التقييم السلوكي للنظام الدهليزي ماوس الشيخوخة

Summary

ومن المعروف التحكم في المحركات والأداء التوازن في التدهور مع تقدم العمر. تعرض هذه الورقة على عدد من الاختبارات السلوكية موسع القياسية مع إضافة حافزا دوارة بسيطة لتحدي النظام وتظهر التغيرات في الأداء الدهليزي التوازن في نموذج الفئران الشيخوخة.

Abstract

ويرتبط انخفاض سن ذات الصلة في أداء التوازن مع تدهور قوة العضلات، والتنسيق الحركي وظيفة الدهليزي. في حين أن عددا من الدراسات تظهر تغيرات في توازن النمط الظاهري مع التقدم في العمر في القوارض، وعدد قليل جدا عزل مساهمة الدهليزي لتحقيق التوازن تحت أي ظروف طبيعية أو أثناء الشيخوخة. نحن نستخدم اثنين من الاختبارات السلوكية معيار لتميز الأداء ميزان الفئران في نقاط محددة على مدى عمر عمر: اختبار rotarod ويميل اختبار عارضة التوازن. على الرغم من أهمية، يتم استخدام محور دوار العرف بنيت أيضا على تحفيز الجهاز الدهليزي من الفئران (دون التسبب علامات العلني من دوار الحركة). وقد استخدمت هذه الاختبارين تبين أن التغيرات في الأداء الدهليزي بوساطة التوازن موجودة على مدى عمر الفئران. تظهر النتائج الأولية أن كلا من اختبار rotarod وتعديل اختبار التوازن شعاع يمكن استخدامها لتحديد التغييرات في الأداء التوازن أثناء الشيخوخة كبديل لأكثر difficتقنيات الموج والغازية مثل الدهليزي العيني (VOR) القياسات.

Introduction

لدينا نوع من التوازن ربما يكون واحدا من المكونات الحيوية أكثر التغاضي حتى الآن حتى في الأنشطة الحركية الأساسية بما في ذلك المشي وتحول. ويتأثر التوازن عن طريق العديد من العوامل بما في ذلك قوة العضلات، والتنسيق الحركي وظيفة الدهليزي، وأنها ليست سوى في وجود اعتلال الأعصاب الدهليزي أو أثناء الشيخوخة الطبيعية التي هي محل تقدير أهمية وجود نظام توازن تعمل بشكل كامل. غالبا ما ترتبط اضطرابات للنظام الدهليزي مع الخبرات من الدوار والدوخة أو واختلال التوازن مما يؤدي إلى زيادة خطر السقوط والإصابات اللاحقة ^1. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما في السكان المسنين حيث السقوط هي واحدة من الأسباب الرئيسية للإصابة ^2.

وتستند اختبارات وظائف الدهليزي عادة على ردود الفعل الدهليزي، على وجه الخصوص، إلى الدهليزي العيني (VOR) أو إلى الدهليزي collic العاكسة (VCR). وVOR وVCR ضرورية لتحقيق الاستقرار في الصور علىموقف شبكية العين والرأس خلال حركات الرأس والجسم على التوالي. عادة، والقياسات VOR تتطلب زرع الغازية من بحث ملفات لقياس حركات العين أو تتبع حركة العين من الفيديو ^3. هذا هو التحدي في الفئران بسبب طبيعة صغير من العين الماوس وصعوبة في الكشف عن التلميذ لتحليل الفيديو ^3. كبديل، تم استخدام جهاز فيديو لقياس استقرار الرأس في استجابة لحركات الجسم في الفئران دون الحاجة للجراحة الغازية ^4. على الرغم من هذا، والتركيز على عدد قليل من الدراسات على وجه التحديد كيفية أداء النظام الدهليزي ككل، والأهم من ذلك كيف يتغير أثناء الشيخوخة.

لتقييم الأداء التوازن العام ببساطة ونحن noninvasively تعديل اختبارين السلوكية شائعة الاستخدام. وrotarod ويميل الميزان شعاع اختبارات تقييم جوانب مختلفة من الأداء الحركي في القوارض والدراسات السابقة استخدمت في بطارية اختبار لاكتساب كاملةالملف الشخصى القدرة الحركية. يمكن أن تتأثر هذه القدرة عن طريق المرض أو التعديل الوراثي، وأيضا حساسة للعمليات المرتبطة التطور الطبيعي والشيخوخة ^5-7. العمل في وقت سابق باستخدام rotarod قد أظهرت أن التنسيق الحركي في الفئران ينخفض ​​بعد 3 أشهر من ⁸ السن. بالإضافة إلى ذلك، تظهر الفئران عجز الميزان ملحوظ مع زيادة العمر على اختبار التوازن شعاع ^9.

