وهناك طريقة لتوليد الرئوي العدلات عن طريق رذاذ lipopolysaccharide في

Summary

نحن تصف طريقة لإحداث الالتهاب الرئوي العدلات التي كتبها تحديا للعديد السكاريد الشحمي رذاذ بالإرذاذ، لنموذج إصابة الرئة الحادة. بالإضافة إلى ذلك، كما وصفت التقنيات الجراحية الأساسية لعزل الرئة، التنبيب الرغامي والقصبات غسيل.

Abstract

إصابة الرئة الحادة (ALI) هو مرض حاد يتميز العدلات السنخية، مع خيارات العلاج محدودة، وارتفاع معدل الوفيات. نماذج تجريبية من ALI أساسية في تعزيز فهمنا لإمراض المرض. lipopolysaccharide في (LPS) المستمدة من البكتيريا إيجابية الجرام يدفع التهاب العدلات في الشعب الهوائية والرئة حمة من الفئران. تسليم الرئوي الفعال للمركبات مثل LPS، مع ذلك، من الصعب تحقيقه. في النهج وصفها هنا، ويتحقق تسليم الرئوي في الفئران عن طريق تحديا لرذاذ الزائفة الزنجارية LPS. كان رذاذ حل LPS من قبل البخاخات متصلة الهواء المضغوط. تعرض الفئران لاستمرار تدفق LPS الهباء الجوي في صندوق زجاجي لمدة 10 دقيقة، تليها 2 تكييف دقيقة بعد أن تم التوقف عن الهباء الجوي. التنبيب الرغامي والقصبات غسيل لاحق، تليها نضح الفورمالين تم إجراء المقبل، والذي يسمح لتوصيف ع معقمالتهاب ulmonary. رذاذ LPS يولد الالتهاب الرئوي تتميز العدلات السنخية، في الكشف عن غسل القصبات والتقييم النسيجي. يمكن تعيين هذه التقنية بتكلفة صغيرة مع قليل من الأجهزة، ويتطلب الحد الأدنى من التدريب والخبرة. ويمكن بالتالي فإن النظام التعرض أن يؤديها بشكل روتيني في أي مختبر، مع القدرة على تعزيز فهمنا لعلم الأمراض الرئة.

Introduction

lipopolysaccharide في (LPS) هو أحد مكونات جدار الخلية من البكتيريا سالبة الجرام ^1. تحديا لLPS هو نموذج موثقة جيدا من إصابة الرئة الحادة، وهو متلازمة تتميز التهاب العدلات الحاد وذمة ^2. وبالإضافة إلى ذلك، العدلات الرئوية هي أيضا السمة المميزة لمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ^3، والتحدي LPS في البشر وقد استخدم لنموذج التفاقم COPD ^4. وهكذا، نماذج تجريبية من التعرض LPS هي سريريا الأدوات ذات الصلة وقيمة لفهم الأمراض البشرية.

والهدف من تسليم الرئوي من LPS رذاذ الموصوفة هنا هو لتوليد استجابة التهابية عدلة في إجراء والهوائية في الجهاز التنفسي، دون الجهازية. وقد وصفت العديد من التقنيات التحدي LPS سابقا. حقن وريدية من LPS هو الطريق الأكثر استخداما للإدارة. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن الوصول إليها بسهولة، رانه الضرر الأساسي هو البطانة، مع تدمير الثانوي من الظهارة الرئوية التالية الهجرة المتعادلة إلى الرئة. إدارة وريدية أيضا يدفع التهاب النظامية ^2، والتي قد تعقيد الصورة السريرية في النماذج الحيوانية. التهاب النظامية في المقابل لم يلاحظ مع الإدارة داخل القصبة الهوائية. هذه التقنية، ومع ذلك، هو عمالة كثيفة ويتطلب التخدير وكذلك تدريب كبير ^{5، 6.} وعلاوة على ذلك، ترسب الرئوي عن طريق هذا الطريق الإدارة يعتمد على التنفس ^7. وهكذا، يتأثر ترسب الرئوي من عمق التخدير اللازمة ليمكن ملاحظة ادارة القصبة الهوائية داخل وترسب متغير في الشعب الهوائية. في المقابل، والتسليم الرئوي مع LPS رذاذ يتطلب الحد الأدنى من التدريب، ويمكن بسهولة أن يتحقق على عدد كبير من الحيوانات مع ضئيلة أو معدومة الاختلاف بين الأفراد ^{5 و 8.}وتؤكد دراسة حديثة أن تسليم الهباء الجوي متفوقة على الطريق داخل القصبة الهوائية فيما يتعلق الترسيب، وأن جرعات أكثر أهمية من LPS تحفز التهاب العدلات مع هذا النموذج ^8.

