באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Summary

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Abstract

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Introduction

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות יעילים כדי לדכא גנים בשורות תאי מקרופאג עכבר באמצעות siRNAs ולעקוב אחר ההשפעות של טיפולים אלה בתגובה החיסונית המולדת. נהלים אלה מתבצעים בפורמט 96-היטב, המאפשרים למסכי RNAi באופנה בינונית או תפוקה גבוהה.

בתגובה לזיהום, בני אדם הר תגובה מיידית של מערכת חיסון מולדת ותגובה חיסונית אדפטיבית איטית אבל יותר ספציפית. תגובה חיסונית מולדת מהירה זה כוללת את הגיוס והפעלה של תאים חיסוניים מולדים phagocytic כוללים מקרופאגים ^1. מקרופאגים מופעלים קלסי מעורבים בתגובות דלקתיות חריפות ולייצר חלבונים אנטי-מיקרוביאלי ותרכובות, ציטוקינים וכמוקינים, והווה אנטיגנים ^2,3. מקרופאגים מופעלים לחלופין למלא תפקיד בויסות חסינות, שמירה על סובלנות, תיקון רקמות, וריפוי פצעי ^4-8. בגלל המגוון הרחב של פונקציות שלהם, מקרופאגים יכולים לשחק תפקיד במספר רב של מחלות, כולל טרשת עורקים, דלקת פרקים וסרטן ^9. כך, המחקר של מקרופאגים היה אזור עיקרי של מחקר כבר כמה זמן במגוון רחב של תחומים מחלה.

למרות חשיבותם בתגובה החיסונית המולדת, מקרופאגים יכולים להיות מאתגרים תאים לעבוד איתו. בפרט, קשה להשיג transfection יעיל באמצעות ריאגנטים שומנים במקרופאגים ללא הרעלה כרוכה ^10,11. יתר על כן, גם כאשר siRNA מועבר ביעילות למקרופאגים, על חוסנו של הגן מושרה RNAi מציאה לעתים קרובות יכול להיות מתון למדי ויכול להשתנות מגן לגן.

כדי להתגבר על אתגרים טכניים אלה, יש לנו מותאמים transfection וטכניקות מציאה ^12-16 בשתי שורות תאי מקרופאג העכבר, RAW264.7 ¹⁷ וJ774A.1 ^18. גישה זו עושה שימוש במערכת הסעות 96, גם Amaxa Nucleofector לtransfection; מערכת זומשתמש בשילוב של חומרים כימיים וelectroporation מיוחדים transfect תאים בפורמט 96-גם ^19. בעקבות transfection, אנו מתארים שיטות למקסם את התאוששות תא כדאיות ועל מנת למקסם את מציאה גן מושרה siRNA שלאחר מכן. כדי להמחיש את התועלת של גישה זו, אנו מתארים פרוטוקול למסירת siRNA לשורות תאי מקרופאג אלה, לעורר תאים אלה עם lipopolysaccharide (LPS), ולנטר את התגובה החיסונית המולדת ברמת ייצור של כמה ציטוקינים פרו-דלקתיים. אנו מספקים נתונים לדוגמה שבה אנו ממקדים משפחת קולט Toll-like (TLR), שחבריה לחוש LPS ודפוסים אחרים הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs), להסדיר חסינות מולדת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תחזוקה של שורות תאי מקרופאג

1. לגדול RAW264.7 ושורות תאי J774A.1 DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) בשעה 37 ºC בנוכחות של 5% CO _2. כדי לסייע לשמור על סטריליות, להוסיף 1% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) לתקשורת (אם כי זה לא ממש הכרחי).
2. צעד קריטי: ודא שמקרופאגים גדלים במצב בריא עבור transfection יעיל ומציאת גן מושרה siRNA. השתמש בתאים בין קטעי 3 ו -10 לאחר הפשרה טריות, כקווי מקרופאג הללו מפגינים יעילות transfection הטובה ביותר ולשמור על הישרדות לאחר transfection חזק בשלב זה; לא להשתמש במספר גבוה יותר מעבר (> 20), כיעילות transfection וגן מציאה שני יקטינו מאוד.
3. עבור transfection siRNA מותאם, תאי צלחת בconfluency 20% ולגדול יום או יומיים עד שהתאים מגיעים ללא מפגש יותר מ -80%. תאי מגודלים לא transfect efficiently.

