عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

Summary

يصف هذا البروتوكول وسيلة لاستخراج الرنا صغيرة من مصل الإنسان. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لعزل microRNAs من مصل السرطان للاستخدام في صفائف الحمض النووي وأيضا singleplex PCR الكمي. بروتوكول يستخدم الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف مع بعض التعديلات لانتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية.

Abstract

تحليل الحمض النووي الريبي والتعبير هو سمة مشتركة في العديد من المختبرات. أهمية هو ظهور الرنا الصغيرة مثل microRNAs، والتي توجد في خلايا الثدييات. هذه الرناوات الصغيرة هي المنظمين الجينات القوية السيطرة على الممرات الحيوية مثل النمو والتنمية والموت والكثير من الاهتمام وقد وجهت في التعبير عنها في سوائل الجسم. ويرجع ذلك إلى التقلبات في الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السرطان وإمكانية تطبيقها والمؤشرات الحيوية مصل هذا. ومع ذلك، فإن تحليل ميرنا التعبير في المصل قد يكون مشكلة. في معظم الحالات من كمية المصل يحد ويحتوي على كميات قليلة من المصل الحمض النووي الريبي مجموع، والتي تشكل الرنا صغيرة فقط 0.4-0.5٪ ^1. وبالتالي عزل كميات كافية من نوعية الحمض النووي الريبي من المصل يشكل تحديا كبيرا للباحثين اليوم. في هذه الورقة التقنية، ونحن لشرح الطريقة التي يستخدم فقط 400 ميكرولتر من مصل الإنسان للحصول على الحمض النووي الريبي كافية لصفائف إما DNA أو تحليل QPCR. وعلىdvantages هذه الطريقة هي بساطتها والقدرة على انتاج الحمض النووي الريبي جودة عالية. لا يتطلب أي أعمدة متخصصة لتنقية الرنا صغيرة وتستخدم الكواشف العامة والأجهزة الموجودة في المختبرات المشتركة. يستخدم أسلوب لدينا قفل جل المرحلة للقضاء على التلوث الفينول بينما في نفس الوقت جودة عالية الغلة الحمض النووي الريبي. ونحن نقدم أيضا خطوة إضافية لمواصلة إزالة جميع الملوثات خلال الخطوة العزلة. هذا البروتوكول هو فعالة جدا في عزل الحمض النووي الريبي غلة إجمالية تصل إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر من المصل ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لالأنسجة البيولوجية الأخرى.

Introduction

في السنوات الأخيرة، كان هناك دفع المتزايد لاكتشاف مؤشرات حيوية جديدة للكشف المبكر عن الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تركز الكثير من الاهتمام على استخدام الرنا الصغيرة مثل microRNAs ² (miRNAs أو ميرس) كعلامات محتملة. تم العثور على هذه الرناوات الصغيرة في سوائل الجسم مثل الدم والدراسات أظهرت أنها مقاومة للتدهور ومستقرة على مجموعة من الظروف البيئية المتباينة ^3. ونظرا لهذه الميزات miRNAs، المصل أو المتداولة هي العلامات البيولوجية مثالية ^{4، 5.} حاليا هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لعزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل البيولوجية. يستخدم النهج الأول التكنولوجيا القائمة على عمود لربط وأزل الرنا صغيرة ^6، بينما يستخدم الأسلوب الثاني البروتوكول طويلة الأمد مع الفينول وثيوسيانات guanidinium الكواشف ^7. وقد وضعنا بسيطة وفعالة وخالية من الأعمدة بروتوكول لعزل الرنا صغيرة من مصل الإنسان. الحمض النووي الريبي معزولة هو immediately صالحة للاستعمال في التطبيقات المصب، بما في ذلك صفائف قليل النوكليوتيد الحمض النووي RNA والتسلسل.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأننا كنا نواجه العديد من القضايا عند استخدام الأساليب القائمة على الفينول لعزل الحمض النووي الريبي من المصل. وكثيرا ما يستخدم النهج Chomczynski التقليدية في معظم المختبرات مع مجموعة من الكواشف المتوفرة من معظم البائعين التجارية. ولكن النظر في استخدامها على نطاق واسع، لم يتم وضع مبادئ توجيهية صارمة لتنتج باستمرار جودة عالية من الحمض النووي الريبي سوائل الجسم، في الدم أو المصل معينة.

المشاكل الشائعة المرتبطة عزل الحمض النووي الريبي من المصل تشمل عوائد منخفضة الحمض النووي الريبي والتلوث مع الكواشف المستخدمة خلال العزلة، ولا سيما الفينول. نهجنا نتخلص من هذه الملوثات الفينول لتوفير الحمض النووي الريبي جودة عالية لتحليل المصب مثل PCR الكمي (QPCR) والحمض النووي الريبي التسلسل. لدينا المزيد من اختبار هذا الحمض النووي الريبي على صفائف ميرنا.

