باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Summary

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Abstract

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Introduction

في هذا البروتوكول، ونحن تصف أساليب فعالة لكبح الجينات في خطوط خلايا البلاعم الماوس باستخدام الرناوات siRNAs ورصد آثار هذه العلاجات على الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تنفيذ هذه الإجراءات في شكل 96-جيدا، مما يسمح للشاشات رني في متوسطة أو عالية الإنتاجية الموضة.

ردا على إصابة البشر جبل الاستجابة المناعية الفطرية الفورية واستجابة أبطأ ولكن أكثر تحديدا المناعة التكيفية. وتتضمن هذه الاستجابة المناعية الفطرية السريعة تجنيد وتنشيط الخلايا المناعية الفطرية أكلة بما في ذلك الضامة ^1. وتشارك الضامة تفعيلها كلاسيكي في الاستجابات الالتهابية الحادة وتنتج البروتينات المضادة للميكروبات والمركبات، والسيتوكينات كيموكينات، ومستضدات موجودة ^2،3. الضامة تفعيلها بدلا من ذلك تلعب دورا في تنظيم الحصانة، والحفاظ على التسامح وإصلاح الأنسجة والتئام الجروح ^4-8. بسبب طائفة واسعة من الوظائف الخاصةيمكن الضامة تلعب دورا في العديد من الأمراض بما في ذلك تصلب الشرايين والتهاب المفاصل والسرطان ^9. وبالتالي، فإن دراسة الضامة مجالا رئيسيا للبحوث لبعض الوقت في طائفة واسعة من المجالات المرض.

على الرغم من أهميتها في الاستجابة المناعية الفطرية، الضامة يمكن أن يكون تحديا خلايا للعمل مع. على وجه الخصوص، فمن الصعب الحصول على ترنسفكأيشن كفاءة استخدام الكواشف الدهون في الضامة دون سمية المرتبطة ^10،11. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يتم تسليم سيرنا بكفاءة لالضامة، متانة الجين رني الناجم عن ضربة قاضية في كثير من الأحيان يمكن أن يكون معتدلا إلى حد ما ويمكن أن تختلف من الجينات إلى الجين.

للتغلب على هذه التحديات التقنية، قمنا الأمثل ترنسفكأيشن وتقنيات ضربة قاضية ^12-16 في اثنين من خطوط الخلايا الماوس بلعم، RAW264.7 ¹⁷ و ¹⁸ J774A.1. يستخدم هذا النهج AMAXA Nucleofector 96-جيدا نظام المكوك لترنسفكأيشن. هذا النظاميستخدم مزيجا من المواد الكيميائية المتخصصة و electroporation لبالنقل الخلايا في شكل 96-جيدا ^19. بعد ترنسفكأيشن، نحن تصف الأساليب لتعظيم الانتعاش الخلايا وقدرتها على البقاء وتعظيم اللاحقة التي يسببها سيرنا ضربة قاضية الجينات. لتوضيح فائدة هذا النهج، نحن تصف بروتوكول للتسليم سيرنا على هذه السطور خلية بلعم، وتحفيز هذه الخلايا مع عديد السكاريد الشحمي (بي إس)، ومراقبة الاستجابة المناعية الفطرية على مستوى إنتاج العديد من السيتوكينات الموالية للالتهابات. نحن نقدم بيانات العينة التي نعمل استهداف تول مثل مستقبلات (TLR) عائلة، أفرادها الشعور LPS والممرض المرتبطة أنماط الجزيئية الأخرى (PAMPs)، لتنظيم المناعة الفطرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. صيانة خطوط الخلايا البلعمية

1. تنمو RAW264.7 وخطوط الخلايا J774A.1 في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO _2. للمساعدة في الحفاظ العقم، إضافة 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا) في وسائل الإعلام (على الرغم من أن هذا ليس ضروريا بدقة).
2. خطوة حاسمة: تأكد من أن الضامة تنمو في حالة صحية لكفاءة ترنسفكأيشن سيرنا والتي يسببها ضربة قاضية الجينات. استخدام خلايا الممرات بين 3 و 10 بعد ذوبان الجليد النقي، وهذه خطوط بلعم تظهر أفضل كفاءة ترنسفكأيشن والحفاظ على بقاء قوة بعد ترنسفكأيشن في هذه المرحلة. لا تستخدم عددا مرور العالي (> 20)، وكفاءة ترنسفكأيشن وإسقاط الموروثة على حد سواء يقلل إلى حد كبير.
3. لالأمثل سيرنا ترنسفكأيشن، وخلايا لوحة عند 20٪ confluency وتنمو يوما أو يومين حتى تصل إلى خلايا لا يزيد عن 80٪ التقاء. وخلايا متضخمة لا بالنقل efficiently.

