Un metodo per generare polmonare Neutrofilia Uso inalato Lipopolisaccaride

Riepilogo

Descriviamo un metodo per indurre l'infiammazione polmonare neutrofila dalla sfida di lipopolysaccharide aerosol per nebulizzazione, per modellare danno polmonare acuto. Inoltre, sono anche descritti tecniche chirurgiche di base per l'isolamento del polmone, l'intubazione tracheale e lavaggio broncoalveolare.

Abstract

Danno polmonare acuto (ALI) è una grave malattia caratterizzata da neutrofilia alveolare, con opzioni di trattamento limitate e alta mortalità. Modelli sperimentali di ALI sono fondamentali nel migliorare la nostra comprensione della patogenesi della malattia. Lipopolisaccaride (LPS) derivato da batteri Gram-positivi induce infiammazione neutrofila delle vie aeree e del parenchima polmonare dei topi. Consegna polmonare efficiente di composti quali LPS è tuttavia difficile da raggiungere. Nell'approccio qui descritto, consegna polmonare nei topi si ottiene sfida di aerosol di Pseudomonas aeruginosa LPS. Disciolto LPS era aerosol da un nebulizzatore collegato ad aria compressa. I topi sono stati esposti a un flusso continuo di LPS aerosol in una scatola plexiglas per 10 minuti, seguito da 2 minuti condizionata, dopo l'aerosol è stato interrotto. L'intubazione tracheale e successivo lavaggio broncoalveolare, seguita da perfusione formalina è stata eseguita successiva, che consente caratterizzazione del p steriliinfiammazione ulmonary. Inalato LPS genera una infiammazione polmonare caratterizzata da neutrofilia alveolare, rilevata in lavaggio broncoalveolare e da una valutazione istologica. Questa tecnica può essere impostato ad un piccolo costo con pochi elettrodomestici, e richiede un minimo di formazione e competenza. Il sistema di esposizione può quindi essere eseguita di routine in qualsiasi laboratorio, con la possibilità di migliorare la nostra comprensione della patologia polmonare.

Introduzione

Lipopolisaccaride (LPS) è un componente della parete cellulare di batteri gram negativi ^1. Sfida a LPS è un modello ben documentato di danno polmonare acuto, una sindrome caratterizzata da infiammazione neutrofila acuta e l'edema ^2. Inoltre, neutrofilia polmonare è anche un segno distintivo della broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) ^3, e LPS sfida negli esseri umani è stato utilizzato per modellare riacutizzazioni della BPCO ^4. Così, modelli sperimentali di esposizione LPS sono clinicamente rilevanti e preziosi strumenti per comprendere la patologia umana.

L'obiettivo della consegna polmonare di LPS aerosol qui descritte è quello di generare una risposta infiammatoria neutrofili nella conduzione e vie respiratorie, senza coinvolgimento sistemico. Diverse tecniche di LPS sfida sono stati descritti in precedenza. Iniezione intra-venosa di LPS è il percorso più comunemente usato di somministrazione. Sebbene questa tecnica è facilmente accessibile, tche danno primario è all'endotelio, distruzione secondaria dell'epitelio polmonare conseguente migrazione dei neutrofili al polmone. Somministrazione intra-venosa induce anche l'infiammazione sistemica ^2, che può complicare il quadro clinico in modelli animali. Infiammazione sistemica è in contrasto non osservati con la somministrazione intra-tracheale. Questa tecnica, tuttavia, è laborioso e richiede anestetici e notevole formazione ^{5, 6.} Inoltre, la deposizione polmonare da questa via di somministrazione dipende respirazione ^7. Così, la deposizione polmonare è influenzato dalla profondità dell'anestesia necessari per la somministrazione intra tracheale e la deposizione nelle vie aeree variabili possono essere osservate. Al contrario, la consegna polmonare con LPS aerosol richiede un addestramento minimo, e può essere facilmente realizzata su un gran numero di animali con poca o nessuna variazione tra individui ^{5, 8.}Un recente studio conferma che la consegna aerosol è superiore al percorso intra-tracheale in materia di deposito, e che dosi più rilevanti di LPS induce infiammazione neutrofila con questo modello ^8.

Studi precedenti hanno dimostrato che sfida per aereosol Psuedomonas aeruginosa LPS genera una risposta infiammatoria marcato nel lume delle vie aeree e del parenchima polmonare, inclusi gli spazi alveolari ^{9, 10.} L'infiammazione è caratterizzata da una predominanza di neutrofili e presenza di edema polmonare, e può quindi essere utilizzato per affrontare patogenesi del danno polmonare acuto e acquisire ulteriori conoscenze dei meccanismi che contribuiscono alla patologia malattia.

