Поведенческая оценка старения Mouse вестибулярной системы

Резюме

Плата управления двигателем и баланс производительности, как известно, ухудшаться с возрастом. Эта статья представляет собой ряд стандартных неинвазивных поведенческих тестов с добавлением простого поворотного стимул, чтобы бросить вызов вестибулярной системы и показать изменения в производительности баланса в мышиной модели старения.

Аннотация

Возраст связанных снижение производительности баланса связано с ухудшением мышечной силы, координации движений и вестибулярной функции. Хотя ряд исследований показывают изменения в фенотипа баланса с возрастом у грызунов, очень немногие изолировать вестибулярный вклад, чтобы сбалансировать соответствии либо нормальных условиях или во время старения. Мы используем два стандартных поведенческих тестов, чтобы характеризующие выполнение баланса мышей в определенных точках возрастных течение жизни: Тест rotarod и тестовые склонны бревне. Важно однако, обычай построен ротатор также используется, чтобы стимулировать вестибулярный аппарат мышей (без вызывая явных признаков укачивания). Эти два испытания были использованы, чтобы показать, что изменения в производительности вестибулярному опосредованной баланса присутствуют над мышиной жизни. Предварительные результаты показывают, что и тест rotarod и испытание на изменение бревне может быть использован для выявления изменений в производительности баланса в процессе старения в качестве альтернативы более difficULT и инвазивные методы, такие как вестибулоокулярных (VOR) измерений.

Введение

Наше чувство баланса, пожалуй, один из самых недооцененных еще важных компонентов даже самых элементарных деятельности автотранспортных том числе ходьба и поворота. Баланс зависит от многих факторов, включая мышечной силы, координации движений и вестибулярной функции, и это только в присутствии вестибулярных невропатии или во время нормального старения, что важность полностью функционирующей системы баланса ценится. Нарушения в вестибулярной системы часто связаны с опытом головокружение или головокружение и нарушение равновесия приводит к повышенному риску падений и последующих травм ^1. Это особенно важно в пожилого населения, где падает являются одним из ведущих причин травм ^2.

Вестибулярные функциональные тесты, как правило, основаны на вестибулярных рефлексов, в частности, вестибулоокулярного (VOR) или вестибулоокулярного collic рефлекса (VCR). VOR и видеомагнитофон имеют важное значение для стабилизации изображений насетчатка и глава положение во время движения головы и тела соответственно. Как правило, измерения VOR требуют инвазивной имплантации поисковых катушек для измерения движения глаз или видео отслеживание движения глаз ^3. Это является сложной задачей у мышей из-за небольшого характера глаза мыши и трудности в обнаружении зрачок для видеоанализа ^3. В качестве альтернативы, видеомагнитофон был использован для измерения стабилизации головки в ответ на движения тела у мышей без необходимости инвазивной хирургии ^4. Несмотря на это, несколько исследований сосредоточиться именно на том, как вестибулярный аппарат выполняет в целом и, что более важно, как она меняется в процессе старения.

Для оценки общей производительности баланса просто и неинвазивным мы изменили два часто используемых поведенческие тесты. Испытания баланс света rotarod и наклонных оценки различных аспектов работы двигателя на грызунах и в предыдущих исследованиях были использованы в тестовом батареи приобрести полныйПрофиль возможности двигателя. Эта возможность может быть затронута в результате заболевания или генетической модификации, а также чувствительны к процессам, связанным с нормальным развитием и старением ^5-7. Ранее работа с использованием rotarod показал, что координация движений у мышей снижается после 3 месяцев ⁸ лет. Кроме того, крысы показать дефицит заметные баланса с увеличением возраста на тесте на бревне ^9.

Эта статья описывает использование rotarod и бревне испытаний в сочетании с вестибулярной стимул для того, чтобы бросить вызов вестибулярный аппарат и охарактеризовать последующее влияние на производительность баланса у молодых и старых мышей. В то время как простые и неинвазивные методы, описанные не предназначены в качестве самостоятельных мер периферической вестибулярной функции, они обеспечивают полезную и простую поведенческую меру для сравнения клеточных и субклеточных изменений на нескольких этапах вестибулярного обработки во время нормального старения у мышей.