2. برمجة نظام المكوك 96-جيدا لترنسفكأيشن

1. بدء برنامج مكوك 96-جيدا على جهاز كمبيوتر متصل المكوك. حدد ملف المعلمة الجديد من أعلى القائمة ملف اليسرى.
2. تسليط الضوء على الآبار التي سيتم transfected على عرض 96 لوحة جيدا التخطيطي. سيقوم الصندوق الأخضر الذي يشير إلى الآبار ويتم اختيار.
3. حدد البرنامج الذي يتوافق مع خط خلية بلعم تستخدم (DS-136 لRAW264.7 أو DS-130 لJ774A.1)، ثم حدد تطبيق، وتقع تحت diagramed وحة 96-جيدا. ملاحظة أنه بعد اختيار البرنامج، سيتم الملونة الآبار على لوحة تخطيطية الأزرق الداكن. دوائر فارغة تشير إلى الآبار التي لم يتم تعيينها برنامج ولن تكون صدمة.

3. إعداد الكواشف لترنسفكأيشن

1. إعداد الحل Nucleofector ™ يعمل عن طريق خلط SF خط الخلية 96-جيدا الحل Nucleofector ™مع كامل محتويات أنبوب ملحق المغلقة. السماح للالكواشف المختلطة للتوازن في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها. تخزين الزائد الحل الكامل Nucleofector ™ في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر لاستخدامها في المستقبل.
2. قبل الدافئة المالحة DMEM، RPMI-1640، 0.25٪ التربسين / EDTA، والفوسفات مخزنة (PBS) في 37 درجة مئوية قبل إعداد الضامة لترنسفكأيشن.
3. إعداد سيرنا لترنسفكأيشن من قبل ذوبان على الجليد. من أجل تقليل عدد يذوب تجميد سيرنا، وتجميد الرناوات siRNAs جديدة مأخوذة في أول مرة تستخدم فيها.
4. في التجارب الأولية، واستخدام سيرنا بجرعة عالية نسبيا من 2 ميكرومتر (01:10 المخفف من 20 ميكرومتر الأسهم). بعد ذلك يعاير الرناوات siRNAs التي تحفز الجينات القوي ضربة قاضية الى جرعات أقل، على الرغم من أن هناك حاجة إلى جرعات أعلى عادة لكفاءة ضربة قاضية الجينات في الضامة مقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا.
   تتوفر الرناوات siRNAs من مصادر عديدة؛ ملاحظة: إلى حد ما قوية ضربة قاضية الجينات يمكن الحصول علىباستخدام SMARTPOOLs siGenome، وهي برك من أربعة الرناوات siRNAs تستهدف كل جين. كعنصر تحكم السلبية، أي استخدام مختلف حمامات غير مستهدفة أو سيرنا الرناوات siRNAs.
5. لمراقبة كفاءة ترنسفكأيشن، إما بالنقل سيطرة بلازميد pmaxGFP (المقدمة في مجموعات AMAXA) أو الرناوات siRNAs fluorescently المسمى، بالتوازي مع الرناوات siRNAs التجريبية. نتوقع 30-50٪ ترنسفكأيشن من البلازميد GFP (يعاير بواسطة المجهر أو التدفق الخلوي بعد يوم من ترنسفكأيشن) و> 99٪ من ترنسفكأيشن fluorescently المسمى سيرنا (يعاير التدفق الخلوي مباشرة بعد ترنسفكأيشن والإنعاش).

4. إعداد الضامة لترنسفكأيشن

1. فصل الضامة ملتصقة من أطباق زراعة الخلايا بواسطة trypsinization. نضح في وسائل الاعلام وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل PBS. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا مع ما قبل تحسنت 0.25٪ التربسين / EDTA (1 مل / 10 سم لوحة) لمدة 1-2 دقائق حتى تبدأ الخلايا لفصل. اضغط برفق لوحة ونقل المحاليلنشوئها خلال الحضانة لتعظيم trypsinization.
2. بعد الحضانة، إضافة 9 مل + سائل الاعلام DMEM FBS، مزيج بلطف صعودا وهبوطا، وجمع الخلايا بواسطة pipetting في أنبوب معقم.
3. حساب عدد الضامة معزولة باستخدام عدادة الكريات. نتوقع نحو 10 مليون دولار الضامة في 10 سم لوحة. حساب العدد الإجمالي للالضامة الحاجة؛ كل بئر على متن المكوك 96-جيدا يتطلب 200،000 الخلايا. تذكر أن تضيف قيمة بضع آبار إضافية "خلايا للسماح pipetting لخسائر.
4. ماصة عدد المحسوبة للخلايا في أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقيقة في 150 x ج في درجة حرارة الغرفة. لا أجهزة الطرد المركزي بسرعة كبيرة جدا لأن ذلك سوف يقلل الصحة بلعم والكفاءة ترنسفكأيشن.