تصف هذه الورقة استخدام rotarod والتوازن شعاع الاختبارات بالتزامن مع التحفيز الدهليزي من أجل تحدي النظام الدهليزي وتوصيف الأثر اللاحق على التوازن في أداء الفئران الشباب وكبار السن. في حين أن وسائل بسيطة وموسع وصفها ليست مصممة باعتبارها تدابير قائمة بذاتها وظيفة دهليزي الطرفية، وأنها لا توفر مقياسا السلوكية مفيدة وبسيطة لمقارنة التغيرات الخلوية والتحت خلوية في مراحل متعددة من خلال تجهيز الدهليزي الشيخوخة الطبيعية في الفئران.

Protocol

1. الحيوانات

1. وتم الحصول على الفئران (C57/BL6) من الأعمار 1، 9، و 13 شهرا من العمر من مركز الثروة الحيوانية (بيرث، أستراليا). وتم إيواء هذه الفئران في أقفاص الماوس القياسية في مرفق بوش القوارض في جامعة سيدني على 12/12 ساعة ضوء / دورة الظلام مع الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. تمت الموافقة على الإجراءات المبينة أدناه من جامعة سيدني جنة الأخلاقيات الحيوانية.
2. جلب أقفاص الماوس إلى غرفة الاختبار قبل كل اختبار لمدة 10 دقيقة للسماح للتأقلم الفئران لبيئة الاختبار.

