Behavioral Beurteilung der Alterungs Maus vestibuläre System

Zusammenfassung

Regelungs-und Leistungsbilanz sind dafür bekannt, mit dem Alter verschlechtern. Dieser Beitrag stellt eine Reihe von Standard-nicht-invasive Verhaltenstests mit der Zugabe von einem einfachen Dreh Reiz, um die vestibuläre System und zeigen Veränderungen in der Balance Performance in einem Mausmodell des Alterns herausfordern.

Zusammenfassung

Die altersbedingte Abnahme der Leistungsbilanz wird mit einer Verschlechterung der Muskelkraft, Bewegungskoordination und Gleichgewichtsfunktion. Während eine Reihe von Studien Veränderungen in der Balance Phänotyp mit dem Alter bei Nagetieren, nur sehr wenige zu isolieren, die vestibuläre Beitrag entweder unter Normalbedingungen oder während der Seneszenz Gleichgewicht zu zeigen. Wir verwenden zwei Standard-Verhaltenstests, um die Balance Performance von Mäusen an definierten Punkte über die Lebensdauer zu charakterisieren: die Rotarod Test und der geneigte Schwebebalken-Test. Wichtig ist aber, ist ein custom built Rotator auch verwendet, um das Gleichgewichtssystem von Mäusen (ohne eine deutliche Zeichen für eine Bewegungskrankheit) zu stimulieren. Diese beiden Tests sind verwendet worden, um zu zeigen, dass Veränderungen in der vestibulären vermittelte-Balance-Leistung über die Lebensdauer Maus vorhanden sind. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Rotarod Test und der modifizierten Schwebebalken Test kann verwendet werden, um Änderungen in der Balance Performance während des Alterns als Alternative zu mehr diffic identifizierenult und invasive Techniken wie vestibulookulären (VOR)-Messungen.

Einleitung

Unser Gleichgewichtssinn ist vielleicht einer der am meisten übersehen noch wichtige Komponenten selbst der grundlegenden motorischen Aktivitäten wie Wandern und Drehen. Gleichgewicht wird von zahlreichen Faktoren ab, einschließlich Muskelkraft, Bewegungskoordination und Gleichgewichtsfunktion beeinflusst, und es ist nur in der Gegenwart von vestibulären Neuropathien oder während der normalen Alterung, die die Bedeutung eines voll funktionsfähigen Bilanzsystem wird geschätzt. Störungen des Gleichgewichtssystems sind oft mit Erfahrungen von Schwindel oder Benommenheit und Ungleichgewicht, was zu einem erhöhten Risiko von Stürzen und Verletzungen nachfolgenden ¹ zugeordnet. Dies ist in den älteren Bevölkerungsgruppen, wo Wasserfälle sind eine der führenden Ursachen für Verletzungen ^zwei besonders kritisch.

Vestibuläre Funktionstests werden in der Regel auf den vestibulären Reflexe, insbesondere der vestibulookulären (VOR) oder der vestibulo-Collic Reflex (VCR) basiert. Die VOR-und Videorecorder sind für die Stabilisierung von Bildern aufdie Netzhaut und Kopfposition während der Bewegungen von Kopf und Körper auf. Üblicherweise VOR Messungen erfordern invasive Implantation von Suchspulen Augenbewegungen oder Video-Tracking von Augenbewegungen ³ messen. Dies ist eine Herausforderung an Mäusen aufgrund der kleinen Natur der Maus Auge und die Schwierigkeiten bei der Erfassung der Schüler für die Videoanalyse ^3. Als Alternative hat der Videorecorder wurde verwendet, um die Stabilisierung des Kopfes in Reaktion auf Körperbewegungen bei Mäusen zu messen, ohne die Notwendigkeit einer invasiven Chirurgie ^4. Trotzdem konzentrieren wenige Studien speziell, wie die vestibulären Systems als Ganzes führt und was noch wichtiger ist, wie es während der Alterung ändert.

Zur Gesamtbilanz Leistung zu beurteilen und nicht-invasiv einfach modifizierten wir zwei häufig verwendete Verhaltenstests. Die Rotarod und schräge Schwebebalken Tests bewerten die verschiedenen Aspekte der Motorleistung bei Nagern und in früheren Studien wurden in einer Testbatterie verwendet worden, um eine komplette erwerbenProfil von Kraftfähigkeit. Diese Fähigkeit kann durch Krankheit oder genetischen Veränderung betroffen sein, und ist auch empfindlich auf Prozesse mit normalen Entwicklung und Alterung ^5-7 verbunden. Frühere Arbeiten mit der Rotarod hat gezeigt, dass bei Mäusen, die motorische Koordination lehnt nach 3 Monaten ⁸ Jahren. Darüber hinaus Ratten zeigen Defizite bemerkbar Gleichgewicht mit zunehmendem Alter auf dem Schwebebalken Test ^9.