Protocollo

Gli studi su animali sono state approvate dal comitato etico del benessere degli animali del nord di Stoccolma. Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con il diritto svedese.

1. Creazione di un LPS Aerosol

1. Sciogliere 0,5 g purificato P. aeruginosa LPS in 50 ml di soluzione fisiologica sterile e scuotendo con cautela e verificare la dissoluzione. Diluire 1 ml LPS disciolti in 9 ml salina sterile ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Proteggere dalla luce con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C.
2. Scongelare LPS solubilizzate al buio a temperatura ambiente e mescolare bene immediatamente prima dell'uso.
3. In una cappa rischio biologico ventilata livello II, inserire un ingresso rosso in un nebulizzatore, e collegare il nebulizzatore ad aria ambiente pressurizzata attraverso il tubo fornito dal (regime revisione presentando i dispositivi sperimentali in figura 1) produttore.
   ATTENZIONE: attrezzature protettive adeguate, tra cui un mezzo facciale respirat riutilizzabileo con filtri antiparticolato, occhiali, guanti e indumenti protettivi dovrebbero essere utilizzati nel corso dell'esposizione.

Figura 1:. Rappresentazione schematica dei dispositivi sperimentali utilizzati per generare un aerosol L'ingresso del nebulizzatore è collegato ad un'alimentazione di aria. L'uscita del nebulizzatore viene collegato a un flussometro attraverso un tubo di 15,9 millimetri e un filtro dell'aria, e la fornitura di aria viene regolato a 5,0 L / m 2 a pressione kbar. L'uscita è vicino collegato a una scatola in plexiglas dotato di coperchi rimovibili e fori da 5 mm per evitare l'accumulo di pressione.

4. Collegare l'uscita del nebulizzatore ad un flussimetro di massa tramite un filtro dell'aria. Collegare il flussimetro di massa ad un'alimentazione elettrica.
5. Regolare l'alimentazione di aria a 5 l / min, con una pressione rimanendo a 1,0-2,0 bar.
6. Rimuovere il misuratore di portata e di massascollegare l'alimentazione dell'aria.
7. Collegare l'uscita del nebulizzatore ad un tubo 15,9 millimetri, che si biforca e si collega a due scatole plexiglas con le dimensioni: 150 x 163 x 205 mm, provvista di coperchi amovibili. Ogni scatola dovrebbe avere un foro 5 mm sul lato opposti l'ingresso, per evitare l'accumulo di pressione.
8. Luogo fino a 5 topi in ogni scatola di plexiglas e chiudere le palpebre.
9. Aprire il nebulizzatore e riempire l'inserto con almeno 4 ml LPS disciolti in soluzione fisiologica sterile o solo veicolo (soluzione fisiologica sterile, il volume non dovrebbe superare 8 ml). Ri-collegare l'ingresso per l'aria di alimentazione.
10. Consentire l'aerosol di fluire nelle caselle plexiglas chiuso per 10 min. Monitorare gli animali continua. Assicurarsi che l'alimentazione dell'aria rimane saldamente assicurato all'ingresso del nebulizzatore.
11. Staccare l'alimentazione dell'aria. Con i coperchi chiuso, lasciare che gli animali rimangono nelle caselle plexiglas per 2 min.
12. Aprire i coperchi e consentire l'aerosol a disperdere, e restituire agli animali di tlui gabbie. Se gli animali appaiono bagnati, posizionare le gabbie su una piastra elettrica impostato su fuoco basso, per evitare l'ipotermia.
13. Monitorare gli animali in continuo per i primi 30 minuti, e successivamente ogni 2 ore per le prime 6 ore. Gli animali devono presentare alterazioni della respirazione normale e l'attività durante e dopo la procedura di nebulizzazione.