وقد أثبتت دراسات سابقة أن التحدي إلى رذاذ Psuedomonas الزنجارية LPS يولد استجابة التهابية ملحوظة في التجويف الهوائي وحمة الرئة، بما في ذلك المسافات السنخية ^{9 و 10.} يتميز الالتهاب من قبل غلبة العدلات وجود وذمة رئوية، وبالتالي يمكن استخدامها لمعالجة التسبب في إصابة الرئة الحادة واكتساب المزيد من المعارف من الآليات التي تسهم في علم الأمراض المرض.

Protocol

وتمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة الأخلاق الرفق بالحيوان الشمالية ستوكهولم. تم تنفيذ الإجراءات التجريبية في الامتثال للقانون السويدي.

1. توليد LPS الهباء

1. حل 0.5 غرام تنقية P. الزنجارية LPS في 50 مل ملحي معقم مع الإثارة لطيف والتحقق من الحل. تمييع 1 مل حل LPS في 9 مل ملحي معقم، إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. يحفظ بعيدا عن الضوء بورق الألمنيوم وتخزينها في -20 ° C.
2. ذوبان الجليد LPS تذوب في الظلام في درجة حرارة الغرفة وتخلط جيدا فورا قبل الاستخدام.
3. في التهوية من المستوى الثاني واقية غطاء محرك السيارة، اضافة الى وجود مدخل الحمراء في البخاخات، وربط البخاخات لضغط هواء الغرفة عبر الأنابيب التي تقدمها (مخطط مراجعة تقديم الأجهزة التجريبية في الشكل 1) المصنعة.
   تنبيه: معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك نصف قطعة الوجه respirat قابلة لإعادة الاستخدامأو مع مرشحات الجسيمات، نظارات واقية وقفازات والملابس الواقية وينبغي أن تستخدم أثناء التعرض.

الشكل 1: عرض تخطيطي من الأجهزة التجريبية المستخدمة لتوليد الهباء الجوي يتم توصيل مدخل من البخاخات إلى العرض الجوي. توصيل منفذ من البخاخات أول من تدفق متر عبر 15.9 مم أنبوب وفلتر الهواء، والعرض الجوي يتم ضبط إلى 5.0 L / م 2 في الضغط kbar. منفذ توصيل القادم إلى مربع زجاجي مزودة الأغطية القابلة للإزالة و 5 ملم الثقوب لمنع تراكم الضغط.

4. قم بتوصيل منفذ من البخاخات إلى مقياس الجريان الشامل عبر فلتر الهواء. ربط مقياس الجريان الكتلة إلى التيار الكهربائي.
5. ضبط العرض الجوي إلى 5 لتر / دقيقة، مع الضغط المتبقية في 1.0-2.0 بار.
6. إزالة مقياس الجريان الجماعية وقطع التيار الهواء.
7. قم بتوصيل منفذ من البخاخات إلى 15.9 مم أنبوب، التي bifurcates ويتصل صندوقين زجاجي مع الأبعاد: 150 × 163 X 205 مم، مزودة الأغطية القابلة للإزالة. وينبغي أن يكون كل مربع حفرة 5 ملم في الجانب معارضة مدخل، لمنع تراكم الضغط.
8. وضع ما يصل إلى 5 الفئران في كل مربع زجاجي وإغلاق الأغطية.
9. فتح البخاخات وملء إدراج مع لا يقل عن 4 مل LPS المذاب في محلول ملحي معقم أو مركبة وحدها (ملحي معقم؛ وينبغي ألا يتجاوز حجم 8 مل). إعادة ربط مدخل إلى العرض الجوي.
10. السماح للالهباء الجوي في التدفق إلى صناديق مغلقة زجاجي لمدة 10 دقيقة. مراقبة الحيوانات باستمرار. تأكد من يبقى العرض الجوي المضمون بإحكام إلى مدخل من البخاخات.
11. قطع التيار الهواء. مع الأغطية مغلقة، والسماح تبقى الحيوانات في مربعات زجاجي لمدة 2 دقيقة.
12. فتح الأغطية والسماح للالهباء الجوي لتفريق، وعودة الحيوانات إلى tانه الأقفاص. إذا ظهرت الحيوانات الرطب، ضع أقفاص على وسادة التدفئة المقرر أن درجة حرارة منخفضة، لمنع انخفاض حرارة الجسم.
13. مراقبة الحيوانات بشكل مستمر لمدة 30 دقيقة الأولى، وبعد ذلك كل 2 ساعة لساعة 6 الأولى. يجب على الحيوانات تظهر نمط التنفس الطبيعي والنشاط أثناء وبعد العملية إرذاذ.