Dieses Papier beschreibt die Verwendung der Rotarod und Schwebebalken-Tests in Verbindung mit einer vestibulären Stimulus, um das vestibuläre System herausfordern und zu charakterisieren, deren Auswirkungen auf den Bilanz Leistung in jungen und älteren Mäusen. Während die beschriebene einfache und nicht-invasive Verfahren nicht als Stand-alone Maßnahmen peripherer Vestibularfunktion ausgelegt, bieten sie eine nützliche und einfache Verhaltens Maßnahme zur zellulären und subzellulären Veränderungen in mehreren Stufen von vestibulären Verarbeitung während der normalen Alterung bei Mäusen zu vergleichen.

Protokoll

1. Tiere

1. Mäuse (C57/BL6) der im Alter von 1, 9 und 13 Monate alt wurden aus dem Tier Resources Centre (Perth, Australien) erhalten. Diese Mäuse wurden in Standard-Maus-Käfigen in der Bosch-Nager Einrichtung an der Universität von Sydney am 12/12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht. Die nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden von der University of Sydney Tierethikkommission genehmigt.
2. Bringen Maus Käfigen in den Testraum vor jedem Test für 10 min, damit Mäuse an die Testumgebung akklimatisieren.

2. Rotarod

1. Stellen Sie das Gerät Rotarod (Abbildung 1A):
   1. Installieren Sie die Dübel in jeder Spur des Rotarod.
      Hinweis: In diesem Fall Ratte Dübel (70 mm Durchmesser) werden anstelle der Maus Dübel (32 mm Durchmesser) verwendet, um die Mäuse von Festhalten an der Dübel und Durchführen "passive Rotationen" ¹⁰ zu verhindern.
   2. PostulierenIonen die magnetischen Podeste auf dem Draht an der Unterseite jeder Bahn des RotaRod um sicherzustellen, daß sie nicht kippen, um den Boden zu berühren und dem Rotarod liegen so nahe wie möglich an dem magnetischen rechten Wand jeder Fahrspur ohne sich zu berühren angeordnet.
      Hinweis: Während der Tests Rotarod Mäuse sind erforderlich, um in Vorwärtsrichtung gehen, auf den sich drehenden und Beschleunigung Dübel bleiben. Wenn eine Maus ist nicht mehr in der Lage, auf der Dübel zu bleiben, fallen sie und verdrängen die Landeplattform, die später aktiviert einen Magnetsensor. Die Zeit, von der sich drehenden Dübel, Dübel rpm zum Zeitpunkt der Fallen und die zurückgelegte Strecke wird automatisch für jede Maus berechnet und auf dem Bildschirm aufgezeichnet an der Vorderseite des Rotarod fallen übernommen.
   3. Schieben Sie zwei durchsichtige Kunststoffplatten in der Vorderseite jeder Rotarod Spur mit den kürzeren Platten an der Unterseite und die längeren Platten oben.
   4. Geben Sie die Testparameter über die Tastatur auf der Vorderseite des Rotarod entfernt. Folgen Sie steps 2.1.4.1 bis 2.1.4.6 für die Beschleunigung Rotarod Testparameter und die Schritte 2.1.4.7 bis 2.1.4.12 für den Drehzahlfest Rotarod Testparameter.
      1. Stellen Sie die maximale Dauer der Prüfung auf 60 sek.
      2. Die Anzahl der Spuren verwendet werden soll (oder die Anzahl von Mäusen untersucht).
      3. Stellen Sie die Startgeschwindigkeit des Test bis 5 Umdrehungen pro Minute.
      4. Stellen Sie die Spitzengeschwindigkeit des Test bis 44 Umdrehungen pro Minute.
      5. Stellen Sie die Rampengeschwindigkeit des Tests auf 60 sek.
      6. Legen Sie die Größe der gewählten Dübel und die Drehrichtung zu Ratte Dübel in Vorwärtsrichtung dreht.
      7. Stellen Sie die maximale Dauer des Tests zu 240 sek.
      8. Stellen Sie die Anzahl der Fahrspuren auf 1 verwendet werden, wie die Mäuse werden einzeln geprüft werden.
      9. Stellen Sie die Startgeschwindigkeit des Test bis 15 Umdrehungen pro Minute.
      10. Stellen Sie die Spitzengeschwindigkeit des Test bis 15 Umdrehungen pro Minute.
      11. Stellen Sie die Rampengeschwindigkeit des Test auf 0 sek.
      12. Legen Sie die Größe der gewählten Dübel und die Drehrichtung an eine Ratte Dübel in einem rotierenden zukunftsgrd Richtung.
          Anmerkung: Die obigen Einstellungen können verändert werden, um die Bedürfnisse der verschiedenen Experimente gerecht werden.