протокол

1. Животные

1. Мыши (C57/BL6) из возрастов 1, 9 и 13 месяцев старых были получены из ресурсного центра животных (Перт, Австралия). Эти мыши были размещены в стандартных клетках мыши в Bosch грызунов фонда в Университете Сиднея на 12/12 ч цикле свет / темнота с доступом к пище и воде. Процедуры, изложенные ниже, были одобрены Университета Комитета Сиднее животных этике.
2. Принесите клетки мыши в комнату тестирования перед каждым испытанием в течение 10 мин, чтобы позволить мышей, чтобы акклиматизироваться к среде тестирования.

2. Rotarod

1. Настройте rotarod аппарат (рис. 1А):
   1. Установите дюбели в каждой полосе от rotarod.
      Примечание: В этом случае крысы дюбелей (70 мм в диаметре) используются вместо дюбелей мыши (32 мм в диаметре), чтобы препятствовать мышей от цепляясь за дюбель и выполнение «пассивных оборотов" ^10.
   2. Постулироватьион магнитные посадочные платформы на проводе, расположенной в нижней части каждой полосы движения на rotarod убедившись, что они не наклоняя коснуться пола из rotarod и размещаются как можно ближе к магнитному правой стене каждой дорожке, не касаясь.
      Примечание: Во время тестирования мышей rotarod обязаны ходить в прямом направлении, чтобы остаться на вращающихся и ускоряющих дюбелей. Когда мышь уже не в состоянии оставаться на дюбель, они не падают и вытесняют посадочной платформы, которые впоследствии активирует магнитный датчик. Время, необходимое для падают с вращающейся дюбель, дюбель оборотов в минуту при времени падения и пройденное расстояние, автоматически вычисляется для каждой мыши и записал на экране дисплея в передней части rotarod.
   3. Слайд 2 прозрачные пластиковые панели в передней части каждого rotarod полосу с более коротких панелей в нижней и длинных панелей выше.
   4. Входной тест параметров с помощью клавиатуры, расположенный в передней части rotarod. Следуйте STEPS 2.1.4.1 для 2.1.4.6 для ускоряющих параметров тестирования rotarod и шаги 2.1.4.7 на 2.1.4.12 для фиксированных скоростных параметров тестирования rotarod.
      1. Установить максимальную продолжительность испытания до 60 сек.
      2. Установите количество полос движения, который будет использоваться (или количество мышей, которые будут проверял).
      3. Установите начальную скорость теста до 5 оборотов в минуту.
      4. Установите максимальную скорость испытания до 44 оборотов в минуту.
      5. Установите скорость разгона теста до 60 сек.
      6. Установить размер дюбелей выбранных и направление вращения на крыс дюбелей, вращающихся в прямом направлении.
      7. Установить максимальную продолжительность испытания до 240 сек.
      8. Установите количество полос, которые будут использоваться до 1, как мыши тестируются индивидуально.
      9. Установите начальную скорость теста до 15 оборотов в минуту.
      10. Установите максимальную скорость испытания до 15 оборотов в минуту.
      11. Установите скорость разгона теста до 0 сек.
      12. Установить размер дюбеля выбранной и направление вращения, чтобы крысы дюбель, вращающейся в forwaй направление.
          Примечание: Вышеуказанные параметры могут быть изменены, чтобы удовлетворить потребности различных экспериментов.
   5. Наведите камеру в передней части rotarod для испытания с фиксированной скоростью rotarod, так что поведение мыши во время испытаний могут быть записаны и видео для последующего анализа, чтобы определить продолжительность времени мыши смогли остаться на rotarod.
2. Выполните шаги 2.2.1 для 2.2.4 для испытания ускоряющей rotarod:
   1. Положите одну мышь на каждом стационарном дюбель в течение 5 мин, чтобы позволить мышей, чтобы акклиматизироваться к rotarod.
   2. Аккуратно подтолкнуть мышей лицом к задней части rotarod и начать тест rotarod когда все субъекты сталкиваются в этом направлении (см. рисунок 1В).
   3. Верните все мышей в их клетки, когда они упали с вращающимися дюбелей и оставить их на отдых в течение 10 мин с доступом к пище и воде.
   4. Повторите шаги 2.2.1 по 2.2.3 для завершения в общей сложности 8 испытаний, убедившись, чтобы убратьдюбели, переулки, и посадочные платформы на rotarod для мочи и кала, и двигаться посадочные платформы обратно в исходное положение Betwen каждом испытании.
      Примечание: Первые 3-5 испытания используются в качестве учебных испытаний, чтобы позволить мыши, чтобы ознакомиться с этой задачей. Время падать, расстояние шли и конец частота вращения дюбель в момент падения для каждого последующего судебного разбирательства записывается для последующего анализа (рис. 2).
3. Выполните шаги 2.3.1 для 2.3.8 для испытания фиксированной скорости rotarod:
   1. Положите одну мышь на дюбель в течение 5 мин, чтобы позволить ему акклиматизироваться к rotarod. Вернуться мышь обратно в клетку.
   2. Начало видеозаписи на камере и нажмите начала на rotarod. Затем поместите курсор на вращающемся дюбель обеспечения она сталкивается заднюю часть rotarod.
   3. Остановить запись видео на камеру, когда мышь падает от вращающихся дюбелей, и вернуться мышь, чтобы ее клетках в течение 10 мин с доступом к пище и воде.
   4. Повторите шаги 2.3.2 и 2.3.3, пока в общей сложности 8 исследований не приобретается и обязательно очистить дюбели, переулки и целевых платформ в rotarod для кала и мочи, и двигаться посадочные платформы обратно в исходное положение между каждом испытании .
   5. Включите индивидуальному заказу ротатора на 3 Гц в течение 20 сек, чтобы позволить мыши, чтобы ознакомиться со звуком. Остановите ротатор через 20 сек, отключив дрель и поместите руки на обе стороны от ходового колеса, чтобы остановить его от продолжения вращаться после начальной 20 сек.
      Примечание: Сам ротатор состоит из бегущей грызунов колеса, прикрепленного к буровой (рис. 3А). В центре ходового колеса небольшой камере с крышкой сетки, где мышь помещают (фиг.3В). Ротатор вращается в направлении против часовой стрелки вокруг вертикальной оси. Величина стимула в соответствии с предыдущими исследованиями, которые показывают поворотные стимуляции, начиная от 0,2 до 3 Гц достаточно, создалоели VOR и видеомагнитофон ответы ^4,11,12.
   6. Место мыши внутри камеры в центре поворотного устройства и заменить крышку.
   7. Включите ротатора на минимальное значение 3 Гц в течение 20 сек. Запустите rotarod и начать запись видео на камеру в это время в рамках подготовки к предстоящему суду. Выключите дрель в конце 20 сек и поместите руки на обе стороны от ходового колеса, чтобы остановить его от прядения. Retest мышью на rotarod сразу после передав его как можно быстрее с вращающимся дюбель.
   8. Остановить запись видео на камеру, когда мышь падает с дюбель и вернуть мышь в клетку.
4. Очистите прозрачные пластиковые панели с мягким моющим средством / смеси воды и цилиндрические штифты, переулки и металлические посадочные платформы на rotarod с 70% этанола, когда все мыши были испытаны.