5. Nucleofection الضامة مع سيرنا

1. استخدام معقم 96-جيدا لوحة أسفل جولة (التي يسهل الخلط مع تقليل فقدان كاشف)، إضافة 2 ميكرولتر من كل سيرنا إلى كل بئر لتكون transfECTED.
   ملاحظة: اعتمادا على عدد من الرناوات siRNAs، وهذا يمكن إنجازه خلال الخطوة بلعم الطرد المركزي.
2. نضح وسائل الإعلام من الخلايا بالطرد المركزي. resuspend بلطف الخلايا في حل Nucleofector ™ SF (التي تحتوي على الحل ملحق)، وذلك باستخدام 20 ميكرولتر لكل 200،000 خلايا مكعبات. مرة واحدة معلق، استخدام الخلايا فورا لترنسفكأيشن الأمثل.
3. نقل الخلايا معلق في حوض معقم. باستخدام ماصة الأقنية، ونقل 20 ميكرولتر من الخليط خلية معلق في كل بئر من لوحة 96-جيدا تحتوي على الرناوات siRNAs. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا.
4. نقل 20 ميكرولتر من الخليط خلية / سيرنا في 96-جيدا Nucleocuvette ™ لوحة خطوة حاسمة: تجنب توليد فقاعات خلال خطوة نقل مثل هذه الأخطاء يمكن أن تحدث أثناء Nucleofection.
5. بعد وضع جميع العينات التجريبية في لوحة ترنسفكأيشن، وتغطي لوحة 96-جيدا مع غطاء المقدمة والاصدارذ الاستفادة برفق على سطح صلب لإزالة أي فقاعات من العينات.
6. وضع لوحة 96-جيدا مع غطاء جيدا في 96 المكوكية Nucleofector واختر "تحميل وبدء" على أسفل يمين الشاشة البرنامج. قبل Nucleofection، اتبع موجه برنامج لحفظ النتائج.
   ملاحظة: أثناء عملية Nucleofection، سيتم تصوير الآبار tranfected بنجاح على التخطيطي 96-جيدا على الشاشة من خلال دائرة خضراء مع علامة زائد. وهناك دائرة حمراء مع وجود علامات تشير إلى ناقص خطأ، وعلى الأرجح بسبب فقاعات أو حجم الصحيح من الكواشف pipetting لسوء.

6. الإنعاش وتصفيح الضامة

1. مباشرة بعد Nucleofection، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 80 ميكرولتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) RMP1-1640 وسائل الإعلام إلى كل بئر. إضافة وسائل الإعلام إلى جانب كل بئر، مما يتيح وسائل الإعلام لخلط ببطء مع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، والتي هي حساسة جدا في هذه المرحلة. لا تضيف وسائل الإعلام بسرعة كبيرة، وهذه الإرادةانخفاض كبير جدوى.
2. وضع لوحات 96-جيدا مع عينات transfected وRPMI-1640 في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ لمدة 2 دقيقة. هذا أمر بالغ الأهمية لتسمح للخلايا للتعافي قبل مواصلة التلاعب.
3. إزالة لوحة 96-جيدا من الحاضنة ونقل بعناية خليط من كل بئر إلى 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة باستخدام ماصة الأقنية.
4. باستخدام ماصة متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من قبل تحسنت (37 درجة مئوية) + DMEM FBS المتوسطة إلى كل بئر.
5. احتضان 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مع العينات في حاضنة 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ ل24-36 ساعة (تحسين التوقيت الدقيق لالرناوات siRNAs الفردية، على الرغم من أن هذا النطاق الزمني يعمل بشكل جيد عموما).

7. تحفيز الضامة مع LPS

1. بعد 24-36 ساعة بعد Nucleofection الحضانة، وإعداد LPS (أو غيرها من PAMPs) في وسائل الإعلام الطازجة. إعداد ما يكفي من متوسطة جديدة لجميع الآبار (200 ميكرولتر مالقانونين / بئر من لوحة 96-جيدا زائد قليلا اضافية لpipetting ل). تمييع LPS إلى تركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل في DMEM FBS +.
2. وسائل الإعلام نضح بعناية من 96 لوحة جيدا وإضافة وسائل الإعلام الطازجة تحتوي على LPS إلى الخلايا.
3. مراقبة استجابة لLPS أو PAMPs أخرى في أوقات مختلفة بعد التحفيز. 6 ساعة كافية لتوليد قوة استجابة خلوى التهابات السيتوكينات لمثل IL-6 أو TNFα.

