Verfahren zur Erzeugung von Lungen Neutrophilie Mit aerosolisiertes Lipopolysaccharide

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben.

Zusammenfassung

Akutem Lungenversagen (ALI) ist eine schwere Erkrankung, die alveoläre Neutrophilie, mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten und eine hohe Sterblichkeit. Experimentelle Modelle der ALI sind der Schlüssel bei der Verbesserung unseres Verständnisses der Pathogenese der Erkrankung. Lipopolysaccharid (LPS) aus grampositiven Bakterien stammt induziert neutrophile Entzündung in den Atemwegen und Lungenparenchym von Mäusen. Efficient pulmonalen Verabreichung von Verbindungen, wie LPS ist jedoch schwierig zu erreichen. In der hier beschriebenen Vorgehensweise wird pulmonalen Verabreichung bei Mäusen durch Herausforderung aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS erreicht. Gelöst LPS wurde durch einen Zerstäuber mit Druckluft angeschlossen vernebelt. Die Mäuse wurden in einen kontinuierlichen Strom von LPS Aerosol in einer Plexiglas-Box 10 Minuten lang ausgesetzt, gefolgt von 2 min Konditionierung nach dem Aerosol wurde abgebrochen. Intubation und anschließende Bronchiallavage, gefolgt von Formalin Perfusion wurde als nächstes durchgeführt, die für die Charakterisierung des sterilen p ermöglichtulmonary Entzündung. Aerosolized LPS erzeugt eine Lungenentzündung gekennzeichnet durch alveoläre Neutrophilie, in Bronchiallavage und durch histologische Begutachtung festgestellt. Diese Technik kann gegen eine geringe Gebühr mit wenigen Geräten eingestellt werden, und erfordert nur minimale Schulung und Know-how. Das Belichtungssystem durch eine Routinejeder Labor durchgeführt werden, mit dem Potential, das Verständnis der Lungenpathologie verbessern.

Einleitung

Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Zellwandkomponente von Gram-negativen Bakterien ^1. Herausforderung LPS ist ein gut dokumentiertes Modell des akuten Lungenversagens, ein Syndrom, das durch eine akute neutrophile Entzündung und Ödem ^2. Zusätzlich ist Lungen Neutrophilie auch ein Markenzeichen von chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) ³ und LPS bei Menschen verwendet wurde, um COPDExazerbationen ⁴ modellieren. So sind experimentellen Modellen der LPS Exposition klinisch relevante und wertvolle Werkzeuge für die menschliche Pathologie zu verstehen.

Das Ziel der pulmonalen Verabreichung von hier beschriebenen aerosolized LPS ist es, eine neutrophile Entzündungsreaktion in den leitenden und den Atemwegen, ohne systemische Beteiligung erzeugen. Verschiedene Techniken von LPS wurden bereits beschrieben. Intravenöse Injektion von LPS ist die am häufigsten verwendete Art der Verabreichung. Obwohl diese Technik ist leicht zugänglich, ter Primärschaden ist an das Endothel, mit sekundären Zerstörung der Lungenepithel folgenden neutrophilen Migration in die Lunge. Intravenöse Verabreichung induziert auch systemische Entzündung ^2, die das klinische Bild in Tiermodellen erschweren kann. Systemische Entzündung ist hingegen nicht durch intratracheale Verabreichung beobachtet. Diese Technik ist jedoch arbeitsintensiv und erfordert Anästhetika sowie erhebliche Trainings ^{5, 6.} Darüber hinaus ist Lung dieses Verabreichungsweg abhängig von Atem ^7. Somit wird Lungenablagerung durch die Narkosetiefe für die intra tracheale Verabreichung und variable Abscheidung in den Atemwegen beobachtet werden benötigt betroffen. Im Gegensatz dazu pulmonalen Verabreichung mit aerosoli LPS erfordert minimales Training, und kann leicht zu einer großen Anzahl von Tieren, die mit wenig oder gar keine Variation zwischen Individuen ^{5, 8} durchgeführt werden.Eine aktuelle Studie bestätigt, dass die Aerosolabgabe ist besser als die intratracheal im Hinblick auf die Abscheidung und relevanter Dosen von LPS induziert neutrophilen Entzündung mit diesem Modell ^8.

Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Herausforderung vernebelt Pseudomonas aeruginosa LPS erzeugt eine deutliche Entzündungsreaktion in den Atemwegen Lumen und Lungenparenchym, einschließlich der Alveolarräumen ^{9, 10.} Die Entzündung wird durch ein Vorherrschen der Neutrophilen und die Anwesenheit von Lungenödem gekennzeichnet und können daher verwendet werden, um die Pathogenese von akuter Lungenverletzung Adresse weiter und gewinnt die Kenntnis der Mechanismen Beitrag zur Krankheitspathologie.

Protokoll

Die tierexperimentellen Studien wurden von der Nord Stockholm Tierschutz Ethikkommission genehmigt. Die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit schwedischen Rechts durchgeführt.