   5. Legen Sie eine Kamera vor dem Rotarod für die Festdrehzahl Rotarod Test, so dass das Verhalten der Maus während der Versuche aufgezeichnet werden und die Videos zur späteren Analyse verwendet, um die Dauer der Zeit, die Mäuse konnten sich auf dem Rotarod Aufenthalt zu bestimmen.
2. Folgen Sie den Schritten 2.2.1 bis 2.2.4 für die Beschleunigungs Rotarod-Test:
   1. Legen Sie eine Maus auf jeder stationären Dübel für 5 Minuten, damit Mäuse auf dem Rotarod akklimatisieren.
   2. Vorsichtig schubsen die Mäuse auf die Rückseite des Rotarod stellen und starten Sie den Test, wenn Rotarod Alle Themen werden in dieser Richtung zeigen (siehe Abbildung 1B).
   3. Gibt alle Mäuse in ihre Käfige, wenn sie von den rotierenden Dübel gefallen und lassen Sie sie für 10 Minuten mit Zugang zu Nahrung und Wasser ausruhen.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 bis 2.2.3 zu insgesamt 8 Studien dafür, dass zu reinigen vervollständigendie Dübel, Gassen, und Landeplattformen der Rotarod für Urin und Kot, und bewegen Sie die Podeste zurück in seine Ausgangsposition betwen jedem Versuch.
      Hinweis: Die ersten 3-5 Versuche sind als Trainings Studien verwendet, damit die Mäuse, um sich mit der Aufgabe vertraut zu machen. Die Zeit fallen, ging Abstand und Enddrehzahl des Dübels zum Zeitpunkt des Falles für jeden nachfolgenden Versuch wird für die spätere Analyse (Fig. 2) aufgezeichnet.
3. Folgen Sie den Schritten 2.3.1 bis zur Festdrehzahl Rotarod Test 2.3.8:
   1. Legen Sie eine Maus auf einem Dübel für 5 Minuten, damit es zu dem Rotarod akklimatisieren. Bringen Sie die Maus wieder in seinen Käfig.
   2. Videoaufnahme starten Sie die Kamera ein und drücken Sie Start auf dem Rotarod. Dann legen Sie die Maus auf der rotierenden Dübel sicherstellen, dass er die Rückseite des Rotarod Gesichter.
   3. Stoppen Sie die Videoaufzeichnung auf der Kamera, wenn die Maus fällt von den drehenden Dübel und kehren Sie die Maus auf ihre Käfige für 10 min mit Zugang zu Nahrung und Wasser.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2 und 2.3.3 bis insgesamt acht Studien erworben und achten Sie auf die Dübel, Gassen, und Landeplattformen der Rotarod für Kot und Urin zu reinigen, und bewegen Sie die Podeste wieder in seine Ausgangsposition zwischen jedem Versuch .
   5. Schalten Sie die angefertigten Rotator bei 3 Hz für 20 Sekunden, damit sich die Mäuse, um sich mit dem Klang vertraut. Stoppen Sie den Rotator nach 20 sec durch Abschalten der Bohrer und legen die Hände auf beiden Seiten des Laufrades, um es von weiter vorbei an der ersten 20 sec drehen stoppen.
      Hinweis: Der Rotor selbst besteht aus einem Nagetier Laufrad zu einem Bohrgerät (3A) befestigt ist. In der Mitte des Laufrades ist eine kleine Kammer mit einem Gitterdeckel, wo die Maus befindet (Abbildung 3B). Der Rotor dreht sich in einer Richtung entgegen dem Uhrzeigersinn um die vertikale Achse. Die Größe des Reizes steht im Einklang mit früheren Studien, die zeigen, Dreh Stimulationen von 0,2 bis 3 Hz sind ausreichend, um Generaß VOR und VCR Antworten ^4,11,12.
   6. Platzieren Sie die Maus in der Kammer in der Mitte des Dreh und ersetzen Sie den Deckel.
   7. Schalten Sie den Rotator auf den niedrigsten Wert von 3 Hz für 20 Sekunden. Starten Sie die Rotarod und beginnen Videoaufzeichnung der Kamera während dieser Zeit in der Vorbereitung für den nächsten Versuch. Abschalten des Bohrers am Ende der 20 Sekunden und Händen an beiden Seiten des Laufrades, um es von nicht mehr dreht. Wiederholen Sie den Test mit der Maus auf dem Rotarod unmittelbar nach durch so schnell wie möglich der Übertragung auf dem rotierenden Dübel.
   8. Stoppen Sie die Videoaufzeichnung auf der Kamera, wenn die Maus fällt vom Dübel-und Rück die Maus, um seinem Käfig.
4. Der zylindrische Dübel, Gassen und Metalllandeplattformen der Rotarod mit 70% Ethanol, wenn alle Mäuse wurden getestet Reinigen Sie die durchsichtige Kunststoffplatten mit einem milden Reinigungsmittel / Wasser-Gemisch und.

