Evaluación del Comportamiento del Envejecimiento Ratón Sistema Vestibular

Resumen

Control del motor y el rendimiento balanza se conocen a deteriorarse con la edad. Este artículo presenta una serie de pruebas de comportamiento no invasivas estándar con la adición de un estímulo rotatorio sencillo para desafiar al sistema y mostrar los cambios en el rendimiento vestibulares equilibrio en un modelo murino de envejecimiento.

Resumen

Declive relacionado con la edad en el rendimiento balanza se asocia con el deterioro de la fuerza muscular, la coordinación motora y la función vestibular. Mientras que un número de estudios muestran cambios en el fenotipo equilibrio con la edad en los roedores, muy pocos aislar la contribución vestibular para equilibrar tanto en condiciones normales o durante la senescencia. Utilizamos dos pruebas de comportamiento estándar para caracterizar el desempeño equilibrio de los ratones en los puntos de edad definidos durante la vida útil: la prueba rotarod y la prueba de barra de equilibrio inclinado. Es importante destacar, sin embargo, un rotador hecha a la medida también se usa para estimular el sistema vestibular de los ratones (sin inducir signos manifiestos de la enfermedad de movimiento). Estas dos pruebas se han usado para mostrar que los cambios en el rendimiento vestibular-equilibrio mediada están presentes durante la vida útil murino. Los resultados preliminares muestran que tanto la prueba de rotarod y la prueba de barra de equilibrio modificada se pueden usar para identificar cambios en el rendimiento de equilibrio durante el envejecimiento como alternativa a la más diffictécnicas ult e invasivos tales como (VOR) mediciones vestíbulo-ocular.

Introducción

Nuestro sentido del equilibrio es tal vez uno de los componentes vitales aún más olvidadas de incluso las actividades motoras más básicos como el senderismo y el torneado. Balanza está influenciada por numerosos factores, incluyendo la fuerza muscular, coordinación motora y la función vestibular, y es sólo en la presencia de neuropatías vestibulares o durante el envejecimiento normal que se aprecia la importancia de un sistema de equilibrio pleno funcionamiento. Alteraciones en el sistema vestibular son frecuentemente asociados con experiencias de vértigo o mareo y el desequilibrio que resulta en un mayor riesgo de caídas y lesiones posteriores ^1. Esto es particularmente crítico en las poblaciones de más edad, donde las caídas son una de las principales causas de lesiones ^2.

Pruebas de la función vestibular se basan comúnmente en los reflejos vestibulares, en particular, el vestíbulo-ocular (VOR) o el reflejo vestíbulo-Collic (VCR). El VOR y VCR son esenciales para la estabilización de imágenes enla posición de la retina y la cabeza durante los movimientos de la cabeza y el cuerpo, respectivamente. Comúnmente, las mediciones VOR requieren la implantación invasivo de bobinas de búsqueda para medir los movimientos oculares o de seguimiento de vídeo de movimiento de los ojos ^3. Este es un reto en ratones debido a la pequeña naturaleza del ojo del ratón y la dificultad en la detección de la pupila para el análisis de vídeo ^3. Como una alternativa, el VCR ha sido utilizado para medir la estabilización de la cabeza en respuesta a los movimientos del cuerpo en ratones sin la necesidad de cirugía invasiva ^4. A pesar de esto, pocos estudios se centran específicamente en cómo el sistema vestibular funciona como un todo y lo más importante cómo cambia durante el envejecimiento.

Para evaluar el desempeño global de la balanza de manera sencilla y no invasiva modificamos dos pruebas de comportamiento de uso común. Las pruebas de barra de equilibrio y rotarod inclinadas evaluar diferentes aspectos del rendimiento del motor en los roedores y en los estudios anteriores se han utilizado en una batería de pruebas para adquirir una completael perfil de la capacidad del motor. Esta capacidad puede ser afectado por la enfermedad o la modificación genética, y también es sensible a los procesos asociados con el desarrollo normal y el envejecimiento ^5-7. A principios de trabajo utilizando el rotarod ha demostrado que la coordinación motora en ratones disminuye después de 3 meses de edad ^8. Además, las ratas muestran déficits de la balanza notable con la edad en la prueba de barra de equilibrio ^9.

