En utilisant l'ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Résumé

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Résumé

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Introduction

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes efficaces pour inhiber des gènes dans des lignées cellulaires de macrophages de souris à l'aide de siRNA et de surveiller les effets de ces traitements sur la réponse immunitaire innée. Ces procédures sont effectuées en format 96 puits, permettant écrans ARNi de la mode à moyen ou haut débit.

En réponse à une infection, l'homme une réponse immunitaire innée immédiate et une réponse immunitaire adaptative plus lente mais plus précise. Cette réponse immunitaire innée rapide comprend le recrutement et l'activation des cellules immunitaires innées, y compris les macrophages phagocytaires ^1. Macrophages activées de façon classique sont impliquées dans les réponses inflammatoires aiguës et produisent des protéines antimicrobiennes et composés, les cytokines et les chimiokines, et les antigènes présents ^2,3. Macrophages activés alternativement jouent un rôle dans la régulation de l'immunité, le maintien de la tolérance, la réparation des tissus, cicatrisation des plaies et ^4-8. En raison de leur large éventail de fonctions, Les macrophages peuvent jouer un rôle dans de nombreuses maladies, y compris l'athérosclérose, l'arthrite, le cancer et ^9. Ainsi, l'étude des macrophages a été un élément clé de la recherche depuis un certain temps dans une grande variété de domaines des maladies.

En dépit de leur importance dans la réponse immunitaire innée, les macrophages peut être difficile de travailler avec des cellules. En particulier, il est difficile d'obtenir une transfection efficace en utilisant des réactifs lipidiques dans les macrophages sans toxicité associée ^10,11. En outre, même lorsque le siRNA est rendu efficace à des macrophages, la robustesse de gène induite par ARNi démontable peut être assez souvent modérée et peut varier d'un gène à gène.

Pour remédier à ces difficultés techniques, nous avons optimisé la transfection et des techniques knockdown ^12-16 dans deux lignées de cellules de type macrophage de souris, RAW264.7 ¹⁷ et ¹⁸ J774A.1. Cette approche utilise la 96 puits système de navette Amaxa Nucleofector pour la transfection; ce systèmeutilise une combinaison de réactifs spécialisés et l'électroporation pour transfecter des cellules dans un format à 96 puits ^19. Après la transfection, on décrit des procédés pour optimiser la récupération et la viabilité cellulaire et de maximiser la suite gène induite par effet de choc de siRNA. Pour illustrer l'utilité de cette approche, nous décrivons un protocole de délivrance d'ARNi de ces lignées de cellules macrophages, stimuler ces cellules avec du lipopolysaccharide (LPS) et contrôler la réponse immunitaire innée à l'échelle de la production de plusieurs cytokines pro-inflammatoires. Nous fournissons des données de l'échantillon dans lequel nous ciblons la famille des récepteurs Toll-like (TLR), dont les membres sentir LPS et autres motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP), pour réguler l'immunité innée.

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Protocole

1. Entretien de lignées cellulaires de macrophages

1. Cultiver RAW264.7 et des lignées de cellules J774A.1 dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C en présence de 5% de CO _2. Pour aider à maintenir la stérilité, ajouter 1% de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) aux médias (bien que ce ne soit pas strictement nécessaire).
2. Étape critique: Veiller à ce que les macrophages sont de plus en plus dans un état ​​sain pour la transfection efficace et knockdown gène siRNA induite. Utiliser des cellules entre passages 3 et 10 après décongélation frais, comme ces lignes de macrophages présentent la meilleure efficacité de la transfection et maintenir robuste survie post-transfection à ce stade; ne pas utiliser un numéro de passage plus élevé (> 20), que l'efficacité de la transfection et gène Knockdown fois diminuent considérablement.
3. Pour optimiser la transfection de siRNA, les cellules des plaques à 20% de confluence et les poussent un ou deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent pas plus de 80% de confluence. Cellules envahies ne transfecter efficiently.