2. lavaggio broncoalveolare (BAL)

1. Al punto finale sperimentale, profondamente anestetizzare gli animali con isoflurano ad effetto come raccomandato dal personale veterinario del proprio istituto. Pizzica la zampa posteriore per controllare un riflesso di ritiro per garantire una sufficiente profondità dell'anestesia per condurre interventi di chirurgia maggiore. Spray giù la pelliccia degli animali con il 70% di etanolo.
2. Aprire l'addome con le forbici, e tagliare l'aorta per Exsanguinate l'animale. Posizionare un pezzo di tessuto sopra l'addome per assorbire il sangue.
3. Follwing eutanasia, utilizzare un unico taglio antero-posteriore delle forbici peresporre il torace. Sollevare la gabbia toracica dalla punta anteriore dello sterno e usare le forbici per forare il diaframma nel punto più ventrale, senza intaccare alcun lobo polmonare. Aprire la gabbia toracica, facendo due tagli in direzione antero-posteriore (riunioni sotto la mascella).
4. Tirare delicatamente a parte la gabbia toracica con pinze, e tagliare la trachea sotto la laringe.
5. Sollevare la trachea con le pinze e rimuovere i polmoni tagliando i legamenti che collegano i lobi alla cavità toracica, e tirando delicatamente dal adiposo e tessuto cardiaco.
6. Inserire un tubo di polietilene (diametro interno: 0,58 millimetri; diametro esterno: 0,965 millimetri) nella trachea e fissare il tubo con una stringa di filo di seta.
7. Legare il multilobe (i quattro lobi del polmone destro) con filo di seta.
8. Inserire un ago calibro 23 nel tubo di polietilene e iniettare lentamente 250 ml di ghiaccio freddo PBS sterile nel singolo lobo con una siringa da 1 ml.
9. Toccare con attenzione i polmoni30 volte e raccogliere il liquido attraverso la siringa. Ripetere la procedura con 200 microlitri di PBS (circa 300 ml PBS deve essere recuperato dal singolo lobo dal volume totale iniettato 450 ml).
10. Tenere il liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) su ghiaccio, o elencare immediatamente le cellule BAL. Contare le cellule con un heamocytometer, usando la soluzione Turk per colorare le cellule ^11. Calcolare il numero totale di cellule moltiplicando il numero di cellule con il fattore di diluizione della soluzione colorante e il volume nel campo conteggiato del heamocytometer.
11. Preparare la conta cellulare differenziata dalle cellule cytocentrifuged come descritto altrove ^11.

3. formalina Fissazione di tessuto polmonare per la valutazione istologica

1. Rimuovere il multilobe e snap-freeze in ghiaccio secco. Conservare a -80 ° C.
2. Montare una siringa da 60 ml con lo stantuffo rimosso su un cavalletto di sostegno metallico. Riempire la siringa con il 10% di formalina perl'altezza di 20 cm sopra il banco di laboratorio, in rappresentanza di 20 cm di pressione costante.
3. Collegare l'ago calibro 23 fissata alla trachea alla siringa 60 ml con un tubo di plastica con una valvola per controllare il flusso di formalina.
4. Insufflare il lobo polmonare con formalina per 5 min. Scollegare l'ago e rimuoverlo insieme al tubo di polietilene dalla trachea tirando sul filo di seta per chiudere la trachea e mantenere la pressione nel polmone.
5. Immergere il lobo polmonare in formalina e fissare per 24 ore a 4 ° C.
6. Lavare il tessuto fissato tre volte per almeno 20 min con 70% di etanolo, e disidratare a xilene attraverso il seguente schema (1 ora ciascuno):
   • 3x 70% di etanolo
   • 3x 95% di etanolo
   • 3x 100% di etanolo
   • 3x xilene
   • 1x (liquido) paraffina
7. Tessuto Incorpora disidratati in paraffina, tagliato a 4-5 micron sezioni, e macchia con ematossilina e eosina per consentire la valutazione istologica.

Risultati

Sfida di aerosol P. aeruginosa LPS solito produce una risposta infiammatoria marcata nel lume delle vie aeree e lo spazio alveolare, caratterizzato da una predominanza di neutrofili in entrambi i punti temporali precoce e tardiva.

Inalato LPS induce neutrofilia polmonare

C57BL / 6BY e BALB / c topi sono stati esposti ad aerosol P. aeruginosa LPS o solo veicolo e neutrofili sono stati enumerati in BALF. Il numero totale di cellule in BALF di C57BL /...

Discussione

Inalato LPS genera una risposta infiammatoria nelle vie aeree, caratterizzata dai neutrofili nella sottomucosa epiteliale, spazi circostanti vie aeree di conduzione, nonché gli spazi alveolari. Questo è, unitamente alla maggiore contenuto proteico totale BALF, indicative di perdite plasma, rappresentativo della patologia del danno polmonare acuto. Come LPS induce una infiammazione sterili, la reazione è indipendente della risposta immunitaria adattativa, e ci sono limitazioni alla rilevanza alle infezioni batteriche....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Scissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½ gage needle			Alternative suppliers exist.
1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301205	Alternative suppliers exist.
60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.