En este trabajo se describe el uso de las pruebas rotarod y barra de equilibrio, en relación con un estímulo vestibular con el fin de desafiar el sistema vestibular y caracterizar el consiguiente impacto sobre el equilibrio en ratones jóvenes y mayores. Mientras que los métodos simples y no invasivos descritos no están diseñados como medidas independientes de la función vestibular periférica, que proporcionan una medida del comportamiento útil y simple para comparar los cambios celulares y subcelulares en múltiples etapas de procesamiento vestibular durante el envejecimiento normal en ratones.

Protocolo

1. Animales

1. Los ratones (C57/BL6) de edades 1, 9, y 13 meses de edad se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (Perth, Australia). Estos ratones fueron alojados en jaulas estándar de ratón en el Fondo para el Bosch de roedores en la Universidad de Sydney en un 12/12 horas de luz / oscuridad ciclo con acceso a alimentos y agua ad libitum. Los procedimientos que se describen a continuación fueron aprobados por la Universidad de Comité de Ética Animal Sydney.
2. Traiga jaulas de ratón en la sala de pruebas antes de cada prueba durante 10 minutos para permitir ratones para aclimatarse al entorno de pruebas.

2. De Rotarod

1. La instalación del equipo rotarod (Figura 1):
   1. Instale las espigas en cada carril del rodillo giratorio.
      Nota: En este ejemplo, la rata tacos (70 mm de diámetro) se utilizan en lugar de las clavijas de ratón (32 mm de diámetro) para desalentar a los ratones de aferrarse a la espiga y la realización de "rotaciones pasivos" ^10.
   2. Postularion las plataformas de aterrizaje magnéticos en el cable situado en la parte inferior de cada carril de la rotarod asegurarse de que no están inclinando a tocar el suelo del rodillo giratorio y se colocan lo más cerca posible a la pared de la derecha magnética de cada carril sin tocarse.
      Nota: Durante los ratones de prueba se requieren rotarod a caminar en una dirección hacia adelante para permanecer en los pasadores de rotación y aceleración. Cuando un ratón ya no es capaz de permanecer en la clavija, caen y se desplazan a la plataforma de aterrizaje que posteriormente se activa un sensor magnético. El tiempo necesario para caer de la espiga giratoria, las rpm del pasador en el momento de la caída y la distancia recorrida se calcula automáticamente para cada ratón y grabada en la pantalla de visualización en la parte delantera de la varilla rotatoria.
   3. Deslice 2 paneles de plástico transparente en la parte frontal de cada carril rotarod con los paneles más cortos en la parte inferior y los paneles más largos por encima.
   4. Introduzca los parámetros de la prueba utilizando el teclado situado en la parte delantera del cilindro giratorio. Siga ªeps 2.1.4.1 a 2.1.4.6 para los parámetros de la prueba rotarod aceleración y pasos 2.1.4.7 a 2.1.4.12 para los parámetros de la prueba de velocidad fija rotarod.
      1. Establezca la duración máxima de la prueba a 60 segundos.
      2. Establecer el número de carriles que se utilizará (o el número de ratones que ser probado).
      3. Ajuste la velocidad de inicio de la prueba a 5 rpm.
      4. Ajuste la velocidad máxima de la prueba a 44 rpm.
      5. Ajuste la velocidad de rampa de la prueba a 60 segundos.
      6. Ajuste el tamaño de las clavijas elegidos y el sentido de giro a clavijas de rata que giran en una dirección hacia adelante.
      7. Establezca la duración máxima de la prueba a 240 seg.
      8. Establecer el número de carriles que se utilizarán en 1 como los ratones se prueban individualmente.
      9. Ajuste la velocidad de inicio de la prueba a 15 rpm.
      10. Ajuste la velocidad máxima de la prueba a 15 rpm.
      11. Ajuste la velocidad de rampa de la prueba a 0 seg.
      12. Ajuste el tamaño de la espiga elegido y la dirección de rotación a una espiga de rata gire en un forwadirección rd.
          Nota: Los ajustes anteriores pueden ser modificados para adaptarse a las necesidades de los diferentes experimentos.