2. Programmation du système de navette à 96 puits pour la transfection

1. Lancez le logiciel de navette de 96 puits sur l'ordinateur connecté à la navette. Sélectionnez nouveau fichier de paramètres dans le menu en haut à gauche du fichier.
2. Mettez en surbrillance les puits qui seront transfectées sur le affichée plaque de 96 puits schématique. Une boîte verte indique que les puits sont sélectionnés.
3. Sélectionnez le programme qui correspond à la lignée cellulaire de macrophages utilisé (DS-136 pour RAW264.7 ou DS-130 pour J774A.1) et sélectionnez Appliquer, située en dessous de la plaque de 96 puits schématisé. Notez que, après la sélection d'un programme, les puits de la plaque schématique seront colorés en bleu foncé. Cercles vides indiquent puits qui ne sont pas attribués un programme et ne seront pas choqués.

3. Préparation des réactifs pour la transfection

1. Préparer la solution de travail Nucleofector ™ en mélangeant SF lignée cellulaire de 96 puits solution Nucleofector ™avec la totalité du contenu du tube en supplément joint. Laisser les réactifs mixtes à équilibrer à température ambiante avant de l'utiliser. Stocker l'excès de solution complète Nucleofector ™ à 4 ° C pendant 3 mois pour une utilisation future.
2. Préchauffer la solution saline DMEM, RPMI-1640, 0,25% de trypsine / EDTA, et tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C avant de préparer les macrophages pour la transfection.
3. Préparer le siRNA pour la transfection par la fonte de la glace. Afin de minimiser le nombre des dégels gel du siRNA, geler de nouveaux siRNA en aliquots la première fois qu'ils sont utilisés.
4. Dans les premières expériences, utiliser siRNA à une dose relativement élevée de 2 pm (01:10 dilué de 20 pm stocks). Titrer la suite siRNA gène qui induisent robuste démontable vers le bas à des doses plus faibles, bien que des doses plus élevées sont nécessaires en général pour effet de choc efficace de gènes dans des macrophages par rapport à d'autres types de cellules.
   NOTE: siRNA sont disponibles à partir de nombreuses sources; assez robuste knockdown de gène peut être obtenuutilisant SmartPools de siGenome, qui sont les piscines de quatre siRNA ciblant chaque gène. Comme témoin négatif, utiliser l'une des diverses piscines non-ciblage siRNA ou siRNA.
5. Pour contrôler l'efficacité de transfection, transfecter soit le plasmide contrôle pmaxGFP (fourni dans le kit Amaxa) ou siRNA marqués par fluorescence en parallèle avec les siRNA expérimentales. Expect 30 à 50% de la transfection de plasmide GFP (analysé par cytométrie en flux ou microscopie jours après la transfection) et> 99% de transfection de siRNA marqué par fluorescence (analysé par cytométrie de flux, immédiatement après la transfection et la récupération).

4. Préparer les macrophages pour la transfection

1. Détachez les macrophages adhérents des boîtes de culture cellulaire par traitement à la trypsine. Aspirer les médias et laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS. Après avoir enlevé le PBS, incuber les cellules avec préchauffé 0,25% de trypsine / EDTA (1 ml / 10 cm plaque) pendant 1-2 min jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Tapoter légèrement la plaque et déplacer la solution lors de l'incubation de maximiser la trypsine.
2. Après l'incubation, ajouter 9 ml de milieu DMEM + FBS, mélanger doucement de haut en bas, et de recueillir les cellules par pipetage dans un tube stérile.
3. Comptez le nombre de macrophages isolés à l'aide d'un hémocytomètre. Attendez environ 10 millions de macrophages par 10 cm plaque. Calculer le nombre total de macrophages nécessaires; chaque puits sur la navette 96 puits nécessite 200 000 cellules. Pensez à ajouter la valeur des cellules de quelques puits supplémentaires de cas de pertes de pipetage.
4. Pipeter le nombre calculé de cellules dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 150 x g à température ambiante. Ne pas centrifuger trop rapidement car cela diminue la santé des macrophages et l'efficacité de la transfection.