2. תכנות מערכת הסעות 96-גם לTransfection

1. הפעל את תוכנת הסעות 96, גם על המחשב המחובר להסעות. בחר קובץ פרמטר חדש מתפריט הקובץ השמאלי העליון.
2. סמן את הבארות שיהיה transfected על סכמטי צלחת 96-היטב המוצגות. קופסא ירוקה תציין שבארות נבחרות.
3. בחר את התכנית המתאימה לשורת תא מקרופאג בשימוש (DS-136 לRAW264.7 או DS-130 לJ774A.1) ובחר להחיל, ממוקמת מתחת לצלחת 96-היטב diagramed. שים לב שלאחר בחירת תכנית, הבארות על הצלחת סכמטי תהיה בצבע כחולה כהה. חוגים ריקים מצביעים על בארות שלא הוקצו בתכנית ולא יהיו בהלם.

3. הכנת ריאגנטים לTransfection

1. הכן את פתרון Nucleofector ™ עובד על ידי ערבוב שורת תאי SF 96, גם פתרון Nucleofector ™עם כל התכולה של צינור תוספת המצורפת. לאפשר ריאגנטים המעורבים לאזן בטמפרטורת חדר לפני השימוש. אחסן פתרון עודף מלא Nucleofector ™ ב 4 ºC עד 3 חודשים לשימוש עתידי.
2. טרום חם מלוח DMEM, RPMI-1640, טריפסין 0.25% / EDTA, ופוספט שנאגר (PBS) בשעה 37 ºC לפני הכנת מקרופאגים לtransfection.
3. הכן את siRNA לtransfection על ידי הפשרה על קרח. על מנת לצמצם את מספר מפשיר הקפאה של siRNA, להקפיא siRNAs החדשה בaliquots הפעם הראשונה שהם נמצאים בשימוש.
4. בניסויים ראשוניים, להשתמש siRNA במינון גבוה יחסית של 2 מיקרומטר (בדילול 01:10 מ -20 מיקרומטר מניות). בהמשך לכך לכייל siRNAs שגורמת לגנים חזקים מציאה עד למינונים נמוכים יותר, אם כי במינונים גבוהים יותר בדרך כלל יש צורך במציאת גן יעיל במקרופאגים בהשוואה לסוגי תאים אחרים.
   הערה: siRNAs זמינות ממקורות רבים; למדי ניתן להשיג מציאה גן חזקהבאמצעות SMARTPOOLs siGenome, שברכות של ארבע siRNAs מיקוד כל גן. כביקורת שלילית, להשתמש בכל בריכות שונות במיקוד שאינו siRNA או siRNAs.
5. כדי לפקח על יעילות transfection, transfect או פלסמיד pmaxGFP השליטה (בתנאי בערכות Amaxa) או siRNAs fluorescently שכותרתו במקביל לsiRNAs הניסיונית. מצפה transfection 30-50% של פלסמיד GFP (assayed על ידי מיקרוסקופ או cytometry זרימת היום לאחר transfection) וtransfection> 99% מsiRNA fluorescently שכותרתו (assayed ידי cytometry זרימה מייד לאחר transfection והתאוששות).

4. הכנת המקרופאגים לTransfection

1. ניתוק מקרופאגים חסיד ממנות התרבות של תאים על ידי trypsinization. לשאוב את התקשורת ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר PBS. לאחר הסרת PBS, דגירה התאים עם מראש חימם 0.25 טריפסין% / EDTA (1 מיליליטר / 10 סנטימטר צלחת) ל1-2 דקות עד שתאים מתחילים לנתק. לטפוח בעדינות את הצלחת ולהעביר את solution במהלך הדגירה על מנת למקסם את trypsinization.
2. לאחר הדגירה, להוסיף 9 מיליליטר DMEM תקשורת + FBS, מערבב בעדינות מעלה ומטה, ולאסוף את התאים על ידי pipetting לתוך צינור סטרילי.
3. לספור את המספר של מקרופאגים המבודדים באמצעות hemocytometer. מצפה בערך 10 מיליון מקרופאגים לכל 10 צלחת סנטימטר. לחשב את המספר הכולל של מקרופאגים צורך; כל טוב שבאטל 96 גם דורש 200,000 תאים. זכור להוסיף את השווי של כמה בארות נוספות של תאים, כדי לאפשר להפסדי pipetting.
4. פיפטה המספר המחושב של תאים לתוך צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה התאים עבור 10 דקות ב XG 150 בטמפרטורת חדר. אל צנטריפוגות מהר מדי כמו זה יהיה להפחית בריאות מקרופאג ויעילות transfection.