   5. Coloque una cámara en frente del rodillo giratorio para la prueba de rotarod de velocidad fija, de modo que el comportamiento del ratón durante los ensayos puede ser grabado y los videos utilizados para el análisis posterior para determinar la duración de tiempo que los ratones eran capaces de permanecer en el rotarod.
2. Siga los pasos 2.2.1 al 2.2.4 para el test rotarod aceleración:
   1. Coloque un ratón en cada espiga estacionaria durante 5 min para permitir que los ratones se aclimaten a la rotarod.
   2. Empujar suavemente los ratones para hacer frente a la parte posterior del cilindro giratorio y empezar la prueba de rotarod cuando todos los sujetos se enfrentan en esta dirección (véase la Figura 1B).
   3. Volver a todos los ratones a sus jaulas cuando han caído de los pasadores de rotación y dejarlos en reposo durante 10 minutos con el acceso a alimentos y agua.
   4. Repita los pasos 2.2.1 al 2.2.3 para completar un total de 8 pruebas, asegurándose de limpiarlas clavijas, carriles, y las plataformas de aterrizaje de la rotarod para la orina y las heces, y mover las plataformas de aterrizaje de vuelta a su posición inicial Transcurrirá cada ensayo.
      Nota: Los primeros 3-5 ensayos se utilizan como pruebas de entrenamiento para permitir que los ratones se familiaricen con la tarea. La hora a la baja, la distancia recorrida y las rpm del extremo de la espiga en el momento de la caída de cada ensayo posterior se registra para su posterior análisis (Figura 2).
3. Siga los pasos 2.3.1 al 2.3.8 para el test rotarod velocidad fija:
   1. Coloque un ratón en una espiga durante 5 minutos para permitir que se aclimate a la rotarod. Devuelva el ratón de nuevo a su jaula.
   2. Inicie la grabación de vídeo en la cámara y pulse Inicio en el cilindro giratorio. A continuación, coloque el ratón en la espiga giratoria asegurar que se enfrenta a la parte posterior del cilindro giratorio.
   3. Detenga la grabación de vídeo de la cámara cuando el ratón se cae de las espigas giratorias, y devolver el ratón para sus jaulas durante 10 minutos con el acceso a alimentos y agua.
   4. Repita los pasos 2.3.2 y 2.3.3 hasta que se adquirió un total de 8 pruebas, asegurándose de limpiar las clavijas, carriles, y las plataformas de aterrizaje de la rotarod de las heces y la orina, y mover las plataformas de aterrizaje de vuelta a su posición de partida entre cada ensayo .
   5. Encienda el rotador costumbre construido a 3 Hz durante 20 segundos para permitir que los ratones se familiaricen con el sonido. Detenga el rotador tras 20 seg apagando el taladro y coloque una mano a cada lado de la rueda para correr a evitar que continúe a girar más allá del 20 seg inicial.
      Nota: El rotador en sí consta de una rueda de roedor funcionamiento asegurado a un taladro (Figura 3A). En el centro de la rueda de funcionamiento es una pequeña cámara con una tapa de malla en el que el ratón se coloca (Figura 3B). El rotador gira en sentido contrario a las agujas del reloj alrededor del eje vertical. La magnitud del estímulo está en línea con los estudios anteriores que muestran estimulaciones giratorios que van de 0,2 a 3 Hz son suficientes para generarcomió respuestas VOR y VCR ^4,11,12.
   6. Coloque el ratón dentro de la cámara en el centro del rotor y reemplazar la tapa.
   7. Encienda el rotador en la posición mínima de 3 Hz durante 20 s. Inicie el rotarod y empezar a grabar vídeo en la cámara durante este tiempo en la preparación para el próximo juicio. Desconecte el taladro al final de los 20 segundos y coloque una mano a cada lado de la rueda de correr para que deje de girar. Vuelva a probar el ratón sobre el rodillo giratorio inmediatamente después transfiriéndola lo más rápido posible a la clavija giratoria.
   8. Detenga la grabación de vídeo de la cámara cuando el ratón se cae de la espiga y devolver el ratón a su jaula.
4. Limpiar los paneles de plástico transparente con una mezcla de detergente suave / agua y las espigas cilíndricas, carriles y plataformas de aterrizaje de metal de la varilla rotatoria con etanol al 70% cuando todos los ratones han sido probados.

