Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Özet

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Özet

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Giriş

Bu protokol, biz siRNA'ları kullanarak fare makrofaj hücre hatlarında genleri inhibe ve doğal immün yanıt üzerindeki bu tedavilerin etkilerinin izlenmesi için etkin yöntemler açıklanmaktadır. Bu prosedürler, orta ya da yüksek verimli bir şekilde RNAi ekranlar için izin veren, 96-kuyu formatında gerçekleştirildi.

Enfeksiyona yanıt olarak, insanlar hemen doğuştan gelen bağışıklık tepkisini daha yavaş olan ancak daha özel bir uyum sağlayıcı bağışıklık tepkisi. Bu hızlı doğal immün yanıt makrofajlar ¹ olmak üzere fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri toplanmasını ve aktivasyonunu içerir. Klasik olarak aktif makrofajlar, akut enflamatuar yanıtlarda rol oynayan ve antimikrobiyal proteinlerin ve bileşiklerin, sitokinler ve kemokinleri ve antijenlerini ^2,3 üretirler. Alternatif aktive makrofajlar hoşgörüyü, doku onarımı bakımı, bağışıklık düzenlenmesinde rol oynar ve ^4-8 yara iyileşmesi. Çünkü işlevleri onların geniş dizi, Makrofajlar ateroskleroz, arterit, kanser ve ⁹ da dahil olmak üzere pek çok hastalıkta önemli bir rol oynayabilir. Bu nedenle, makrofajların çalışma hastalık alanları arasında bir yelpazede bir süre için bir araştırma anahtar alanı olmuştur.

Doğuştan gelen bağışıklık tepki olarak önemine rağmen, makrofajlar ile çalışmak için hücreler zor olabilir. Özellikle, toksisitesi, ^10,11 makrofajların lipid reaktifler kullanılarak verimli transfeksiyona elde etmek zordur. Ayrıca, siRNA verimli makrofajlar teslim olduğunda bile, genellikle demonte RNAi neden geninin sağlamlığı oldukça ılımlı olabilir ve gen için gen arasında değişebilir.

Bu teknik zorlukları aşmak için, iki fare makrofaj hücre hatları, RAW264.7 ¹⁷ ve J774A.1 ¹⁸ transfeksiyonuna ve demonte teknikleri ^12-16 optimize ettik. Bu yaklaşım, transfeksiyon için Amaxa Nucleofector 96 oyuklu Servisi Sistemi kullanır; bu sistemin96-çukurlu formatta ¹⁹ hücreleri transfekte etmek için özel reaktifler ve elektroporasyon bir kombinasyonunu kullanır. Transfeksiyondan ardından, yöntem hücresi geri kazanımı ve canlılığı maksimize etmek ve daha sonra, siRNA ile uyarılan gen demonte üst düzeye çıkarmak için tarif etmektedir. Bu yaklaşımın faydasını göstermek için, lipopolisakkarit (LPS) ile bu hücreleri uyarır ve çeşitli pro-enflamatuar sitokinlerin üretim düzeyinde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin izlenmesi, aşağıdaki makrofaj hücre hatlarına siRNA taşınması için bir protokol açıklar. Biz üyeleri LPS ve diğer patojen ilişkili moleküler şekilleri (üzerine durmaktadır) duygusu, doğuştan gelen bağışıklık düzenleyen Toll-benzeri reseptör (TLR) ailesi, hangi hedef örnek veri sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Makrofaj Hücre Hatları 1. Bakım

1. RAW264.7 Büyüme ve DMEM içinde J774A.1 hücre hatları,% 5 _CO2 varlığında 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. , Kısırlık korumaya yardımcı (bu kesinlikle gerekli olmasa da) medyaya% 1 penisilin / streptomisin (pen / strep) ekleyin.
2. Kritik adım: makrofajlar verimli nakil ve siRNA kaynaklı gen demonte için sağlıklı bir durumda büyüyen emin olun. Bu makrofaj soylarında altında en iyi transfeksiyon verimi sergiler ve bu aşamada sağlam post-transfeksiyon yaşamının devam taze, çözüldükten sonra geçitler 3 ve 10 arasında hücreleri kullanmak; de büyük ölçüde azalır demonte transfeksiyon verimi ve gen gibi, daha yüksek bir geçiş numarası (> 20) kullanmayın.
3. Hücreler, en fazla% 80 kaynaşmaya eriştikten kadar optimize siRNA Transfeksiyon için, levha 20% konfluansta pleytlendi hücreleri ve bir ya da iki gün büyür. Büyümüş hücreleri effic transfekte olmaziently.