1. Erstellen eines LPS Aerosol

1. Man löst 0,5 g gereinigtes P. aeruginosa LPS in 50 ml steriler Kochsalzlösung unter leichtem Schütteln und überprüfen Sie die Auflösung. Gebrauchslösung: 1 ml LPS gelöst in 9 ml steriler Salzlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Vor Licht mit Aluminiumfolie und bei -20 ° C.
2. Auftauen solubilisierten LPS im Dunkeln bei Raumtemperatur und gut mischen unmittelbar vor der Verwendung.
3. An einem gut belüfteten Ebene II Biohazard Haube, legen Sie eine rote Einlass in einem Zerstäuber, und verbinden Sie den Vernebler unter Druck Raumluft über den Schlauch durch den Hersteller (Überprüfung Schema präsentiert die experimentellen Geräten in Abbildung 1) zur Verfügung gestellt.
   ACHTUNG: Geeignete Schutzausrüstung einschließlich eines Halbgesichtsmaske wiederverwendbaren respiratoder mit Partikelfilter, Schutzbrille, Handschuhe und Schutzkleidung sollte im Verlauf der Exposition verwendet werden.

Fig. 1: Schematische Darstellung der Versuchsvorrichtungen zum Erzeugen eines Aerosols verwendet Der Einlass des Zerstäubers ist mit einer Luftversorgung verbunden ist. Der Auslass des Zerstäubers wird zunächst auf einen Strömungsmesser über einen 15,9-mm-Rohr und einem Luftfilter und Luftzufuhr verbunden ist, um 5,0 l / min bei 2 kbar Druck eingestellt. Der Auslaß ist an einen nächsten verbundenen Plexiglasbox mit abnehmbarem Deckel und 5 mm Löcher um einen Druckaufbau zu verhindern ausgestattet.

4. Verbinden des Auslasses des Zerstäubers an einen Massendurchflussmesser über einen Luftfilter. Verbinden Sie den Massedurchflussmesser mit einer elektrischen Versorgung.
5. Stellen Sie die Luftzufuhr zu 5 l / min, mit 1,0 bis 2,0 bar Restdruck.
6. Entfernen Sie die Massedurchflussmesser undTrennen Sie die Luftzufuhr.
7. Verbinden den Auslaß der Zerstäuber auf eine 15,9-mm-Rohr, die sich gabelt und verbindet zwei Plexiglasboxen mit den Abmessungen: 150 x 163 x 205 mm, mit abnehmbaren Deckeln versehen. Jede Box ist ein 5 mm Loch in der Seite gegenüber der Einlass, um Druckaufbau zu verhindern.
8. Platzieren Sie bis zu 5 Mäusen in jeder Plexiglas-Box, und schließen Sie den Deckel.
9. Öffnen des Zerstäubers und Füllen des Einsatzes mit mindestens 4 ml LPS in sterile Kochsalzlösung oder Vehikel gelöst allein (sterile Kochsalzlösung; sollte das Volumen 8 ml nicht überschreiten). Schließen Sie den Einlass zum Luftzufuhr.
10. Lassen Sie das Aerosol in die geschlossene Plexiglasboxen für 10 min fließen. Überwachen Sie die Tiere kontinuierlich. Sicherstellen, dass die Luftzufuhr bleibt fest mit dem Einlass des Zerstäubers gesichert.
11. Trennen Sie die Luftzufuhr. Bei geschlossenen Lidern, lassen Sie die Tiere bleiben in den Plexiglas-Boxen für 2 min.
12. Öffnen Sie den Deckel und lassen für das Aerosol zu zerstreuen, und kehren die Tiere auf ter Käfigen. Wenn die Tiere nass erscheinen, legen Sie die Käfige auf einem Heizkissen auf kleiner Flamme eingestellt, um eine Unterkühlung zu verhindern.
13. Überwachung der Tiere kontinuierlich für die ersten 30 min und danach alle 2 h während der ersten 6 Stunden. Die Tiere sollten normale Atemmuster und Aktivität während und nach der Vernebelung Verfahren aufweisen.

