare un 100 ml di brodo di coltura B con alcune colonie di E. coli (OP50).
2. Crescere E. coli coltura a 37 ° C per una notte.
3. Pipetta di one-two gocce (circa 10081; l) di OP50 cultura sul centro di ciascuna piastra NGM. Le piastre sono in genere accatastati coperchio verso l'alto. Quando pipettaggio (semina), iniziare pipettando cultura sulla piastra in fondo alla pila. Il tuo lavoro su ogni pila. Cercare di non spostare le piastre dopo la semina, poiché è importante che la cultura non diventi troppo vicino ai bordi della lastra.
4. Lasciare le piastre seminate ad asciugare a temperatura ambiente per almeno una settimana prima di utilizzare.
5. Piastre seminate sono memorizzati (invertita) in contenitori di plastica sigillati a temperatura ambiente.

4) Il mantenimento di C. elegans Ceppi

1. Per mantenere ben nutrito C. scorte elegans, un verme usano scegliere di spostare tre L4S o adulti gravide di una nuova, testa di serie NGM piastra ogni 3-4 giorni.
2. Conservare le piastre (invertito) preferibilmente all'interno di un incubatore a 15 - 22 ° C. Culture in saggi descritti sono stati conservati a 20 ° C. C. sviluppo elegans è dipendente dalla temperatura. Come maintenance temperatura aumenta, il tempo tra fasi di sviluppo diminuisce.

5) Preparazione di Tryptic Soy Agar (TSA) E. faecalis cultura mediatica

1. Per fare 50 piastre, misurare 500 ml di acqua distillata sterile in un pallone e portare ad ebollizione, mescolando, su una piastra.
2. Aggiungere 20 g di polvere di agar TSA a pallone e permettere la soluzione di sciogliere.
3. Sterilizzare le soluzioni in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 minuti).
4. Lasciar raffreddare la soluzione a 45 ° C in un bagno d'acqua.
5. Usando pipette sterili, aggiungere 10 ml di soluzione di agar per ogni polistirolo piastra di Petri di 60 mm. Lasciare i supporti a solidificare a temperatura ambiente per una notte.

6) Preparazione di Tryptic Soy Broth (TSB) E. faecalis cultura mediatica

1. Per fare 250 provette di coltura, misurare 500 ml di acqua distillata sterile in un pallone e caldo su una piastra mescolando.
2. Aggiungere 15 g di agar-agar in polvere TSB al pallone e lasciare che la polvere si dissolva.
3. Sterilizzare le soluzioni in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 minuti).
4. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, poi pipetta 2 ml in provette, 5 ml sterili.

7) Preparazione di Brain Heart Infusion (BHI) media, con streptomicina, per E. faecalis Cultura

1. Misurare 500 ml di acqua distillata sterile in un pallone e portare ad ebollizione, mescolando, su una piastra.
2. Aggiungere 26 g di BHI mezzo al pallone e riportare la soluzione a sciogliere.
3. Sterilizzare le soluzioni in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 minuti).
4. Lasciare raffreddare la soluzione a 45 ° C in un bagno d'acqua.
5. Usando una tecnica sterile, aggiungere 0,5 ml di una soluzione madre e mescolare streptomicina 10 mg / ml.
6. Aggiungere 10 ml della soluzione di polistirene ogni piastra di Petri di 60 mm.
7. Consenti supporto a solidificare a temperatura ambiente per una notte. Conservare le piastre (invertito) a 4 ° C fino a poche ore prima dell'uso.

8) Il mantenimento di E. faecalis

1. Per mantenere E. scorte faecalis, usano un'ansa sterile per striatura singole colonie su agar piatti separati di soia triptici (TSA).
2. Grow culture a 37 ° C durante la notte. Memorizzare piastre (invertito) in un sacchetto sigillato o scatola a temperatura ambiente per diverse settimane.

9) Preparazione E. Piastre faecalis per EIW Assay

1. Seminare una cultura ml 2 TSB con una colonia di E. faecalis e incubare una notte a 37 ° C.
2. Pipettare 20 ml di E. cultura faecalis sul centro di una piastra BHI-streptomicina preparata, e incubare una notte a 37 ° C.

10) Preparazione E. Piastre coli per EIW Assay (placche di comando)

1. Seminare una ml B-bro 100Th cultura con una colonia di E. coli OP50 e incubare una notte a 37 ° C
2. Pipettare 20 microlitri della cultura OP50 sul centro di una piastra non seminata NGM e permettono le piastre seminate ad asciugare a temperatura ambiente per una notte.

11) Uovo in Worm Assay

1. Scegli 15 - 20 in scena-L4 C. elegans (Figura 1) sul centro di un prato di batteri su un preparato BHI-Strep-E. Piastra faecalis. Fare attenzione a non trasferire un sacco di OP50 alla piastra BHI. Scegliere lo stesso numero di l4s a un controllo NGM-OP50 piastra.
2. Incubare le piastre per 40 ore a 20 ° C.
3. Preparare una soluzione di candeggina al 20%. Mescolare un candeggina commerciale (6,0% ipoclorito di sodio) con l'appropriato volume di acqua distillata.
4. Aggiungere 10 gocce microlitri di soluzione di candeggina a dieci posizioni distinte su un coperchio di plastica (di un worm o un piatto batterica).
5. Utilizzando un piccone verme, trasferire una vite senza fine in ogni goccia di candeggina. Agitare delicatamente la punta delprendere in gocce di candeggina per assicurarsi che il worm ha lavato via la fine del plettro (confermare osservando la goccia sotto un microscopio da dissezione).
6. Lasciare che la cuticola di sciogliere per circa 10 minuti o fino a quando i vermi si spalancò, espellendo le uova (Figura 2). Fare attenzione a non trasferire le uova dalla piastra.
7. Utilizzando un microscopio da dissezione, contare le uova in ogni goccia di candeggina.

Risultati

Questo test permette di quantificare il numero di uova trattenuti all'interno C. elegans dopo esposizione a E. faecalis. L4 scena vermi (caratterizzati da trasparente spazi al di sopra loro vulva, Figura 1) sono stati esposti a E. faecalis fino all'età adulta. Dopo 40 ore di esposizione a E. faecalis, lo sbiancamento è stata eseguita. Come la cuticola disintegrato nel droplet candeggina, le uova divennero più evidenti (Figura 2). Il numero ...

Discussione

Le fasi più critiche eseguire con successo questo saggio sono: 1) utilizzando grammature ben nutriti di C. elegans, 2) coltivazione di singoli tipi di batteri sulla piastra saggio, 3) identificare accuratamente messo in scena L4 vermi per l'esposizione a E. faecalis, 4) tenere il tempo di esposizione a E. faecalis coerente in tutte le prove e le 5) Tempo di sbiancanti non dovrebbe superare i dieci minuti per evitare la disintegrazione uovo.

Per questo dosaggio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000