2. Rotarod

1. إعداد جهاز rotarod (الشكل 1A):
   1. تثبيت المسامير في كل حارة من rotarod.
      ملاحظة: في هذا المثال الفئران المسامير (70 مليمتر في القطر) وتستخدم بدلا من المسامير الماوس (32 مليمتر في القطر) للحد من الفئران من التمسك وتد وأداء "تناوب السلبي" ^10.
   2. يفترضايون منصات الهبوط المغناطيسي على السلك تقع في الجزء السفلي من كل حارة من rotarod التأكد من أنها لا تميل للمس أرضية rotarod ويتم وضعها في أقرب مكان ممكن إلى اليمين الجدار المغناطيسي من كل حارة من دون لمس.
      ملاحظة: أثناء مطلوبة rotarod الفئران الاختبار على السير في الاتجاه إلى الأمام للبقاء على المسامير الدورية والتسارع. عندما ماوس لم يعد قادرا على البقاء على وتد، وأنها تقع وتهجير منصة الهبوط الذي ينشط في وقت لاحق الاستشعار المغناطيسي. الوقت المستغرق ليسقط من وتد الدورية، ودورة في الدقيقة وتد في وقت السقوط ويتم حساب المسافة المقطوعة تلقائيا لكل الماوس وتسجيلها على شاشة العرض في الجزء الأمامي من rotarod.
   3. الشريحة 2 لوحات من البلاستيك واضحة في الجزء الأمامي من كل حارة rotarod مع لوحات أقصر في الجزء السفلي، والألواح تعد أعلاه.
   4. إدخال المعلمات اختبار باستخدام لوحة المفاتيح التي تقع في الجزء الأمامي من rotarod. اتبع شارعالعائد على السهم 2.1.4.1 ل2.1.4.6 لتسريع rotarod اختبار المعلمات والخطوات 2.1.4.7 ل2.1.4.12 لسرعة rotarod اختبار المعلمات ثابتة.
      1. تعيين المدة القصوى للاختبار إلى 60 ثانية.
      2. تعيين عدد من الممرات لاستخدامها (أو عدد من الفئران لفحصها).
      3. ضبط سرعة انطلاق من الاختبار إلى 5 دورة في الدقيقة.
      4. تعيين سرعة أعلى من اختبار إلى 44 دورة في الدقيقة.
      5. تعيين سرعة المنحدر من الاختبار إلى 60 ثانية.
      6. تعيين حجم المسامير المختار واتجاه دوران إلى المسامير الفئران الدورية في اتجاه الأمام.
      7. تعيين المدة القصوى للاختبار إلى 240 ثانية.
      8. تعيين عدد من الممرات لاستخدامها في 1 كما يتم اختبار الفئران بشكل فردي.
      9. ضبط سرعة انطلاق من الاختبار إلى 15 دورة في الدقيقة.
      10. تعيين سرعة أعلى من اختبار إلى 15 دورة في الدقيقة.
      11. تعيين سرعة المنحدر من الاختبار إلى 0 ثانية.
      12. تعيين حجم وتد المختار واتجاه دوران إلى وتد الفئران الدورية في forwaالاتجاه الثالث.
          ملاحظة: قد يتم تغيير الإعدادات أعلاه لتتناسب مع احتياجات تجارب مختلفة.
   5. وضع الكاميرا أمام rotarod لاختبار سرعة ثابتة rotarod، بحيث سلوك الماوس أثناء المحاكمات يمكن تسجيل وأشرطة الفيديو المستخدمة لتحليلها لاحقا لتحديد مدة الوقت كانت قادرة على البقاء على rotarod الفئران.
2. اتبع الخطوات من 2.2.1 إلى 2.2.4 للاختبار rotarod تسريع:
   1. ضع مؤشر الفأرة احدة على كل وتد ثابت لمدة 5 دقائق للسماح للتأقلم الفئران إلى rotarod.
   2. دفع برفق الفئران لمواجهة الخلفي من rotarod وبدء الاختبار rotarod عندما تواجه جميع المواد الدراسية في هذا الاتجاه (انظر الشكل 1B).
   3. عودة جميع الفئران لأقفاصها عندما سقطوا من المسامير الدورية وتركهم للراحة لمدة 10 دقيقة مع إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء.
   4. كرر الخطوات من 2.2.1 إلى 2.2.3 لإكمال ما مجموعه 8 محاكمات التأكد من تنظيفالمسامير، والممرات، ومنصات هبوط rotarod عن البول والبراز، ونقل منصات الهبوط مرة أخرى إلى نقطة الانطلاق لها بين العامين كل محاكمة.
      ملاحظة: يتم استخدام التجارب الأولى 3-5 كما محاكمات التدريب للسماح للفئران لتعريف أنفسهم مع هذه المهمة. الوقت في الانخفاض، مشى مسافة وسجلت نهاية دورة في الدقيقة من وتد في وقت سقوط لكل محاكمة لاحقة لتحليلها لاحقا (الشكل 2).
3. اتبع الخطوات من 2.3.1 إلى 2.3.8 لاختبار سرعة ثابتة rotarod:
   1. ضع مؤشر الفأرة احد على وتد لمدة 5 دقائق للسماح لها للتأقلم على rotarod. العودة الماوس مرة أخرى إلى قفصه.
   2. بدء تسجيل الفيديو على الكاميرا وبداية الصحافة على rotarod. ثم ضع الماوس على وتد الدورية ضمان أنها تواجه الجزء الخلفي من rotarod.
   3. وقف تسجيل الفيديو على الكاميرا عندما يسقط الماوس من المسامير الدورية، والعودة الماوس لأقفاص لمدة 10 دقيقة مع إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء.
   4. كرر الخطوات 2.3.2 2.3.3 وحتى يتم الحصول على ما مجموعه 8 محاكمات التأكد من تنظيف المسامير، والممرات، ومنصات هبوط rotarod عن البراز والبول، ونقل منصات الهبوط مرة أخرى إلى نقطة الانطلاق بها بين كل محاكمة .
   5. التبديل على العرف بنيت المدورة في 3 هرتز لمدة 20 ثانية للسماح للفئران لتصبح مألوفة مع الصوت. وقف المدورة بعد 20 ثانية عن طريق التحول قبالة الحفر ووضع يديه على جانبي عجلة دوارة لمنعه من الاستمرار في زيادة ونقصان الماضي 20 ثانية الأولي.
      ملاحظة: المدورة نفسه يتكون من عجلة القوارض تشغيل المضمون إلى (3A الشكل) الحفر. في وسط عجلة دوارة هو غرفة صغيرة مع غطاء شبكة حيث يتم وضع الماوس (الشكل 3B). ويدور محور دوار في اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة حول محور عمودي. حجم التحفيز يتماشى مع الدراسات السابقة التي تظهر التحفيز الدوارة تتراوح 0،2-3 هرتز تكفي لينايرأكلت VOR وVCR الردود ^4،11،12.
   6. ضع الماوس داخل غرفة في وسط الدوار واستبدال الغطاء.
   7. التبديل على محور دوار في وضع أدنى مستوياته من 3 هرتز لمدة 20 ثانية. بدء rotarod ويبدأ تسجيل الفيديو على الكاميرا خلال هذه الفترة استعدادا للمحاكمة القادمة. إيقاف التدريبات في نهاية ال 20 ثانية ووضع يديه على جانبي عجلة دوارة لمنعه من الغزل. إعادة اختبار الماوس على rotarod بعد نقله على الفور من قبل في أسرع وقت ممكن إلى وتد الدورية.
   8. وقف تسجيل الفيديو على الكاميرا عندما يسقط الماوس من وتد والعودة الماوس لقفصه.
4. تنظيف الألواح البلاستيكية واضحة مع معتدل المنظفات / مزيج الماء والمسامير أسطواني، والممرات ومنصات هبوط المعادن من rotarod مع الايثانول 70٪ عندما تم اختبار جميع الفئران.

