Aerosolize Lipopolisakarid kullanma Yaratma Pulmoner nötrofilisi için bir yöntem

Özet

Biz akut akciğer hasarı modeli, nebülizasyonu tarafından aerosolleşmiş lipopolisakkaride meydan tarafından nötrofilik akciğer inflamasyonu uyarılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Buna ek olarak, akciğer izolasyonu, entübasyon ve bronkoalveoler lavaj temel cerrahi teknikler de tarif edilmiştir.

Özet

Akut akciğer hasarı (ALI) tedavi seçenekleri kısıtlı ve yüksek mortalite ile alveol nötrofilisi ile karakterize ciddi bir hastalıktır. ALI Deneysel modeller hastalığın patogenezinde anlayışımızı arttırmak anahtardır. Gram pozitif bakterilere türetilen Lipopolisakarid (LPS) nötrofilik hava yollarında inflamasyon ve farelerin akciğer parankimi neden olur. LPS gibi bileşiklerin etkin pulmoner şevki, Bununla birlikte, elde etmek zordur. Burada tarif edilen bir yaklaşımda, fareler pulmoner uygulama, aerosol, Pseudomonas aeruginosa, LPS meydan okumasının elde edilir. Çözünmüş LPS basınçlı hava bağlı bir püskürtücü ile aerosol edildi. Fareler, aerosol kesildikten sonra 2 dakika havalandırma ve ardından, 10 dakika boyunca bir pleksiglas kutuya LPS aerosol sürekli bir akışına maruz bırakılmıştır. Formalin perfüzyon ardından entübasyon ve sonraki bronkoalveoler lavaj, sonraki steril p karakterizasyonu için olanak sağlayan, yapıldıulmonary inflamasyon. Aerosolize LPS bronkoal- lavaj ve histolojik değerlendirilmesi ile tespit alveol nötrofilisi ile karakterize bir akciğer iltihabı, üretir. Bu teknik birkaç aletleri ile küçük bir maliyetle kurmak ve minimal eğitim ve uzmanlık gerektirir. pozlama sistemi böylece rutin akciğer patolojisi anlayışımızı geliştirmek için potansiyele sahip, herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.

Giriş

Lipopolisakarid (LPS), gram negatif bakterilerin ^{1 'in} bir hücre duvarı bileşeni. LPS meydan akut akciğer hasarı, akut nötrofilik inflamasyon ve ödem ² ile karakterize bir sendrom iyi belgelenmiş bir modeldir. Buna ek olarak, pulmoner nötrofilinin da KOAH alevlenme ⁴ modellemek için kullanılır olmuştur kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ^3, ve insanlarda LPS bir özelliğidir. Böylece, LPS maruz deneysel modeller klinik insan patoloji anlamak için ilgili ve değerli araçlardır.

Burada tarif edilen aerosol haline LPS'nin pulmoner yoldan amacı, sistemik katılımı olmadan iletken ve solunum yollarının bir nötrofilik inflamatuar yanıtı elde etmektir. LPS meydan okumasının çeşitli teknikleri, daha önce tarif edilmiştir. LPS'nin damardan zerk edilerek verilme yolu, en yaygın olarak kullanılan bir yoldur. Bu teknik, kolayca erişilebilir, ancak, tO birincil hasar akciğere nötrofil göç aşağıdaki pulmoner epitel ikincil yıkımı ile, endotel olduğunu. İçi venöz yönetimi de hayvan modellerinde klinik tabloyu komplike edebilir sistemik inflamasyon ^2, uyarmaktadır. Sistemik inflamasyon içi trakeal için elde edilmemiştir tersidir. Bu teknik, bununla birlikte, emek yoğun ve anestezi hem de önemli bir eğitim ^{5, 6} gerektirir. Bundan başka, bu uygulama yoluyla pulmoner birikimi nefes ⁷ bağlıdır. Bu nedenle, pulmoner birikimi solunum yollarında içi trakeal yönetim ve değişken yerleştirme gözlenebilir için gerekli anestezinin derinliği ile etkilenir. Bunun aksine, aerosol haline getirilmiş LPS ile pulmoner uygulama minimum eğitim gerektirir ve kolayca küçük hayvanların çok sayıda ya da bireyler ^{5, 8} arasında bir varyasyon gerçekleştirilebilir.Yeni bir çalışmada, solunum hacmi birikimi ile ilgili içi trakeal yönlendirmek için üstün olduğunu, ve LPS'nin daha fazla dozları bu modele ⁸ nötrofilik enflamasyonu doğrulamaktadır.