3. Barra de equilibrio con vestibular Desafío

1. Configurar el baaparato de haz de la lanza como se ve en la Figura 4A.
   Nota: El aparato de barra de equilibrio fue adaptado de un aparato descrito en Carter et al (2001) ^13.. Para esta prueba, los ratones a pie desde el extremo inferior de la viga, que es 52,5 cm por encima del suelo, a una caja oscurecida objetivo (13 x 22 cm, con una puerta 5 cm x 6) situada 60 cm por encima del suelo (Figura 4A ). Los ratones naturalmente buscan la oscuridad y la protección de la caja de meta a favor de la viga expuesta y se anima más que atravesar el haz por la ligera inclinación que explota su mecanismo de escape natural para correr en una dirección hacia arriba ^14. La viga en sí es 1 m de longitud y tiene una sección transversal circular con un diámetro de 14 mm. Una gama adaptada de diámetros de haz se puede utilizar que permite que el experimentador para ajustar la sensibilidad de la prueba o acomodar los sujetos más grandes. En el extremo inferior de la barra de equilibrio de una línea blanca indica la línea de salida. Otra línea ha sidodibujado 60 cm de la línea de salida en el extremo superior de la viga para indicar la línea de meta (Figura 4).
   1. Posición 2 cámaras, una a cada lado de la barra de equilibrio, en el extremo inferior de la barra de equilibrio (Figura 4B).
      Nota: Estas cámaras deben estar en ángulo para capturar toda la longitud de la barra de equilibrio y asegurar que las líneas de salida y llegada marcadas en la barra de equilibrio son claramente visibles. Estas cámaras se utilizan para grabar vídeo el comportamiento de los ratones a medida que atraviesan la barra de equilibrio, con los vídeos resultantes se utilizan para el análisis posterior.
   2. Cubra el piso de la caja de la meta con una toalla de papel, para permitir una fácil limpieza de la orina y las heces después de probar cada ratón, y colocar el domo de la carcasa de la caja temas casa dentro del área chica.
   3. Coloque espuma adecuada u otro material de relleno debajo de la viga elevada a proteger a los sujetos que caen desde el aparato. Los ratones que caen serán recogidos inmediatamente por el experimentoer y colocado dentro del área chica para descansar.
2. Coloque un ratón en el área chica durante 2 minutos para que se familiarice con este entorno. Cubra la apertura al área chica con una mano enguantada durante 5 segundos si el ratón trata de caminar sobre la viga durante este tiempo para desalentar este comportamiento.
3. Capacitar al ratón, colocándolo en la viga a las afueras de la abertura de la caja de la meta y lo que le permite caminar en el área chica. Continuar entrenando el ratón, colocándolo en la viga progresivamente más lejos de la caja de la meta hasta que el ratón es capaz de caminar desde la línea de salida de la caja de la meta sin ayuda y la vacilación mínima. Deja el ratón para descansar en el área chica durante 1 minuto después de cada carrera.
4. Comience evaluando el ratón cuando la formación se ha completado.
   1. Inicie la grabación de vídeo en cámaras.
   2. Coloque el ratón en la línea de salida de la viga y espere mientras se atraviesa el haz en la dirección del área chica.
   3. Detenga la grabación de vídeo en cameras cuando el ratón llega a la caja.
   4. Deja el ratón para descansar en el área chica durante 1 min. Retire cualquier resto de orina o de las heces que pueden haber sido depositados durante el juicio a la espera.
   5. Repita los pasos 3.4.1 a 3.4.4 hasta que se han completado un total de 5 ensayos.
5. Encienda el rotador costumbre construido a 3 Hz durante 20 segundos (como en la prueba rotarod velocidad fija) para permitir que los ratones se familiaricen con el sonido. Detenga el rotador tras 20 seg apagando el taladro y coloque una mano a cada lado de la rueda de correr para que deje de girar.
6. Coloque el ratón dentro de la cámara en el centro del rotor y reemplazar la tapa.
7. Encienda el rotador en la posición mínima de 3 Hz durante 20 s. Inicie la grabación de vídeo de las cámaras durante este tiempo, en preparación para el próximo juicio. Desconecte el taladro al final de los 20 segundos y coloque una mano a cada lado de la rueda para correr para evitar que continúe a girar más allá del 20 seg inicial. Transfer el ratón para el inicio de la barra de equilibrio lo más rápido posible y espere mientras el ratón atraviesa el haz hacia la caja de la meta.
8. Detenga la grabación de vídeo en cámaras cuando el ratón llega al área chica y devolver el ratón a su jaula.
9. Limpie el aparato de barra de equilibrio con 70% de etanol y cambiar la toalla de papel en el área chica después de cada ratón se ha probado.