3. عارضة التوازن مع الدهليزي التحدي

1. إعداد باانس جهاز شعاع كما رأينا في الشكل 4A.
   ملاحظة: تم تكييفها الجهاز توازن شعاع من جهاز موضح في كارتر وآخرون (2001) ^13. لهذا الاختبار، والفئران سيرا على الأقدام من الطرف الأدنى من الحزم، وهو 52.5 سم فوق الأرض، إلى مربع غطت المرمى (13 × 22 سم، مع مدخل سم 5 × 6) تقع 60 سم فوق سطح الأرض (الشكل 4A ). الفئران يسعى بطبيعة الحال من الظلام والحماية من مربع هدف لصالح شعاع المكشوفة ويتم تشجيع مزيد من اجتياز شعاع من الصعود الطفيف الذي يستغل آلية على الهروب من الطبيعي أن تعمل في الاتجاه الصعودي ^14. شعاع نفسها هو 1 متر في الطول، ولها مقطع عرضي دائري يبلغ قطرها 14 ملم. مجموعة مصممة من أقطار شعاع يمكن استخدامها والذي يسمح للمجرب لضبط حساسية الاختبار أو استيعاب موضوعات أكبر. في الطرف الأدنى من عارضة التوازن يشير إلى وجود خط أبيض على خط البداية. وكان خط آخرتعادل 60 سم من خط البداية في نهاية أعلى من الحزم للإشارة إلى خط النهاية (الشكل 4A).
   1. موقف 2 الكاميرات، واحدة على كل جانب من جانبي عارضة التوازن، في نهاية السفلي من عارضة التوازن (الشكل 4B).
      ملاحظة: يجب أن تكون الزاوية هذه الكاميرات لالتقاط كامل طول عارضة التوازن والتأكد من أن البداية والنهاية خطوط ملحوظ على عارضة التوازن واضحة للعيان. وسوف تستخدم هذه الكاميرات لتسجيل الفيديو على سلوك الفئران لأنها تعبر عارضة التوازن، مع ما يترتب على أشرطة الفيديو التي تستخدم لتحليلها لاحقا.
   2. تبطن أرضية مربع الهدف مع منشفة ورقية، لتمكين سهولة التنظيف من البول والبراز بعد اختبار كل فأر، ووضع قبة الإسكان من القفص الموضوعات المنزل داخل منطقة الجزاء الهدف.
   3. وضع رغوة كافية أو غيرها من المواد توسيد تحت شعاع رفعت لحماية أي الموضوعات التي تقع من الجهاز. وسيتم اختيار الفئران التي تقع على الفور عن طريق التجربةإيه وضعت داخل منطقة الجزاء الهدف للراحة.
2. ضع مؤشر الفأرة احدة في مربع الهدف لمدة 2 دقيقة بحيث يصبح مألوفا مع هذه البيئة. تغطية الانفتاح على مربع الهدف مع قفاز لمدة 5 ثوانى إذا حاول الماوس على المشي على شعاع خلال هذا الوقت لثني هذا السلوك.
3. تدريب الماوس عن طريق وضعها على شعاع خارج الانفتاح على مربع الهدف، والسماح لها على السير في مربع الهدف. مواصلة تدريب الماوس عن طريق وضعها على شعاع تدريجيا بعيدا عن مربع الهدف حتى الفأر هو قادرا على المشي من خط البداية إلى مربع الهدف مع عدم وجود الحد الأدنى من المساعدة وتردد. ترك الماوس للراحة في مربع الهدف لمدة 1 دقيقة بعد كل شوط.
4. بدء اختبار الماوس عند اكتمال التدريب.
   1. بدء تسجيل الفيديو على الكاميرات.
   2. ضع الماوس على خط البداية من الحزم والانتظار في حين أنه يخترق شعاع في الاتجاه من مربع الهدف.
   3. وقف تسجيل الفيديو على كاليفورنياميراث عندما يصل الماوس مربع.
   4. ترك الماوس للراحة في مربع الهدف لمدة 1 دقيقة. إزالة أي البول أو البراز التي قد تكون قد أودعت خلال المحاكمة أثناء انتظار.
   5. كرر الخطوات من 3.4.1 إلى 3.4.4 حتى تم إنجاز ما مجموعه 5 المحاكمات.
5. التبديل على محور دوار العرف بنيت في 3 هرتز لمدة 20 ثانية (كما هو الحال في اختبار rotarod سرعة ثابتة) للسماح الفئران لتصبح مألوفة مع الصوت. وقف المدورة بعد 20 ثانية عن طريق التحول قبالة الحفر ووضع يديه على جانبي عجلة دوارة لمنعه من الغزل.
6. ضع الماوس داخل غرفة في وسط الدوار واستبدال الغطاء.
7. التبديل على محور دوار في وضع أدنى مستوياته من 3 هرتز لمدة 20 ثانية. بدء تسجيل الفيديو على الكاميرات خلال هذا الوقت، وذلك استعدادا للمحاكمة القادمة. إيقاف التدريبات في نهاية ال 20 ثانية ووضع يديه على جانبي عجلة دوارة لمنعه من الاستمرار في زيادة ونقصان الماضي 20 ثانية الأولي. Tاملحول الماوس لبداية عارضة التوازن في أسرع وقت ممكن، والانتظار لحين الماوس يخترق شعاع إلى مربع الهدف.
8. وقف تسجيل الفيديو على الكاميرات عندما يصل الماوس مربع الهدف والعودة الماوس لقفصه.
9. تنظيف جهاز عارضة التوازن مع الايثانول 70٪ وتغيير منشفة ورقية في مربع الهدف بعد أن تم اختبار كل الماوس.