Aerosol Pseudomonas aeruginosa LPS alveoller ^{9, 10} de dahil olmak üzere solunum yolu lümeni ve akciğer parankimi, belirgin bir inflamatuar yanıt oluşturur Önceki çalışmalar meydan göstermiştir. inflamasyon nötrofil ve pulmoner ödem varlığı, bir üstünlük kurmasıyla karakterize edilir ve bu nedenle, akut akciğer hasarı patogenezini ele almak ve hastalık patolojisine katkıda mekanizmaların daha ayrıntılı bilgi edinmek için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan çalışmaları Kuzey Stockholm hayvan refahı etik kurulu tarafından onaylandı. Deneysel işlemler İsveç hukuka uygun olarak yapılmıştır.

1. Bir LPS aerosol üretimi

1. S. saflaştırılarak 0.5 g çözülür Hafifçe çalkalama ile 50 ml steril tuzlu su içinde aeruginosa LPS ve çözünme edin. 1 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar, 9 ml steril tuzlu su içinde LPS çözülmüş 1 ml seyreltin. -20 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza ile ışıktan koruyun.
2. Oda sıcaklığında, karanlıkta, çözünür LPS çözülme ve kullanım öncesinde de hemen karıştırın.
3. Bir havalandırılmış seviye II biohazard kaput, bir püskürtücü içine kırmızı bir giriş eklemek, ve üretici (Şekil 1 deneysel cihazlar sunan yorum şeması) tarafından sağlanan boru aracılığıyla basınçlı oda havasına nebulizeri bağlayın.
   DİKKAT: Uygun kişisel koruyucu ekipman, yarım yüz parça yeniden Respirat dahilveya partikül filtreleri, gözlük, eldiven ve koruyucu giysiler ile maruz kalma sırasında kullanılmalıdır.

Şekil 1:. Bir aerosolün üretilmesi için kullanılan deneysel cihazların şematik sunumu püskürtücü giriş hava kaynağına bağlanır. nebulizer çıkış önce 15,9 mm boru ve bir hava filtresi ve hava beslemesi ile bir akış ölçere bağlı olan 2 kbar basınçta 5.0 L / m ayarlanır. çıkış çıkarılabilir kapakları ve basınç birikmesini önlemek için 5 mm'lik delikleri ile donatılmış bir pleksiglas kutu bağlı yanındadır.

4. Bir hava filtresi aracılığıyla bir kitle debi ölçer için nebulizatör çıkışını bağlayın. Bir elektrik kaynağına kitle debi ölçer bağlayın.
5. 1.0-2.0 barda kalan basınç, 5 L / dk hava kaynağını ayarlayın.
6. Kitle debimetre çıkarın veHava kaynağını ayırın.
7. 150 x 163 x 205 mm, çıkarılabilir kapak ile donatılmış: ikiye bölen ve boyutları ile iki pleksiglas kutular bağlanan bir 15,9 mm tüp için nebulizatör çıkışını bağlayın. Her kutu basınç birikmesini önlemek için giriş karşı tarafında bulunan 5 mm'lik bir delik, olmalıdır.
8. Her pleksiglas kutuya 5 fareler kadar yerleştirin ve kapaklarını kapatın.
9. Nebülizatör açın ve sadece steril tuzlu su ya da aracı madde içinde eritilebilir, en az 4 mi LPS ile ekleme doldurun (steril tuzlu su, cilt 8 ml geçmemelidir). Hava kaynağına giriş yeniden bağlayın.
10. Aerosol 10 dakika kapalı pleksiglas kutulara akmasına izin verin. Sürekli hayvanları izleyin. Emin hava besleme nebulizatör girişine sıkıca güvenli kalır emin olun.
11. Hava kaynağını ayırın. Kapakları kapalı, hayvanlar 2 dakika pleksiglas kutulara kalsın.
12. Kapaklarını açın ve aerosol dağıtmak için izin ve t hayvanların dönmekO kafesleri. Hayvanlar ıslak görünüyorsa, hipotermi önlemek için, düşük ısı ayarlı bir ısıtma yastığı kafesleri yerleştirin.
13. İlk 30 dakika boyunca sürekli hayvanları izlemek, ve ilk 6 saat sonra her 2 saatte. Hayvanlar sırasında ve nebulization prosedürü sonra normal solunum paterni ve aktivite göstermelidir.