3. Schwebebalken mit Vestibular Herausforderung

1. Die ba SetLanze Strahlvorrichtung, wie in Fig. 4A zu sehen.
   Hinweis: Die Waage Strahlgerät wurde aus einem in Carter et al Gerät angepasst (2001) ^13.. Für diesen Test gehen Mäuse aus dem unteren Ende des Balkens, die 52,5 cm über dem Boden ist, auf einem abgedunkelten Ziel-Box (13 x 22 cm, mit einer 5 x 6 cm Tür) 60 cm über dem Boden liegt (Abbildung 4A ). Mäuse natürlich suchen die Dunkelheit und den Schutz der Ziel-Box für den Balken und werden weiter gefördert, um den Strahl durch die leichte Neigung, die ihren natürlichen Fluchtmechanismus in einer Richtung nach oben laufen ¹⁴ nutzt zu durchqueren. Der Strahl selbst ist 1 m lang und hat einen kreisförmigen Querschnitt mit einem Durchmesser von 14 mm. Ein maßgeschneidertes Angebot an Strahldurchmessern verwendet werden, die der Experimentator, um die Empfindlichkeit des Tests einstellen oder größere Themen aufnehmen kann. Am unteren Ende des Waagebalkens eine weiße Linie zeigt die Startlinie. Eine andere Linie wurdegezogen 60 cm von der Startlinie am oberen Ende des Balkens, die Ziellinie (Abbildung 4A) anzuzeigen.
   1. Position 2 Kameras, eine auf jeder Seite der Schwebebalken, am unteren Ende des Waagebalkens (4B).
      Hinweis: Diese Kameras sollten angewinkelt, die gesamte Länge des Waagebalkens zu erfassen und sicherzustellen, dass Start und Ziel auf dem Schwebebalken markiert sind deutlich sichtbar. Diese Kameras werden, um Video-Aufzeichnung verwendet werden, die das Verhalten von Mäusen, wie sie den Schwebebalken zu durchqueren, mit daraus resultierenden Videos, die für die spätere Analyse verwendet.
   2. Linie der Boden des Ziel-Box mit Papiertuch, um eine einfache Reinigung von Urin und Kot nach Prüfung jeder Maus zu aktivieren, und legen Sie das Gehäuse von der Kuppel Themen Käfig innerhalb des Ziel-Box.
   3. Legen Sie ausreichend Schaum oder anderen Polstermaterial unter der erhöhten Strahlen um alle Themen, die aus dem Gerät fallen zu schützen. Mäuse, die fallen sofort durch das Experiment abgeholt werdener und innerhalb der Ziel-Box platziert, um auszuruhen.
2. Legen Sie eine Maus in die Ziel-Box für 2 Minuten, so dass es mit dieser Umgebung vertraut wird. Decken Sie die Öffnung zu dem Ziel-Box mit einer behandschuhten Hand für 5 Sekunden, wenn die Maus versucht, während dieser Zeit, dieses Verhalten zu entmutigen auf den Balken gehen.
3. Trainieren Sie mit der Maus, indem sie auf den Strahl direkt vor der Öffnung zum Ziel Feld und ermöglicht es, in das Ziel Feld gehen. Fahren Sie mit der Maus, indem Sie es auf dem Balken zunehmend weiter aus dem Strafraum Feld trainieren, bis die Maus ist in der Lage, von der Startlinie zum Ziel Feld ohne Hilfe und minimale Zögern gehen. Lassen Sie die Maus, um in das Ziel-Box für 1 min nach jeder Fahrt ausruhen.
4. Testen Sie den Maus beim Training abgeschlossen ist.
   1. Starten Sie Videoaufzeichnung auf Kameras.
   2. Die Maus an der Startlinie des Strahls und zu warten, während es durchquert der Strahl in Richtung des Ziel-Box.
   3. Stoppen Sie die Videoaufnahme auf ca.meras, wenn die Maus erreicht die Box.
   4. Lassen Sie die Maus, um in das Ziel-Box für 1 min ruhen. Entfernen Sie alle Urin oder Kot, die während des Prozesses abgeschieden wurde, während gewartet haben kann.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 bis 3.4.4, bis insgesamt 5 Versuche abgeschlossen sind.
5. Schalten Sie die angefertigten Rotator bei 3 Hz für 20 Sekunden (wie in der Festdrehzahl Rotarod Test), um die Mäuse zu werden mit dem Klang vertraut. Stoppen Sie den Rotator nach 20 sec durch Abschalten der Bohrer und legen die Hände auf beiden Seiten des Laufrades, um es von Spinnen zu stoppen.
6. Platzieren Sie die Maus in der Kammer in der Mitte des Dreh und ersetzen Sie den Deckel.
7. Schalten Sie den Rotator auf den niedrigsten Wert von 3 Hz für 20 Sekunden. Starten Sie Videoaufzeichnung auf den Kameras in dieser Zeit, in Vorbereitung für den bevorstehenden Prozess. Schalten Sie den Bohrer am Ende der 20 Sekunden und legen Sie die Hände auf beiden Seiten des Laufrades, um es von weiter vorbei an den ersten 20 sec drehen stoppen. Transfer die Maus an den Anfang des Waagebalkens so schnell wie möglich, und warten Sie, während die Maus durchläuft der Strahl auf das Ziel ein.
8. Stoppen Sie die Videoaufzeichnung auf Kameras, wenn die Maus das Ziel erreicht Feld und gibt die Maus in seinen Käfig.
9. Reinigen Sie das Gerät Schwebebalken mit 70% Ethanol und ändern Sie das Papiertuch in das Ziel Feld nach jeder Maus getestet.