8. رصد الاستجابة المستحثة الفطرية المناعي، إسقاط الموروثة، واستمرار في الضامة

1. لمراقبة يسببها LPS-إنتاج السيتوكينات، ماصة طاف من الخلايا إلى صفيحة تخزين 96-جيدا. ومن ثم يمكن قياس إنتاج السيتوكينات بواسطة ELISA.
2. مرة واحدة تتم إزالة طاف، ومراقبة بقاء الخلية باستخدام فلوريسئين ثنائي الأسيتات (عندما المشقوق من قبل esterases الخلوية في الخلايا الحية، ويصبح هذا المركب الفلورسنت). تحديد الرناوات siRNAs التي تستهدف الجينات التي تتحكم في بقاء الخلية باستخدام رنهجه. ملاحظة: يجب أن يكون عملية ترنسفكأيشن نفسها تأثير قليل على جدوى إذا أجريت بشكل صحيح.
   1. إضافة ثنائي الأسيتات فلوريسئين (5 ملغ / مل الأسهم في الأسيتون) إلى كل بئر (1: 100 التخفيف النهائي في PBS).
   2. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل1-5 دقيقة ثم مراقبة مضان في الخلايا باستخدام قارئ لوحة (460 نانومتر الإثارة، 515 الانبعاث نانومتر).
   3. اختياري: لضمان أن مضان في الآبار موحد، ليز الخلايا باستخدام مخازن مثل RIPA. وهذا يوفر إشارة الفلورسنت موحدة في البئر، كما يتم تكوين بعض القراء لوحة لمراقبة سوى جزء صغير من البئر. إذا لم يتم مطلي الخلايا بشكل موحد، يمكن للثنائي الأسيتات فلوريسئين تعطي قراءة غير دقيقة.
3. كبديل لمراقبة بقاء الخلية، ومراقبة الجينات التي يسببها سيرنا ضربة قاضية من قبل QPCR باستخدام RNA المستمدة من الخلايا الملتصقة.
   1. بعد إزالة طاف من الخلايا (الخطوة 8.1 أعلاه)، إعلانعازلة د RLT (الذي يستخدم لتحلل والحفاظ على RNA) مباشرة إلى الخلايا الملتصقة إلى ليز لهم.
   2. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مستحضر عدة RNA مثل RNeasy مصغرة عدة، واستخدام QPCR مع الاشعال الجينات المحددة لمراقبة الجينات ضربة قاضية بالنسبة للسيطرة على العلاج سيرنا. استخدام التمهيدي لΒactin أو GAPDH للتطبيع.
4. كبديل آخر لرصد جوانب أخرى من الاستجابة المناعية الفطرية، ومراقبة القدرة أكلة من الضامة بإضافة المسمى FITC E. جسيمات القولونية مباشرة على الخلايا الملتصقة باستخدام عدة. بعد بروتوكول الشركة المصنعة، والتي تستغرق بضع ساعات فقط، ومراقبة امتصاص أكلة باستخدام قارئ لوحة أو المجهري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

للتدليل على كفاءة ترنسفكأيشن باستخدام هذا النهج، فإننا مراقبة امتصاص FITC المسمى سيرنا باستخدام عداد الكريات تدفق (الشكل 1).

لتوضيح فائدة نهجنا لرصد الاستجابة المناعية الفطرية، فإننا transfected الرناوات siRNAs استهداف الجينات ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد نشرت العديد من الدراسات التي تم فيها استهداف الجينات الفردية عن طريق سيرنا في الضامة الفئران. بينما الدهون بوساطة ترنسفكأيشن تم استخدامها لتقديم سيرنا على خطوط خلايا البلاعم على أساس فردي، وهذه الأساليب تعاني من الآثار المحتملة على قدرتها على البقاء، ضربة قاضي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle system	Lonza	AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit	Lonza	V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-67
siGenome smartpool siRNA	Dharmacon	varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool	Dharmacon	D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporation	Invitrogen	13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS	List Biological Laboratories	421
DMEM, high glucose	Invitrogen	11995-065
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)	Fisher	SV30010
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
96-well tissue culture plates	Fisher	07-200-89
96-well round bottom sterile plates (not coated)	Fisher	07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY410
Fluorescein diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
RLT buffer	Qiagen	79216
RNeasy mini kit	Qiagen	74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit	Invitrogen	V-6694