2. Bronkoalveoler Lavaj (BAL)

1. Kurumunuzun veteriner personeli tarafından tavsiye edilen deneysel uç noktasında, derin etkisi izofluran ile hayvanları uyutmak. Majör cerrahi yapmak için anestezi yeterli derinlik sağlamak için bir geri çekilme refleksi kontrol etmek için arka pençe sıkıştırın. % 70 etanol ile hayvanların kürk aşağı püskürtün.
2. Makas kullanırken karın açın ve hayvan asıl bulbus olfaktoryusları için aort sever. Kan emmek için karın üzerine doku parçası yerleştirin.
3. Ötenazi follwing, makas tek ön-arka kesim kullanıntoraks maruz. Sternum ön ucu ile göğüs kafesi yukarı kaldırın ve herhangi bir akciğer lobunun içine kesmeden, en ventral noktada diyaframı delmek için makas kullanın. Ön-arka yönde iki kesim (çene altındaki toplantı) yaparak göğüs kafesi açın.
4. Yavaşça forseps kullanarak göğüs kafesi dışında çekin ve gırtlak altında trakea kesti.
5. Forseps ile trakea yukarı kaldırın ve göğüs boşluğuna lobu bağlayan ligament kesme ve hafifçe adipoz ve kardiyak doku tarafından çekerek akciğerleri kaldırmak.
6. Bir polietilen tüp (: 0.58 mm; dış çap: iç çapı 0.965 mm) takın trakea içine ve ipek iplik bir dize ile tüp sabitleyin.
7. Ipek iplik ile multilobe (sağ akciğerin dört lobu) kapalı kravat.
8. Polietilen boru içine bir 23 gog iğne yerleştirin ve yavaşça 1 ml şırınga ile bir lob içine buz soğukluğunda steril PBS 250 ul enjekte edilir.
9. Dikkatle akciğerleri dokunun30 kat ve şırınga yoluyla sıvının toplanması. 200 ul PBS ile işlemi tekrarlayın (yaklaşık 300 ul PBS 450 ul toplam enjekte birimden tek lob kurtarıldı olmalıdır).
10. Buz üzerinde BAL sıvısında (BAL) tutun, ya da hemen BAL hücreleri numaralandırmak. Hücreleri ¹¹ leke Türk çözümünü kullanarak, bir heamocytometer hücreleri sayın. Boyama çözeltisi seyreltme faktörü ve heamocytometer ve sayılan alanında hacmi ile hücrelerin sayısı çarpılarak toplam hücre sayısını hesaplayın.
11. Başka bir yerde ¹¹ açıklandığı gibi sitosantrifüjden geçirilidi hücrelerden farklı hücre sayımları hazırlayın.

Histolojik Değerlendirme Akciğer Doku 3. Formol Fixation

1. Multilobe çıkarın ve ek-freeze kuru buz üzerinde. -80 ° C'de saklayın.
2. Bir metal destek standı kaldırıldı piston ile 60 ml şırınga monte edin. % 10 formalin şırınga doldurunSabit basınç 20 cm temsil laboratuvar tezgah üstünde 20 cm, yüksekliği.
3. Formalin akışını kontrol etmek için bir valf ile bir plastik tüp ile 60 ml şırınga trakea sabitlenmiş 23 gauge iğne bağlayın.
4. 5 dakika boyunca formalin ile akciğer lobunun insuflasyon. İğneyi çıkarın ve ipek iplik çekerek trakea kapatmak ve akciğer basıncı korumak için ise trakea polietilen tüp ile birlikte çıkarın.
5. Formalin akciğer lobu Batmak ve 4 ° C'de 24 saat saptamak.
6. % 70 etanol ile en az 20 dakika boyunca sabit bir dokuya üç kez yıkayın ve aşağıdaki rejimi (1 saat her biri) ile ksilen dihidrat:
   • 3x% 70 etanol
   • 3x% 95 etanol
   • 3x% 100 etanol
   • 3x ksilen
   • 1x (sıvı) parafin
7. Hematoksilin ve eosin ile Embed susuz 4-5 mikron bölümleri kesilmiş parafin doku, ve leke histolojik değerlendirme için izin verir.

Sonuçlar

Aerosollaştınlmış P. Mücadelesi aeruginosa LPS genellikle erken ve geç zaman noktalarında hem de nötrofillerin bir üstünlüğü ile karakterize solunum yolu lümeni ve alveollerde, belirgin bir inflamatuar yanıt verir.

Aerosol haline LPS pulmoner nötrofiliyi indükler

C57BL / 6BY ve BALB / c fareleri, aerosol P. maruz bırakıldı aeruginosa LPS veya tek başına araç ve nötrofiller BAL'da sayıldı. C57BL taşı...

Tartışmalar

Aerosol haline LPS epitel alt mukozada nötrofiller tarafından karakterize edilen solunum yolları enflamatuar bir tepki üretir, iletken hava yolları, hem de alveoler boşluk çevreleyen alanlarda. Bu arada plazma sızıntı, akut akciğer hasarı patoloji temsilcisi göstergesidir BAL'da artan toplam protein içeriği ile vardır. LPS steril iltihabı teşvik olarak, reaksiyon adaptif bağışıklık tepkisinin bağımsızdır ve bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilgisi sınırlamalar vardır. teknik, bununla bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Scissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½ gage needle			Alternative suppliers exist.
1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301205	Alternative suppliers exist.
60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.