5. nucleofection של המקרופאגים עם siRNA

1. באמצעות היטב 96 צלחת סטרילית תחתית עגול (המאפשר ערבוב תוך מזעור הפסד מגיב), להוסיף 2 μl של כל siRNA לכל transf גם להיותected.
   הערה: בהתאם למספר siRNAs, זה יכול להיות מושלם במהלך שלב צנטריפוגה מקרופאג.
2. לשאוב את התקשורת מתאי centrifuged. בעדינות resuspend תאי פתרון Nucleofector ™ SF (המכילים את פתרון התוסף), באמצעות 20 μl ל200,000 תאים pelleted. ברגע שresuspended, להשתמש בתאים באופן מיידי לtransfection האופטימלי.
3. העבר את תאי resuspended לתוך שוקת סטרילי; בעזרת פיפטה רבה, העברת 20 μl של תערובת תאים המושעית זה לבאר כל צלחת 96-היטב המכילה את siRNAs. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
4. העברה 20 μl של תערובת התא / siRNA לתוך 96-גם צלחת Nucleocuvette ™ צעד קריטי:. למנוע יצירת בועות במהלך שלב ההעברה כמו זה יכול לגרום לשגיאות במהלך nucleofection.
5. לאחר הצבת כל דגימות ניסוי בצלחת transfection, מכסה את הצלחת 96-היטב עם המכסה וVer סיפקy לטפוח בעדינות על משטח קשה כדי להסיר בועות מהדגימות.
6. מניחים צלחת 96-היטב עם מכסה ל96-גם הסעות Nucleofector ובחר 'להעלות ולהתחיל "בצד הימין למטה של ​​מסך התכנית. לפני nucleofection, בצע את הפקודה התכנית כדי לשמור את התוצאות.
   הערה: במהלך תהליך nucleofection, בארות tranfected הצלחה תהיה להיות מתוארות על 96, גם סכמטי על המסך על ידי עיגול ירוק בסימן חיובי. עיגול אדום עם סימני מינוס מציין שגיאה, ככל הנראה בשל בועות או אמצעי האחסון הנכון של חומרים כימיים pipetting-רע.

שחזור 6. וציפוי של המקרופאגים

1. מייד לאחר nucleofection, בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 80 μl של מחוממים מראש (37 ºC) RMP1-1640 תקשורת היטב כל אחד. הוסף את התקשורת לצד של כל טוב, המאפשר התקשורת לערבב באיטיות עם תאי transfected, שהם מאוד עדינים בשלב זה. אל תוסיף את התקשורת מהר מדי, כרצון זובמידה ניכר את הכדאיות.
2. מקם את צלחות 96-גם עם דגימות transfected וRPMI-1640 לחממת 37 ºC עם 5% CO ₂ למשך 2 דקות; זה הוא קריטי כדי לאפשר לתאים להתאושש לפני לקדם מניפולציה.
3. הסר את צלחת 96-היטב מהחממה ולהעביר בזהירות את התערובת מכל טוב לצלחת תרבית רקמת 96, גם בעזרת פיפטה רבה.
4. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף מ( 37 ºC) DMEM בינוני מחומם מראש + FBS 100 μl היטב כל אחד.
5. דגירה את צלחת 96-גם רקמת התרבות עם דגימות בחממה 37 ºC עם 5% CO ₂ ל24-36 שעות (לייעל את העיתוי המדויק לsiRNAs בודדת, אם כי טווח זמן זה בדרך כלל עובד היטב).

7. גירוי של המקרופאגים עם LPS

1. לאחר הדגירה לאחר nucleofection 24-36 שעות, להכין LPS (או PAMPs אחר) בתקשורת טרי. להכין מדיום טרי מספיק עבור כל הבארות (מ '200 μlעדיה / היטב צלחת 96-היטב בתוספת תוספת קטנה עבור pipetting). לדלל LPS לריכוז סופי של 20 ng / ml בDMEM + FBS.
2. תקשורת בזהירות לשאוב מצלחת 96-היטב ומוסיפה את התקשורת הטרי המכילה LPS לתאים.
3. צג התגובה לLPS או PAMPs האחר בזמנים שונים לאחר גירוי. 6 שעות מספיקות כדי ליצור תגובת ציטוקינים דלקתית חזקה לציטוקינים כגון IL-6 או TNFα.