النتائج

Rotarod

وقد وصفت أداء المحركات من الفئران كما الوقت لسقوط (الصناديق) المسجلة لكل الماوس فوق 8 المحاكمات. باستخدام هذه القياسات من الصناديق، يمكن رسم منحنيات التدريب لكل الماوس. ويبين الشكل 2 أمثلة على الأداء الحركي واحدة من ال...

Discussion

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

وقد أظهرت الأعمال السابقة أنه من السهل أن الفئران إفرط في التدريب على كل من rotarod وجهاز عارضة التوازن ونتيجة لذلك، واقتناء قياسات دقيقة يمكن أن يكون تحديا ^15. على سبيل المثال، بإفراط على rotarod يمكن أن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotarod	IITC Life Science Inc.	#755	"Rat dowels" = 70 mm diameter. Do not allow ethanol to contact perspex.
iPhone	Apple		Can use any type of camera. Velcro fixed to the back surface for attachment to the the 3D articulated arm.
3D articulated arm	Fisso/Baitella	Classic 3300-28	Any type of stable vertical stand would be adequate. Velcro is fixed to the apical end of the arm for iPhone attachment.
Wooden walking beam: 1 m long strip of smooth wood with a circular cross-section of 14 mm diameter			A range of diameters and cross section shapes can be used to suit experimental parameters
Wooden goal box (130 x 140 x 220 mm) made from 11 mm thick boards
Support stand made of 41 x 41 mm beams: 2 vertical beams 525 and 590 mm from ground at the start and goal ends respectively; 803 mm horizontal beam that runs along the ground directly under the walking beam; two 20 mm long beams act as "feet", joining the horizontal and vertical beams at each end; a 21 x 21 x 36 mm block hewn at the apical end of the "starting" vertical beam; a 13 x 13 mm aperture cut out of the center of this block, forming a tunnel which runs perpendicular to the walking beam.			Brace all joins with small steel brackets.
Black paint (water based)	Handycan	Acrylic Matt Black	2-3 coats for all wooden surfaces of the balance beam apparatus
Clear finish	Wattle Estapol	Polyurethane Matt	Single coat for all beams. Double coat for all other surfaces of the balance beam apparatus
Foam, packaging material			To cushion any falls from the balance beam
70% Ethanol, paper towels			Clean beam and goal box between each animal.
Gauze pads/paper towels			To line the floor of the goal box
Mouse house (from home cage)