5. nucléofection de macrophages avec siRNA

1. L'utilisation d'un plaque de 96 puits à fond rond stérile (qui facilite le mélange tout en minimisant la perte de réactif), ajouter 2 pi de chaque siRNA à chaque puits pour être transfète.
   Remarque: En fonction du nombre de siRNA, ceci peut être réalisé au cours de l'étape de centrifugation des macrophages.
2. Aspirer les médias à partir des cellules centrifugés. Resuspendre doucement les cellules de solution Nucleofector ™ SF (contenant la solution de complément), en utilisant 20 pi par 200 000 cellules sédimentées. Une fois remis en suspension, utiliser les cellules immédiatement pour la transfection optimale.
3. Transfert cellules remises en suspension dans une cuve stérile; à l'aide d'une pipette multicanaux, le transfert de 20 pl du mélange de cellules remis en suspension dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant le siRNA. Mélanger doucement par aspiration et refoulement.
4. Transférer 20 pl du mélange de cellules / siRNA dans la plaque à 96 puits Nucleocuvette ™ étape critique:. Éviter de générer des bulles lors de l'étape de transfert, car cela peut provoquer des erreurs durant nucléofection.
5. Après avoir placé tous les échantillons expérimentaux dans la plaque de transfection, couvrir la plaque de 96 puits avec le couvercle fourni, very touchez doucement sur une surface dure pour éliminer les bulles à partir des échantillons.
6. Placer la plaque de 96 puits avec couvercle dans le 96 puits navette Nucleofector et sélectionnez «télécharger et démarrer 'en bas à droite de l'écran du programme. Avant nucléofection, suivez l'invite de programme pour enregistrer les résultats.
   Remarque: Durant le processus nucléofection, puits transfectées avec succès seront représentés sur le 96 bien schématique à l'écran par un cercle vert avec un signe plus. Un cercle rouge avec un signe moins indique une erreur, probablement en raison de bulles ou mal pipetage le volume correct de réactifs.

6. Récupération et placage de macrophages

1. Immédiatement après nucléofection, à l'aide d'une pipette multicanaux, ajouter 80 ul de pré-chauffé (37 ° C) RMP1-1640 médias à chaque puits. Ajouter les médias sur le côté de chaque puits, permettant aux médias de mélanger lentement avec les cellules transfectées, qui sont très délicat à ce stade. Ne pas ajouter les médias trop vite, comme cette volontédiminuer considérablement la viabilité.
2. Placer les plaques à 96 puits et transfectées avec des échantillons du milieu RPMI-1640 dans un incubateur à 37 ° C avec 5% _de CO2 pendant 2 min; ce qui est essentiel pour permettre aux cellules de se rétablir avant une autre manipulation.
3. Retirer la plaque à 96 puits à partir de l'incubateur et de les transférer avec précaution le mélange à partir de chaque puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits en utilisant une pipette multicanaux.
4. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 ul de pré-chauffé (37 ° C) du milieu DMEM + FBS à chaque puits.
5. Incuber le 96 et le tissu plaque de culture avec des échantillons dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 24-36 heures (optimiser le moment exact de siRNA individuels, bien que cette plage de temps fonctionne généralement bien).

7. La stimulation des macrophages avec LPS

1. Après le 24-36 h post-nucléofection incubation, préparer LPS (ou autre PAMP) dans un milieu frais. Préparer suffisamment milieu frais pour tous les puits (200 pi media / puits de la plaque de 96 puits et un peu plus de pipetage). Diluer le LPS à une concentration finale de 20 ng / ml dans du DMEM + FBS.
2. Médias aspirer délicatement de la plaque de 96 puits et ajouter les milieux frais contenant les LPS aux cellules.
3. Surveiller la réponse au LPS ou d'autres PAMP à divers moments après la stimulation. 6 heures est suffisante pour générer une réponse de cytokine inflammatoire robuste pour des cytokines telles que l'IL-6 ou TNF.