Ergebnisse

Rotarod

Die Motorleistung von Mäusen wurde als Time To Fall (TTF) für jede Maus über 8 Versuche aufgezeichnet beschrieben. Unter Verwendung dieser Messungen der TTF können Trainingskurven für jede Maus aufgetragen werden. Fig. 2 zeigt Beispiele für die Motorleistung one 1 Monate alten Maus und eine 9-Monate alten Maus über den Verlauf von 8 Versuchen. Diese Ausbildungs ​​Kurven zeigen einen Anstieg der TTF in den ersten 3-5 Versuchen gefolgt von einer anschließenden...

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass es einfach ist, Mäusen sowohl auf dem Rotarod und Balance-Strahlvorrichtung und als Folge Übertraining kann die Akquisition der Messgenauigkeit anspruchs ¹⁵ sein. Zum Beispiel, Übertraining auf der Rotarod können, um Mäuse absichtlich springen die Dübel sowohl während der Eingewöhnung und Probezeiten auf die führen, während Übertraining auf dem Schwebebalken können zu häufigeren Stoppen (Erkundungsverh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotarod	IITC Life Science Inc.	#755	"Rat dowels" = 70 mm diameter. Do not allow ethanol to contact perspex.
iPhone	Apple		Can use any type of camera. Velcro fixed to the back surface for attachment to the the 3D articulated arm.
3D articulated arm	Fisso/Baitella	Classic 3300-28	Any type of stable vertical stand would be adequate. Velcro is fixed to the apical end of the arm for iPhone attachment.
Wooden walking beam: 1 m long strip of smooth wood with a circular cross-section of 14 mm diameter			A range of diameters and cross section shapes can be used to suit experimental parameters
Wooden goal box (130 x 140 x 220 mm) made from 11 mm thick boards
Support stand made of 41 x 41 mm beams: 2 vertical beams 525 and 590 mm from ground at the start and goal ends respectively; 803 mm horizontal beam that runs along the ground directly under the walking beam; two 20 mm long beams act as "feet", joining the horizontal and vertical beams at each end; a 21 x 21 x 36 mm block hewn at the apical end of the "starting" vertical beam; a 13 x 13 mm aperture cut out of the center of this block, forming a tunnel which runs perpendicular to the walking beam.			Brace all joins with small steel brackets.
Black paint (water based)	Handycan	Acrylic Matt Black	2-3 coats for all wooden surfaces of the balance beam apparatus
Clear finish	Wattle Estapol	Polyurethane Matt	Single coat for all beams. Double coat for all other surfaces of the balance beam apparatus
Foam, packaging material			To cushion any falls from the balance beam
70% Ethanol, paper towels			Clean beam and goal box between each animal.
Gauze pads/paper towels			To line the floor of the goal box
Mouse house (from home cage)