Isolamento dei Piccoli RNA non codificanti dal siero umano

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per l'estrazione di piccoli RNA da siero umano. Abbiamo usato questo metodo per isolare microRNA da siero cancro per uso in matrici di DNA e anche singleplex PCR quantitativa. Il protocollo utilizza fenolo e guanidina tiocianato reagenti con modifiche a produrre RNA di alta qualità.

Abstract

L'analisi di RNA e la sua espressione è una caratteristica comune in molti laboratori. Di rilievo è la nascita di piccoli RNA come microRNA, che si trovano nelle cellule di mammifero. Questi piccoli RNA sono geni regolatori potenti che controllano le vie vitali come la crescita, lo sviluppo e la morte e molto interesse è stato rivolto al loro espressione nei fluidi corporei. Ciò è dovuto alla loro disregolazione in malattie umane come il cancro e il loro potenziale applicazione come biomarker sierici. Tuttavia, l'analisi di espressione miRNA nel siero può essere problematico. Nella maggior parte dei casi la quantità di siero è limitante e siero contiene basse quantità di RNA totale, di cui piccoli RNA costituiscono solo 0,4-0,5% ^1. Così l'isolamento di una quantità sufficiente di RNA qualità dal siero è una sfida importante per i ricercatori di oggi. In questo documento tecnico, si dimostra un metodo che utilizza solo 400 ml di siero umano per ottenere RNA sufficiente sia per matrici di DNA o analisi qPCR. L'unadvantages di questo metodo sono la sua semplicità e la capacità di produrre RNA di alta qualità. Non richiede colonne specializzati per la purificazione dei piccoli RNA e utilizza reagenti generali e hardware presenti nei laboratori comuni. Il nostro metodo si usa un blocco Gel Fase per eliminare la contaminazione fenolo mentre allo stesso tempo cedevole RNA di alta qualità. Abbiamo anche introdurre un ulteriore passo per rimuovere ulteriormente tutti gli agenti inquinanti durante la fase di isolamento. Questo protocollo è molto efficace per isolare rese di RNA totale fino a 100 ng / ml di siero ma può anche essere adattato per altri tessuti biologici.

Introduzione

Negli ultimi anni, c'è stata una spinta crescente a scoprire nuovi biomarcatori per la diagnosi precoce delle malattie umane. Molta attenzione è stata focalizzata sull'uso di piccoli RNA come microRNA ² (miRNA o miR) come potenziali marcatori. Questi piccoli RNA sono presenti nei fluidi corporei come siero e studi hanno dimostrato che sono resistenti alla degradazione e sono stabili in un intervallo di variazione delle condizioni ambientali ^3. Poiché questi miRNA caratteristiche, siero o circolanti sono il biomarcatore ideale ^{4, 5.} Attualmente ci sono due approcci principali per l'isolamento di piccoli RNA da fluidi biologici. Il primo approccio utilizza la tecnologia basata su colonne di impegnare ed eluire i piccoli RNA ^6, mentre il secondo approccio utilizza il protocollo di lunga data con fenolo e guanidina tiocianato reagenti ^7. Abbiamo sviluppato un efficace, semplice protocollo, senza colonne per isolare piccoli RNA da siero umano. L'RNA isolato è immediatamentediatamente utilizzabili in applicazioni a valle, compresi gli array di oligonucleotidi di DNA e RNA sequenziamento.

Questo protocollo è stato sviluppato perché eravamo di fronte a diversi problemi quando si utilizzano metodi basati fenolo-per isolare l'RNA dal siero. L'approccio tradizionale Chomczynski è spesso utilizzato nella maggior parte dei laboratori con una gamma di reagenti disponibili dalla maggior parte dei fornitori commerciali. Tuttavia, considerando la loro diffusione, non sono stati sviluppati orientamenti rigorosi per produrre costantemente RNA di alta qualità da fluidi corporei, in particolare sangue o siero.

Problemi comuni associati con isolare RNA da siero comprendono basse rese di RNA e la contaminazione con reagenti utilizzati durante l'isolamento, in particolare fenolo. Il nostro approccio elimina questi contaminanti fenolo per fornire RNA di alta qualità per l'analisi a valle come la PCR quantitativa (qPCR) e RNA sequenziamento. Abbiamo inoltre testato questo RNA array miRNA.