8. ניטור המושרה מולדת התגובה החיסונית, ג'ין מציאה, ויכולת הקיום בהמקרופאגים

1. כדי לפקח על מושרה LPS ייצור ציטוקינים, פיפטה supernatant מהתאים לתוך צלחת אחסון 96-היטב. ייצור ציטוקינים לאחר מכן ניתן למדוד על ידי ELISA.
2. ברגע שsupernatant מוסר, לפקח על כדאיויות תא באמצעות diacetate והעמסת (כאשר ביקעו ידי esterases הסלולרי בתאים חיים, המתחם הזה הופך ניאון). לזהות siRNAs כי יעד הגנים ששולטות כדאיות תא באמצעות tהגישה שלו. הערה: תהליך transfection עצמו יהיה השפעה מועטת על יכולת קיום אם מבוצע כראוי.
   1. להוסיף diacetate והעמסת (5 מ"ג / מיליליטר מניות באצטון) זה טוב (1: 100 דילול סופי PBS).
   2. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 4:59 דקות ולאחר מכן לעקוב אחר הקרינה בתאים באמצעות קורא צלחת (460 עירור ננומטר, 515 פליטת ננומטר).
   3. אופציונאלי: כדי להבטיח שהקרינה בבארות היא אחידה, lyse התאים באמצעות מאגרים כגון ריפה; זה מספק אות ניאון אחידה בבאר, כחלק מקוראי הצלחת מוגדרים לפקח רק חלק קטן מהבאר; אם התאים אינם מצופים באופן אחיד, diacetate והעמסת יכול לתת קריאה מדויקת.
3. כחלופה למעקב כדאיות תא, לעקוב אחר הגן מושרה siRNA מציאה על ידי qPCR באמצעות RNA הנגזר מהתאים חסיד.
   1. לאחר supernatant הוא להסיר את התאים (שלב 8.1 לעיל), מודעהחיץ ד RLT (המשמש לתמוגה ושימור של RNA) ישירות לתאים חסיד לlyse.
   2. בודד RNA באמצעות ערכת הכנת RNA כגון RNeasy מיני הערכה, ולהשתמש qPCR עם פריימרים גן ספציפי כדי לפקח על גן יחסי מציאה לשלוט טיפול siRNA. השתמש בפריימרים לΒactin או GAPDH לנורמליזציה.
4. כחלופה נוספת כדי לפקח על היבטים אחרים של התגובה החיסונית המולדת, לפקח על יכולת phagocytic של מקרופאגים על ידי הוספת א-שכותרתו FITC חלקיקי coli ישירות על התאים חסיד באמצעות ערכה. בעקבות הפרוטוקול של היצרן, אשר לוקח רק כמה שעות, לפקח ספיגת phagocytic באמצעות קורא צלחת או במיקרוסקופ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להדגים את היעילות של transfection שימוש בגישה זו, אנו במעקב ספיגה של siRNA FITC שכותרתו באמצעות cytometer זרימה (איור 1).

כדי להמחיש את התועלת של הגישה שלנו לבקרה על התגובה החיסונית המולדת, אנו transfected siRNAs מיקוד גני רגולטורי חיסון מולד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקרים רבים שפורסמו שבגנים בודדים היו ממוקדים על ידי siRNA במקרופאגים העכבריים. בעוד transfection תיווך שומנים נעשה שימוש כדי לספק siRNA לשורות תאי מקרופאג על בסיס אישי, שיטות אלה סובלים מהשפעות אפשריות על כדאיות, מציאה גן מוגבלת, ושונות מגן לגן. לפתח מבחני חזקים יותר שיכול לשמ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle system	Lonza	AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit	Lonza	V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-67
siGenome smartpool siRNA	Dharmacon	varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool	Dharmacon	D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporation	Invitrogen	13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS	List Biological Laboratories	421
DMEM, high glucose	Invitrogen	11995-065
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)	Fisher	SV30010
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
96-well tissue culture plates	Fisher	07-200-89
96-well round bottom sterile plates (not coated)	Fisher	07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY410
Fluorescein diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
RLT buffer	Qiagen	79216
RNeasy mini kit	Qiagen	74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit	Invitrogen	V-6694