2. Bronchiallavage (BAL)

1. Bei der experimentellen Endpunkt, tief betäuben die Tiere mit Isofluran wirksam wie tierärztliche Personal Ihrer Einrichtung empfohlen. Pinch der Hinterpfote für einen Rückzug Reflex, um eine ausreichende Narkosetiefe zu gewährleisten, um eine größere Operation durchführen zu überprüfen. Sprühen Sie den Pelz der Tiere mit 70% Ethanol.
2. Öffnen Sie den Unterleib mit einer Schere und durchtrennen die Aorta, das Tier exsanguinate. Legen Sie ein Stück Gewebe über den Bauch, um das Blut aufzusaugen.
3. Follwing Euthanasie, eine einzige anterior-posterioren Schnitt der SchereSetzen Sie den Brustkorb. Heben Sie den Brustkorb von der vorderen Spitze des Brustbeins und die Schere, um die Membran am meisten Bauchpunkt durchstoßen, ohne Schneiden in alle Lungenlappen. Öffnen Sie den Brustkorb, indem zwei Schnitte in der Vorwärts-Rückwärts-Richtung (Sitzung unter dem Kiefer).
4. Ziehen Sie vorsichtig neben den Brustkorb mit einer Pinzette und schneiden Sie die Luftröhre unterhalb des Kehlkopfes.
5. Heben Sie die Luftröhre mit der Zange und entfernen Sie die Lunge, die durch Schneiden der Bänder, welche die Lappen in die Brusthöhle und leichtes Ziehen vom Fett- und Herzgewebe.
6. Legen Sie eine Polyethylenschlauch (Innendurchmesser: 0,58 mm; Außendurchmesser: 0,965 mm) in die Luftröhre und sichern Sie den Schlauch mit einer Reihe von Seidenfaden.
7. Binden Sie die multilobe (die vier Lappen der rechten Lunge) mit Seidenfaden.
8. Legen Sie eine 23-Gauge-Nadel in die Polyethylen-Rohr und langsam injizieren 250 ul eiskaltem sterilem PBS in den einzelnen Lappen mit einer 1 ml Spritze.
9. Tippen Sie vorsichtig die Lunge30mal und sammeln die Flüssigkeit durch die Spritze. Wiederholen Sie den Vorgang mit 200 ul PBS (etwa 300 ul PBS von der Betriebslappen aus der gesamten injizierten Volumen von 450 ul wiederhergestellt werden).
10. Halten Sie den bronchoalveolären Lavage (BAL) auf Eis oder Aufzählung der BAL-Zellen sofort. Zähle die Zellen mit einem heamocytometer mit Turk-Lösung, um die Zellen ¹¹ zu färben. Berechnen der Gesamtzellzahl durch Multiplikation der Anzahl der Zellen, die mit dem Verdünnungsfaktor der Färbelösung und das Volumen innerhalb der gezählten Feld des heamocytometer.
11. Bereiten Differentialzellzählungen von zytozentrifugierten Zellen wie anderswo ¹¹ beschrieben.

3. Formalin-Fixierung von Lungengewebe für die histologische Bewertung

1. Entfernen Sie die multilobe und Snap-freeze auf Trockeneis. Bei -80 ° C.
2. Montieren Sie einen 60-ml-Spritze mit dem Kolben auf einem Metallträger Stand entfernt. Füllen Sie die Spritze mit 10% Formalin zudie Höhe von 20 cm über dem Labortisch, was 20 cm konstanter Druck.
3. Verbinden den 23-Gauge-Nadel zur Luftröhre zu dem 60 ml Spritze über ein Kunststoffrohr mit einem Ventil, um den Fluss von Formalin steuern gesichert.
4. Insufflate die Lungenflügel mit Formalin für 5 min. Ziehen Sie die Nadel heraus und entfernen Sie sie zusammen mit der Polyethylenschlauch aus der Luftröhre beim Ziehen an der Seidenfaden, um die Luftröhre zu schließen und den Druck in der Lunge zu erhalten.
5. Tauchen Sie den Lungenlappen in Formalin und beheben 24 Stunden lang bei 4 ° C.
6. Dreimal für mindestens 20 min mit 70% Ethanol waschen das fixierte Gewebe und zu entwässern, um die folgenden Schema (jeweils 1 Stunde) Xylol:
   • 3x 70% Ethanol
   • 3x 95% Ethanol
   • 3x 100% Ethanol
   • 3x Xylol
   • 1x (flüssig) Paraffin
7. Betten Sie dehydriert Gewebe in Paraffin in 4-5 & mgr; m Schnitte geschnitten, und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin zur histologischen Beurteilung ermöglichen.

Ergebnisse

Herausforderung aerosolized P. aeruginosa LPS ergibt in der Regel eine starke entzündliche Reaktion in den Atemwegslumen und Alveolarraum, gekennzeichnet durch ein Vorherrschen der Neutrophilen an beiden frühen und späten Zeitpunkten.

Aerosolized LPS induziert Lungen Neutrophilie

C57BL / 6by und BALB / c-Mäuse wurden einem Aerosol ausgesetzt P. aeruginosa LPS oder Vehikel und Neutrophile wurden in BALF aufgezählt. Die Gesamtzellzahl in der BAL...

Diskussion

Aerosolierte LPS erzeugt eine Entzündungsreaktion in den Atemwegen von Neutrophilen im epithelialen submucosa gekennzeichnet, umgebenden Räumen die leitenden Atemwege, sowie die Alveolen. Dies ist zusammen mit der erhöhten Gesamtproteingehalt in BALF anzeigt Plasmaleckage, repräsentativ für die Pathologie von akuter Lungenverletzung. LPS induziert eine sterile Entzündung ist die Reaktion unabhängig von der adaptiven Immunantwort, und es gibt Grenzen für die Relevanz für bakterielle Infektionen. Die Technik kann...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Scissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½ gage needle			Alternative suppliers exist.
1 ml BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301205	Alternative suppliers exist.
60 ml BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.