Resultados

Rotarod

El rendimiento del motor de los ratones fue descrito como el tiempo para quedarse (TTF) registrados para cada ratón sobre 8 ensayos. Usando estas mediciones de RSA, curvas de formación para cada ratón se pueden trazar. Figura 2 muestra ejemplos de la actuación del motor de un ratón 1 mes de edad, y uno 9 meses de edad, puntero del ratón sobre el curso de 8 ensayos. Estas curvas de formación muestran un aumento en TTF durante los primeros 3-5 ensayos seguido de un...

Discusión

Pasos críticos en el Protocolo

El trabajo previo ha demostrado que es fácil de overtrain ratones tanto en el cilindro giratorio y el aparato de barra de equilibrio y como consecuencia, la adquisición de mediciones precisas puede ser un reto ^15. Por ejemplo, el sobreentrenamiento en el cilindro giratorio puede dar lugar a ratones intencionalmente saltar de los tacos durante los períodos de aclimatación y de ensayo, mientras que el sobreentrenamiento en la barra de equilibrio pued...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotarod	IITC Life Science Inc.	#755	"Rat dowels" = 70 mm diameter. Do not allow ethanol to contact perspex.
iPhone	Apple		Can use any type of camera. Velcro fixed to the back surface for attachment to the the 3D articulated arm.
3D articulated arm	Fisso/Baitella	Classic 3300-28	Any type of stable vertical stand would be adequate. Velcro is fixed to the apical end of the arm for iPhone attachment.
Wooden walking beam: 1 m long strip of smooth wood with a circular cross-section of 14 mm diameter			A range of diameters and cross section shapes can be used to suit experimental parameters
Wooden goal box (130 x 140 x 220 mm) made from 11 mm thick boards
Support stand made of 41 x 41 mm beams: 2 vertical beams 525 and 590 mm from ground at the start and goal ends respectively; 803 mm horizontal beam that runs along the ground directly under the walking beam; two 20 mm long beams act as "feet", joining the horizontal and vertical beams at each end; a 21 x 21 x 36 mm block hewn at the apical end of the "starting" vertical beam; a 13 x 13 mm aperture cut out of the center of this block, forming a tunnel which runs perpendicular to the walking beam.			Brace all joins with small steel brackets.
Black paint (water based)	Handycan	Acrylic Matt Black	2-3 coats for all wooden surfaces of the balance beam apparatus
Clear finish	Wattle Estapol	Polyurethane Matt	Single coat for all beams. Double coat for all other surfaces of the balance beam apparatus
Foam, packaging material			To cushion any falls from the balance beam
70% Ethanol, paper towels			Clean beam and goal box between each animal.
Gauze pads/paper towels			To line the floor of the goal box
Mouse house (from home cage)