2. القصبات الغسل (BAL)

1. عند نقطة نهاية التجريبية، تخدير عميق الحيوانات مع isoflurane إلى تأثير على النحو الموصى به من قبل الموظفين البيطري مؤسستك. قرصة مخلب الخلفية للتحقق من رد فعل الانسحاب لضمان عمق كاف من التخدير لإجراء عملية جراحية كبرى. رش أسفل الفراء للحيوانات مع 70٪ من الإيثانول.
2. فتح البطن باستخدام مقص، وقطع الشريان الأبهر ليستنزف الحيوان. ضع قطعة من النسيج على البطن لامتصاص الدم.
3. و FOLLWING القتل الرحيم، واستخدام قطع الأمامي الخلفي واحد من المقص لفضح القفص الصدري. رفع القفص الصدري من قبل طرف الأمامي من عظمة القص واستخدام المقص لثقب في الحجاب الحاجز معظم نقطة البطنية، بدون تقطيع في أي الفص الرئة. فتح القفص الصدري من خلال جعل اثنين من التخفيضات في الاتجاه الأمامي الخلفي (اجتماع تحت الفك).
4. سحب بلطف بعيدا القفص الصدري باستخدام ملقط، وقطع القصبة الهوائية تحت الحنجرة.
5. رفع القصبة الهوائية مع ملقط وإزالة الرئتين عن طريق قطع الأربطة التي تربط فصوص إلى التجويف الصدري، وسحب بلطف من قبل الدهنية والأنسجة القلبية.
6. إدراج أنبوب البولي ايثيلين (القطر الداخلي: 0.58 مم؛ القطر الخارجي: 0،965 ملم) في القصبة الهوائية وتأمين أنبوب مع سلسلة من الخيوط الحريرية.
7. ربط قبالة multilobe (فصوص أربعة من الرئة اليمنى) مع خيط الحرير.
8. اضافة الى وجود إبرة قياس 23 في أنبوب البولي ايثيلين وحقن ببطء 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة الجليد الباردة في الفص واحد مع حقنة 1 مل.
9. الاستفادة بعناية الرئتين30 مرة وجمع السائل من خلال حقنة. كرر الإجراء مع 200 ميكرولتر PBS (حوالي 300 ميكرولتر PBS يجب أن تعافى من الفص واحد من إجمالي كمية حقن 450 ميكرولتر).
10. الحفاظ على السائل غسل القصبات (BALF) على الجليد، أو تعداد خلايا بال على الفور. عد الخلايا مع heamocytometer، وذلك باستخدام حل الترك وصمة عار على الخلايا ^11. حساب عدد الخلايا الكلي عن طريق ضرب عدد من الخلايا التي تحتوي على عامل التخفيف من الحل تلطيخ وحجم في مجال عدها من heamocytometer.
11. إعداد تعداد خلايا التفاضلية من خلايا cytocentrifuged كما هو موضح في مكان آخر ^(11).

3. الفورمالين التثبيت من أنسجة الرئة لتقييم النسيجي

1. إزالة multilobe والمفاجئة تجميد الثلج الجاف. تخزين في -80 ° C.
2. جبل حقنة 60 مل مع المكبس إزالتها على دعم موقف المعدنية. ملء المحاقن مع 10٪ من الفورمالين لعلى ارتفاع 20 سم فوق مقاعد البدلاء المختبر، وهو ما يمثل 20 سم من الضغط المستمر.
3. ربط الإبرة 23 مقياس المضمون إلى القصبة الهوائية إلى الحقنة 60 مل عن طريق أنبوب من البلاستيك مع صمام للتحكم في تدفق الفورمالين.
4. نفخ في الفص الرئة مع الفورمالين لمدة 5 دقائق. افصل إبرة وإزالته جنبا إلى جنب مع أنبوب البولي إيثيلين من القصبة الهوائية في حين سحب على خيط الحرير ليغلق القصبة الهوائية والإبقاء على الضغط في الرئة.
5. يغرق الفص الرئة في الفورمالين وإصلاح لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
6. غسل الأنسجة الثابتة ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة على الأقل مع الايثانول 70٪، ويذوى وحتى الزيلين من خلال نظام التالية (1 ساعة لكل منهما):
   • 3X الايثانول 70٪
   • 3X 95٪ من الإيثانول
   • 3X الإيثانول بنسبة 100٪
   • 3X زيلين
   • 1X (السائل) البارافين
7. تضمين الأنسجة المجففة في البارافين، وقطع في 4-5 ميكرون أقسام، وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين للسماح لتقييم النسيجي.

النتائج

تحديا لرذاذ P. الزنجارية LPS عادة ما تعطي الاستجابة الالتهابية ملحوظ في التجويف الهوائي والفضاء السنخية، وتتميز غلبة العدلات في كل نقطة زمنية المبكرة والمتأخرة.

رذاذ LPS يحرض العدلات الرئوية

Discussion

رذاذ LPS يولد استجابة التهابية في الشعب الهوائية، والتي تتميز العدلات في مخاطية الظهارية، ومساحات المحيطة الشعب الهوائية إجراء، وكذلك المساحات السنخية. وهذا هو، جنبا إلى جنب مع زيادة محتوى البروتين الكلي في BALF، يدل على تسرب البلازما، ممثل علم الأمراض من إصابة الرئة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Scissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½ gage needle			Alternative suppliers exist.
1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301205	Alternative suppliers exist.
60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.