小非编码RNA从人血清中分离

摘要

本协议描述为从人血清中提取的小分子RNA的方法。我们已经用这种方法来隔离患者血清小分子RNA在DNA阵列使用，也可单重定量PCR。该协议利用酚和异硫氰酸胍试剂进行了修改，以产生高质量的RNA。

摘要

RNA和其表达的分析是在许多实验室的共同特征。意义的是小RNA像微小RNA，其被发现在哺乳动物细胞中的出现。这些小RNA是有效的调节基因控制的重要途径，如生长，发育和死亡，并极大的兴趣已经冲着他们的体液中的表达。这是由于它们在人类疾病如癌症和其潜在的应用如血清生物标志物的失调。然而，血清中的miRNA表达的分析可能会产生问题。在大多数情况下，血清的量限制和血清中含有低量的总RNA，其中小RNA只占^{0.4-0.5％1。}因此足量的血清RNA的质量分离是当今的一大挑战研究人员。在这种技术论文，我们证明仅使用400μL人血清中获得足够的RNA是DNA阵列或定量PCR分析的方法。在一个这种方法的dvantages是它的简单性和产生高质量RNA的能力。它不需要专门的列的小RNA纯化及利用一般的试剂和硬件共同实验室发现。我们的方法是利用一个相位锁定凝胶消除苯酚污染，而在同一时间得到高质量的RNA。我们还引入一个额外的步骤在分离步骤，以进一步去除所有污染物。这个协议是非常有效的隔离血清高达100纳克/微升的总RNA的产率，但也可以适用于其他生物组织。

引言

近年来，出现了越来越多的推动，发现新的生物标志物的早期检测人类疾病。许多注意力都集中在利用小分子RNA，如微RNA ^2（微RNA或大鹏）作为潜在的标志物。这些小RNA被发现在体液如血清和研究已经表明它们是弹性的退化，并稳定在一个范围内的不同的环境条件^3。鉴于这些特点，血清或循环miRNA是理想的生物标志物^4，5。目前，有用于从生物体液的小RNA分离两种主要方法。第一种方法使用了基于列的技术结合和洗脱的小RNA ^6，而第二种方法使用与苯酚和异硫氰酸胍试剂⁷已久的协议。我们已经开发出一种简单，有效，无柱协议从人血清中分离出的小分子RNA。分离的RNA是immediately可用在下游应用，包括DNA寡核苷酸阵列和RNA测序。

这个协议被开发，因为我们使用酚为基础的方法，从血清中分离RNA时，面临着几个问题。传统Chomczynski方法被经常使用在大多数实验室用范围可从大多数商业供应商的试剂。但是考虑到它们的广泛使用，严格的标准还未发展到持续生产高品质的RNA的体液，特别是血液或血清。

从血清中分离RNA相关的常见问题包括低的RNA产率和污染的隔离，特别是苯酚过程中使用的试剂。我们的方法消除了这些酚类污染物为下游分析，如定量PCR（定量PCR）和RNA测序提供高品质的RNA。我们对miRNA的阵列进一步测试此RNA。

研究方案

注：从健康的病人或癌症患者的人血清样品受到来自皇家阿尔弗雷德王子医院悉尼（协议号X10-0016和HREC/10/RPAH/24）和科技大学批准人的道德协议知情同意获得，悉尼。血清样品从患者在手术前，从各个悉尼医院收集和放置在存储于-80℃。

从血清1。小RNA分离

总RNA，从人血清中使用三试剂RT LS协议的修改版本来制备。

1. 解冻冷冻的血清样品在冰上，再换乘400微升的刚解冻的血清成标记的离心管。
2. 稀释血清100μl的无RNase H _{2 O}的，并在1毫克/毫升的浓度添加蛋白酶K。
3. 在37°C下持续20分钟，使蛋白质的消化蛋白酶K。
4. Ŧo确保完全溶解，加入1.5倍的三试剂RT LS的体积和100微升的4 - 溴苯甲醚。
5. 简要反转匀浆，持续5秒执行重复移液并转移到一个标记2毫升重锁相管。
6. 旋匀浆以12,000×g的20分钟，在4℃下
7. 小心地倒出至少将1ml所得的水溶液中放入新的DNA低吸附管。有机和相间应该被困在锁相管的白色凝胶下方。
8. 加入5.0微升糖原（5毫克/毫升）和500μl的100％异丙醇的水溶液中，通过倒置混合，并孵育O / N在-20℃下
9. 下面的O / N培养，离心样品20分钟，在12000×g下在4℃离心。
10. 弃去上清液，并在4℃下离心分离机进行“闪光”旋转2分钟，在16000×g下。
11. 小心地取下透明溶胶ution使用移液管周围的颗粒。
12. 用1毫升70％乙醇和离心机以10,000×g下洗涤沉淀10分钟。滗出洗涤液并重复洗涤步骤。

2，RNA再悬浮成解决方案

1. 重悬沉淀于10μl无RNA酶的H _{2 O}的，确保沉淀完全溶解。以确保该RNA被完全溶解的样品可以被加热到55℃持续5分钟。在这段时间内，混合样品反复吹打。对于更高的总RNA的产量，凝聚两个RNA制剂来自同一患者。
2. 定量使用紫外可见分光光度计的再悬浮的RNA，并使用2100生物分析仪评估RNA的质量。存储池的RNA样品在-80℃下，在下游应用中使用。

结果

图1表示从血清中分离的RNA的典型的UV / Vis光谱。从这个配置文件，我们注意到蛋白质污染在无论是在270 nm和230 nm的280 nm的苯酚和有机污染物，分别。残留硫氰酸胍还注意到在260 nm处。以减少污染物，一系列的优化步骤是标准的三试剂RT-LS方法制备。我们添加了糖原的5毫克/毫升，以增加两总RNA的产量和减少污染（黑线， 图1A）。

进一步，我们观察到?...

讨论

microRNA的人口构成中的血清中发现的总RNA约0.4-0.5％。此外还有人血清中发现了蛋白质含量高。以提高RNA和减少蛋白质和酚污染我们修改了传统的Chomczynski方法⁹与另外的几个步骤。

总RNA从血清使用标准的三试剂RT-LS（分子研究中心）分离但是在我们的实验室中进行时，这种方法在低量含有各种杂质，得到的RNA。

图1显示了蛋白污染的证...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
RNase free H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491
Heavy Phase Lock tube	5PRIME	2302830	2 ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5 ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg/ml
RNA grade isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated centrifuge	John Morris
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA
RNA grade ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent, USA