2. Transfeksiyon için 96 oyuklu servisi sistem programlama

1. Mekik bağlı bilgisayarda 96-iyi servis yazılımını başlatın. Sol üst dosya menüden yeni bir parametre dosyayı seçin.
2. Görüntülenen 96 oyuklu plaka şekil üzerine transfekte edilecek kuyu Vurgu. Yeşil bir kutu seçilir hangi kuyular gösterecektir.
3. Diagramed 96-plaka altında bulunan (J774A.1 için RAW264.7 veya DS-130 DS-136) kullanılan ve uygulamak seçeneğini makrofaj hücre hattı, karşılık programı seçin. Bir programı seçtikten sonra, şematik plaka üzerinde kuyu koyu mavi renkli olacaktır unutmayın. Boş çevreler bir program atanmış değil ve şok olmayacaktır kuyu gösterir.

3. Transfeksiyon için, reaktiflerin hazırlanması

1. SF hücre hattı karıştırılarak çalışma Nucleofector ™ çözeltisi hazırlayın 96 oyuklu Nucleofector ™ çözümükapalı ek tüpün tüm içeriği ile. Karışık reaktifler, kullanılmadan önce oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Ileride kullanmak üzere 3 aya kadar 4 ° C'de aşırı komple Nucleofector ™ çözümü saklayın.
2. Ön sıcak transfeksiyonu için makrofajlan hazırlamadan önce 37 ° C'de DMEM, RPMI-1640,% 0.25 tripsin / EDTA, ve fosfat tamponlu tuz (PBS).
3. Buz üzerinde eritilmesi ile transfeksiyonu için siRNA hazırlayın. SiRNA donma çözülür sayısını en aza indirmek için, alikotlarda kullanıldıkları ilk kez yeni siRNA'ları dondurmak.
4. Başlangıç ​​deneylerinde, (20 uM stoktan 1:10 seyreltilmiş) 2 uM nispeten yüksek bir dozda siRNA kullanın. Tipik olarak daha yüksek dozlar diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında, makrofajlarda etkili gen demonte için gerekli olmasına rağmen sonra, daha düşük dozlar aşağı doğru demonte sağlam genini endüklemese siRNA'lar titre edilir.
   NOT: siRNA'lar birçok kaynaktan mevcuttur; Oldukça sağlam gen demonte elde edilebilirHer genini hedefleyen dört siRNA'ların havuzları siGenome SMARTPOOLs kullanarak. Bir negatif kontrol olarak, çeşitli non-hedefleme siRNA havuzları veya siRNA'lar herhangi birini kullanabilirsiniz.
5. , Transfeksiyon verimini izlemek deney siRNA'lar paralel pmaxGFP kontrol (Amaxa kitlerinde) plazmid veya floresan ile etiketlenmiş siRNA'lar ya da transfekte etmek. GFP plazmidi% 30-50 transfeksiyonu (mikroskopi ile analiz edilir veya transfeksiyondan bir gün sonra akış sitometrisi) ve (transfeksiyon ve geri kazanımdan sonra sitometrisi hemen akış ile tahlil), flüoresan-işaretli siRNA'nın>% 99 transfeksiyon bekliyoruz.

4. Transfeksiyonu için makrofajlan hazırlanması

1. Tripsinizasyon ile hücre kültür tabaklarından yapışkan makrofajlar ayırın. Ortamı aspire ve 10 ml PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. PBS uzaklaştırıldıktan sonra, hücreler ile inkübe hücreleri ayırmak alıncaya kadar 1-2 dakika boyunca% 0.25 tripsin / EDTA (1 mi / 10 cm plaka), önceden ısıtılmış. Yavaşça plaka dokunun ve Solu hareketinkübasyon sırasında siyon tripsinizasyon maksimize etmektir.
2. İnkübasyondan sonra, steril bir tüpe pipetleme hücreleri, 9 mi DMEM FBS ortamı ilave yukarı ve aşağı, yavaşça karıştırın ve toplayın.
3. Hemasitometre kullanarak izole makrofajlar sayısını. 10 cm plaka başına kabaca 10 milyon makrofajlar bekliyoruz. Gerekli makrofaj sayısı hesaplanır; iyi 96 kuyu mekik her 200.000 hücreleri gerektirir. Pipet kayıplar için izin vermek hücrelerin fazladan birkaç kuyu değerinde eklemeyi unutmayın.
4. Bir santrifüj tüpüne hücre hesaplanan sayısı Pipet. Oda sıcaklığında, 150 x g'de 10 dakika boyunca hücreler santrifüjleyin. Bu makrofaj sağlık ve transfeksiyon verimliliği azaltacak gibi çok hızlı santrifüj etmeyin.