8. Suivi de la réponse immunitaire innée induite, Gene Knockdown, et la viabilité dans les macrophages

1. Pour surveiller induite par le LPS production de cytokines, pipeter le surnageant des cellules dans une plaque de 96 puits de stockage. La production de cytokine peut être ensuite mesurée par ELISA.
2. Une fois que le surnageant est éliminé, surveiller la viabilité des cellules en utilisant le diacétate de fluorescéine (lorsqu'il est clivé par des estérases cellulaires dans les cellules vivantes, ce composé est fluorescent). Identifier les siRNA ciblant les gènes qui contrôlent la viabilité des cellules en utilisant tson approche. Remarque: le processus de transfection lui-même devrait avoir peu d'effet sur la viabilité si elle est effectuée correctement.
   1. Ajouter diacétate de fluorescéine (5 mg / ml dans de l'acétone actions) à chaque puits (1: 100 dilution finale dans du PBS).
   2. Incuber à température ambiante pendant une à cinq minutes, puis surveiller la fluorescence dans les cellules en utilisant un lecteur de plaque (460 nm d'excitation, 515 nm émission).
   3. Facultatif: Pour veiller à ce que la fluorescence dans les puits est uniforme, la lyse des cellules en utilisant des tampons tels que RIPA; cela fournit un signal fluorescent uniforme dans le puits, comme certains lecteurs de plaques sont configurés pour surveiller seulement une petite partie du puits; si les cellules ne sont pas étalées uniformément, le diacétate de fluorescéine pourrait donner une lecture inexacte.
3. Comme alternative à la surveillance de la viabilité cellulaire, contrôler gène induite par le siRNA-knockdown par qPCR en utilisant l'ARN provenant des cellules adhérentes.
   1. Après que le surnageant est séparé des cellules (étape 8.1 ci-dessus), annonced tampon RLT (qui est utilisé pour la lyse et la préservation de l'ARN) directement aux cellules adhérentes de les lyser.
   2. Isoler l'ARN en utilisant un kit de préparation d'ARN tels que le mini-kit RNeasy, et en utilisant qPCR avec des amorces spécifiques d'un gène par rapport au gène surveiller démontable pour contrôler le traitement des siRNA. Utilisez amorces à Βactin ou GAPDH pour la normalisation.
4. Comme autre alternative à surveiller d'autres aspects de la réponse immunitaire innée, surveiller la capacité phagocytaire des macrophages par l'addition marqué au FITC E. particules coli directement sur ​​les cellules adhérentes en utilisant un kit. Suivant le protocole du fabricant, qui ne prend que quelques heures, contrôler l'absorption phagocytaire utilisant un lecteur de plaque ou microscopie.

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Résultats

Pour démontrer l'efficacité de la transfection en utilisant cette approche, nous avons suivi l'absorption de FITC marqué siRNA l'aide d'un cytomètre de flux (Figure 1).

Pour illustrer l'utilité de notre approche pour le suivi de la réponse immunitaire innée, nous avons transfecté siRNA ciblant des gènes de régulation de l'immunité innée connus dans la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7, stimulé les cellules avec L...

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Discussion

De nombreuses études ont été publiées dans lequel les gènes individuels ont été pris pour cible par siRNA dans les macrophages murins. Bien que la transfection médiée par des lipides a été utilisé pour fournir des siRNA pour les lignées de cellules macrophages sur une base individuelle, ces méthodes souffrent des effets potentiels sur la viabilité, knock-down de gènes limitée, et la variabilité du gène à gène. Pour développer des tests plus robustes qui pourraient être utilisés pour cibler les g?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle system	Lonza	AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit	Lonza	V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-67
siGenome smartpool siRNA	Dharmacon	varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool	Dharmacon	D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporation	Invitrogen	13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS	List Biological Laboratories	421
DMEM, high glucose	Invitrogen	11995-065
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)	Fisher	SV30010
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
96-well tissue culture plates	Fisher	07-200-89
96-well round bottom sterile plates (not coated)	Fisher	07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY410
Fluorescein diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
RLT buffer	Qiagen	79216
RNeasy mini kit	Qiagen	74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit	Invitrogen	V-6694