Protocol

ملاحظة: عينات مصل الإنسان من المرضى الأصحاء أو المرضى الذين يعانون من السرطان تم الحصول عليها مع الموافقة المسبقة بموجب البروتوكولات المعتمدة الأخلاقية الإنسان من الأمير ألفريد الملكي مستشفى سيدني (عدد بروتوكول X10-0016 وHREC/10/RPAH/24) وجامعة للتكنولوجيا، سيدني. تم جمع عينات من مصل الدم من المرضى قبل الجراحة من مختلف مستشفيات سيدني وضعت في التخزين في -80 درجة مئوية.

1. عزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من المصل

تم إعداد الحمض النووي الريبي مجموع من المصل البشري باستخدام نسخة معدلة من بروتوكول LS ثلاثي الكاشف RT.

1. ذوبان الجليد عينة مصل المجمدة على الجليد ومن ثم نقل 400 ميكرولتر من المصل إذابة حديثا في أنبوب microcentrifuge المسمى.
2. تمييع الدم مع 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز H ₂ O حرة وإضافة بروتين K بتركيز 1 ملغ / مل.
3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح للهضم البروتين بواسطة بروتين K.
4. Tس ضمان الانحلالية كاملة، إضافة 1.5 مرة من حجمه ثلاثي الكاشف RT LS و 100 ميكرولتر من 4 bromoanisole.
5. لفترة وجيزة عكس جناسة، نفذ pipetting لمدة 5 ثوانى المتكررة ونقل إلى صفت أنبوب 2 مل الثقيلة المرحلة قفل.
6. تدور جناسة في 12،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
7. صب بعناية لا يقل عن 1 مل من محلول مائي مما أدى إلى أنبوب DNA Lobind الطازجة. وينبغي المحاصرين في الطور البيني العضوية وتحت الجل الأبيض من أنبوب المرحلة قفل.
8. إضافة 5.0 ميكرولتر من الجليكوجين (5 ملغ / مل) و 500 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول إلى محلول مائي، مزيج من قبل انقلاب، واحتضان O / N في -20 درجة مئوية.
9. التالية O / N الحضانة، الطرد المركزي العينة لمدة 20 دقيقة في 12،000 × ز في 4 ° C الطرد المركزي.
10. تجاهل طاف واضحة وتنفيذ "فلاش" تدور لمدة 2 دقيقة في 16،000 × ز في 4 ° C الطرد المركزي.
11. إزالة بعناية واضحة سولution المحيطة بيليه باستخدام ماصة.
12. غسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة. صب محلول الغسيل وكرر الخطوة غسل.

2. RNA إعادة تعليق في الحل

1. resuspend وبيليه في 10 ميكرولتر من ريبونوكلياز H ₂ O حرة، وضمان يذوب بيليه تماما. لضمان أن الحمض النووي الريبي هو solubilized تماما يمكن تسخين العينة إلى 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. خلال هذا الوقت، ومزيج العينة مع pipetting لتكرارها. لأعلى مجموع العائد الحمض النووي الريبي، تجمع اثنين الاستعدادات الحمض النووي الريبي من نفس المريض.
2. Quantitate الحمض النووي الريبي معلق باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيز وتقييم نوعية الحمض النووي الريبي باستخدام Bioanalyzer 2100. تخزين عينات الحمض النووي الريبي المجمعة في -80 درجة مئوية لاستخدامها في التطبيقات المصب.

النتائج

يمثل الشكل 1 طيف الأشعة فوق البنفسجية / فيس نموذجية من الحمض النووي الريبي معزولة عن المصل. من هذا الملف لاحظنا التلوث البروتين في 280 نانومتر مع الفينول والملوثات العضوية على حد سواء في 270 نانومتر و 230 نانومتر، على التوالي. ولوحظ بقايا guanidinium ثيوسيانات أيضا في 2...

Discussion

سكان microRNAs يشكل حوالي 0.4-0.5٪ من الحمض النووي الريبي مجموع جدت في مصل الدم. مزيد من هناك أيضا ارتفاع محتوى البروتين وجدت في مصل الدم البشري. لتحسين RNA والبروتين والحد من كل الفينول يلوث قمنا بتعديل النهج Chomczynski التقليدية ⁹ مع إضافة العديد من الخطوات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
RNase free H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491
Heavy Phase Lock tube	5PRIME	2302830	2 ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5 ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg/ml
RNA grade isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated centrifuge	John Morris
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA
RNA grade ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent, USA