SiRNA ile Makrofagların 5. Nucleofection

1. (Tepkin madde kaybını minimize ederken karışmasını kolaylaştırır), steril bir 96-gözenekli yuvarlak tabanlı bir plaka kullanarak, her bir oyuğa olduğu transf her siRNA 2 ul ekleandırılmaktadır.
   Not: siRNA'lar sayısına bağlı olarak, bu makrofaj santrifüj aşaması esnasında gerçekleştirilebilmektedir.
2. Santrifüj hücrelerden ortam aspire. Yavaşça peletlendi 200.000 hücre başına 20 ul kullanarak, (ek solüsyon içeren) Nucleofector ™ çözümü SF hücreleri tekrar süspansiyon. Yeniden süspansiyon haline sonra, en iyi transfeksiyon için hemen hücreleri kullanır.
3. Steril bir çukur içine süspanse hücreler aktarın; siRNA'lar ihtiva eden 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna transfer yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücre karışımı 20 ul, bir çok kanallı pipet kullanarak. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
4. Transfer 96 oyuklu Nucleocuvette ™ plaka içine hücre / siRNA karışımı 20 ul Kritik adım.: Bu nucleofection sırasında hataları indükleyebileceği transfer adımı sırasında kabarcıkları sakınmayı.
5. Transfeksiyon plakasında Deney örneklerinin her yerleştirildikten sonra, Resim kapak ve ver 96 oyuklu plaka kapağıy yavaşça örneklerinde herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için sert bir yüzeye dokunun.
6. Program ekranın sağ alt 'upload ve start' 96 kuyu Nucleofector mekik içine kapaklı 96-plaka yerleştirin ve seçin. Nucleofection önce, sonuçları kaydetmek için program istemini izleyin.
   Not: Nucleofection sürecinde, başarıyla tranfected kuyular bir artı işareti ile yeşil bir daire ile ekranda 96-kuyu şematik tasvir edilecektir. Eksi işaretleri ile kırmızı bir daire kabarcıkların veya mis-pipetlenmesinden reaktiflerin doğru hacmi için, büyük olasılıkla bir hata gösterir.

6. Kurtarma ve Makrofagların Kaplama

1. Hemen nucleofection sonra, çok kanallı bir pipet kullanılarak, her bir oyuğa RMP1-1640 ortamı önceden ısıtılmış (37 ° C) 80 ul ekle. Ortam yavaş yavaş bu aşamada çok hassas olan transfekte edilmiş hücreler ile karışmasına imkân verilmesi, her bir oyuğa tarafına ortam ekleyin. Bu irade gibi, çok hızlı ortam eklemeyinbüyük ölçüde canlılığını azaltır.
2. 2 dakika boyunca% 5 _CO2 içeren bir 37 ° C inkübatör içine transfekte edilmiş numuneleri ile RPMI-1640 ile 96 oyuklu plakalar yerleştirin; Bu hücrelerin manipülasyonu daha ileri önce kurtarmak için sağlamak açısından önemlidir.
3. Inkübatör 96 oyuklu plaka çıkarın ve dikkatli bir şekilde bir çok kanallı pipet kullanılarak 96 oyuklu bir doku kültür plakasının her bir kuyudan karışımı aktarın.
4. Bir çok kanallı pipet kullanarak, her bir oyuğa önceden ısıtılmış (37 ºC), DEM + FBS orta 100 ul ekleyin.
5. 24-36 saat boyunca% 5 _CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde örnekleri ile 96 oyuklu doku kültürü plakası (bu zaman aralığı genel olarak iyi çalışmasına rağmen, tek tek siRNA'lar için tam zamanlama optimize) inkübe edin.

LPS ile Makrofagların 7. uyarılması

1. 24-36 saat sonra-Nucleofection inkübe edildikten sonra, taze ortam içinde LPS ile (ya da diğer üzerine durmaktadır) maddesinin hazırlanması. Edilen kuyuların tümü için yeterli taze ortam hazırlayın (200 ul m,edia / oyuk, 96 oyuklu plaka artı pipetleme için fazladan). DMEM FBS içinde 20 ng / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar LPS seyreltin.
2. 96 gözlü levhadan dikkatlice aspire ortam ve hücreler LPS içeren taze ortam ilave edin.
3. Stimülasyon sonrasında çeşitli zamanlarda LPS veya diğer üzerine durmaktadır yanıtı izlemek. 6 saat, IL-6 veya TNFa gibi sitokinler için sağlam bir enflamatuar sitokin tepkisi meydana getirmek için yeterlidir.