Protocollo

Nota: campioni di siero umano da pazienti sani o pazienti con cancro sono stati ottenuti con il consenso informato ai sensi approvati i protocolli etici umani del Royal Prince Alfred Hospital di Sydney (numero di protocollo X10-0016 e HREC/10/RPAH/24) e l'University of Technology, Sydney. I campioni di siero sono stati raccolti da pazienti prima dell'intervento chirurgico da vari ospedali di Sydney e posti in stoccaggio a -80 ° C.

1. Small RNA Isolation da siero

L'RNA totale è stato preparato da siero umano utilizzando una versione modificata del protocollo LS Tri-Reagent RT.

1. Scongelare campione di siero congelato su ghiaccio e poi il trasferimento di 400 ml di siero appena scongelato in una provetta etichettata.
2. Diluire il siero con 100 ml di RNasi libero H ₂ O e aggiungere proteinasi K alla concentrazione di 1 mg / ml.
3. Incubare a 37 ° C per 20 minuti per consentire la digestione delle proteine ​​da proteinasi K.
4. To garantire la completa solubilizzazione, aggiungere 1,5 volte il suo volume di Tri-reagente RT LS e 100 ml di 4-bromoanisole.
5. Brevemente invertire l'omogeneizzato, eseguire pipettaggio ripetitivo per 5 secondi e trasferire in una provetta etichettata 2 ml Heavy Phase Lock.
6. Centrifugare l'omogeneizzato a 12.000 xg per 20 min a 4 ° C.
7. Decantare attentamente almeno 1 ml di soluzione acquosa risultante in una fiala LoBind DNA. L'interfase organico e dovrebbe essere intrappolato sotto il gel bianco del tubo Phase Lock.
8. Aggiungere 5,0 ml di glicogeno (5 mg / ml) e 500 ml di isopropanolo al 100% alla soluzione acquosa, miscelare capovolgendolo, e incubare O / N a -20 ° C.
9. Seguendo O / N incubazione, centrifugare il campione per 20 minuti a 12.000 xg in una centrifuga 4 ° C.
10. Eliminare il surnatante limpido ed effettuare un giro "flash" per 2 min a 16.000 × g in un 4 ° C centrifuga.
11. Rimuovere con attenzione il chiaro solution circonda il pellet con una pipetta.
12. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 10.000 xg per 10 min. Decantare la soluzione di lavaggio e ripetere la fase di lavaggio.

2. RNA Resuspension in Solution

1. Risospendere il pellet in 10 ml di RNasi libero H ₂ O, garantendo il pellet è completamente sciolto. Per assicurare che l'RNA viene completamente solubilizzata il campione può essere riscaldata a 55 ° C per 5 min. Durante questo tempo, mescolare il campione con pipettaggio ripetuto. Per un rendimento RNA totale più alto, in comune due preparazioni di RNA dallo stesso paziente.
2. Quantificare l'RNA risospeso con un UV-Vis spettrofotometro e valutare la qualità RNA utilizzando un bioanalizzatore 2100. Conservare i campioni di RNA aggregati a -80 ° C per uso nelle applicazioni a valle.

Risultati

Figura 1 rappresenta un tipico spettro UV / Vis di RNA isolato dal siero. Da questo profilo abbiamo notato contaminazione proteina a 280 nm con fenolo e contaminanti organici sia a 270 nm e 230 nm, rispettivamente. Residue guanidina tiocianato stato inoltre osservato a 260 nm. Per ridurre i contaminanti, una serie di passaggi di ottimizzazione hanno fatto la procedura RT-LS Tri-reagente standard. Abbiamo aggiunto 5 mg / ml di glicogeno di aumentare sia il rendimento totale RNA e ridurre la contaminazion...

Discussione

La popolazione dei microRNA costituisce circa il 0,4-0,5% del RNA totale ritrovate nel siero. Inoltre vi è anche un alto contenuto proteico trovato nel siero umano. Per migliorare RNA e ridurre proteine ​​e fenolo contamina abbiamo modificato il tradizionale approccio Chomczynski ⁹ con l'aggiunta di diversi passaggi.

L'RNA totale è stato isolato dal siero utilizzando lo standard Tri-Reagent RT-LS (Centro di Ricerca Molecolare) tuttavia quando eseguite nel nostro labo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
RNase free H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491
Heavy Phase Lock tube	5PRIME	2302830	2 ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5 ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg/ml
RNA grade isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated centrifuge	John Morris
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA
RNA grade ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent, USA