8. Makrofagların yılında Başlatılan Doğuştan Bağışıklık Tepkisi, Gen demonte ve canlılık İzleme

1. LPS-kaynaklı sitokin üretimini izlemek için, 96-çukurlu bir depolama plakasına hücrelerden süpernatant pipetle. Sitokin üretimi daha sonra ELISA ile ölçülebilir.
2. Süpernatan kaldırıldıktan sonra, floresan diasetat kullanılarak hücre yaşamı sürdürme kabiliyetini izlemek (canlı hücrelerde hücresel esterazlarla ayrılır zaman, bu bileşik, flüoresan hale gelir). T kullanılarak hücre canlılığı kontrol eden genleri hedef siRNA'ları tespitOnun yaklaşımı. Not: düzgün yapıldığı takdirde transfeksiyon sürecinin kendisi canlılığı üzerinde çok az etkiye sahip olması gerekmektedir.
   1. (: 100, PBS içinde nihai sulandırma 1), her bir sıra için floresan diasetat (aseton içinde 5 mg / ml stok) ilave et.
   2. Beş dakika için bir oda sıcaklığında inkübe edin ve bir plaka okuyucusu (460 nm eksitasyon, 515 nm emisyon) kullanılarak hücrelerdeki floresan izler.
   3. İsteğe bağlı: kuyularda floresan homojen olduğundan emin olmak üzere, bu gibi RIPA gibi tamponlar kullanılarak lize hücreleri; Bazı levha okuyucular de sadece küçük bir bölümünü izlemek için yapılandırılmış olan bu, kuyunun içinde üniform floresan sinyali sağlar; hücreler eşit kaplama değilse, floresandiasetat bir yanlış okuma verebilir.
3. Hücre canlılığı izlenmesi için bir alternatif olarak, yapışan hücrelerden türetilen RNA kullanılarak qPCR demonte siRNA teşvik etmiş geni izler.
   1. Süpernatanı, hücrelerden çıkarılır sonra reklam (yukarıda 8.1 adım a)bunları eritmek doğrudan yapışık hücrelere (liziz ve RNA korunması için kullanılır) D RLT tamponu.
   2. Örneğin, RNeasy Mini kit gibi bir RNA hazırlama kiti kullanılarak RNA izole edilir ve gen siRNA tedavi kontrolü için demonte göreceli izlemek için gen spesifik primerler ile qPCR kullanın. Normalleşmesi için Βactin için astar veya GAPDH kullanın.
4. Başka bir alternatif ise, doğal immun cevabın başka yönlerini izlemek için de, sonra ya FITC-etiketli E. ekleyerek makrofagların fagositik yeteneği izlemek doğrudan bir kit kullanılarak yapışık hücreler üzerine E. coli parçacıklar. Sadece birkaç saat sürer üreticinin protokolünü takiben, bir plaka okuyucu veya mikroskopi kullanılarak fagositik alımını izlemek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu yaklaşımı kullanarak transfeksiyon etkinliğini göstermek için, bir akış sitometresi (Şekil 1) kullanılarak, FITC-işaretli siRNA'nın alımını izlenir.

Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı izlemek için bir yaklaşım kullanışlılığını tasvir etmek için, biz, RAW264.7 makrofaj hücre hattı bilinen doğuştan gelen bağışıklık düzenleyici genler hedef siRNA'lar transfekte LPS ile stimüle edilen hücreler, daha sonra pro-enflamatuar si...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Çok sayıda çalışma, burada tek tek genler sıçangil makrofaj siRNA tarafından hedef alınmıştır yayınlanmıştır. Lipit aracılı transfeksiyon bireysel olarak makrofaj hücre hatlarına siRNA teslim etmek için kullanılmış olsa da, bu yöntemler, bir genden genine canlılığı, sınırlı gen demonte ve değişkenlik olası etkileri muzdarip. Orta veya yüksek verimli bir şekilde genlerin hedeflenmesi için kullanılabilecek daha sert tahlilleri geliştirmek için, gen demonte içinde daha fazla kıvam...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle system	Lonza	AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit	Lonza	V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-67
siGenome smartpool siRNA	Dharmacon	varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool	Dharmacon	D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporation	Invitrogen	13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS	List Biological Laboratories	421
DMEM, high glucose	Invitrogen	11995-065
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)	Fisher	SV30010
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
96-well tissue culture plates	Fisher	07-200-89
96-well round bottom sterile plates (not coated)	Fisher	07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY410
Fluorescein diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
RLT buffer	Qiagen	79216
RNeasy mini kit	Qiagen	74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit	Invitrogen	V-6694