3. Бревно с вестибулярной вызов

1. Настройте баАппарат луч копье, как показано на рисунке 4A.
   Примечание: Устройство бревне была адаптирована из аппарата, описанного в Картер и др. (2001) ^13.. Для этого теста мышей идти от нижнего конца пучка, который 52,5 см над землей, в затемненном поле цели (13 х 22 см, с дверной проем см 5 х 6), расположенный 60 см над поверхностью земли (фиг. 4А ). Мыши естественно искать тьму и защиту коробки цели в пользу воздействию света и также рекомендуется пройти луч на небольшой наклонной поверхности, которая эксплуатирует их естественный механизм выхода для работы в направлении вверх ^14. Сам луч 1 м в длину и имеет круглое поперечное сечение с диаметром 14 мм. С учетом диапазон диаметров пучка можно использовать которая позволяет экспериментатор, чтобы отрегулировать чувствительность теста или размещения больших объектов. На нижнем конце бревне белый линия указывает начальную строку. Другая линия былаобращается 60 см от линии старта на более высоком конце пучка для указания финиша (рис. 4А).
   1. Позиция 2 камеры, по одной на каждой стороне бревне, на нижнем конце бревне (фиг.4В).
      Примечание: Эти камеры должны быть расположены под углом, чтобы захватить всю длину бревне и обеспечить старта и финиша линии, отмеченные на бревне, четко видны. Эти камеры будут использоваться для записи видео поведение мышей, как они проходят бревне, с результатом видео используется для последующего анализа.
   2. Линия пол в окне цели с бумажным полотенцем, чтобы позволить легкую очистку мочой и калом после тестирования каждой мышью и поместите жилья купол из субъектов дом клетке внутри коробки ворот.
   3. Наведите адекватную пену или другой прокладочным материалом под поднятым луча, чтобы защитить любые предметы, которые попадают из аппарата. Мыши, которые попадают будут подобраны немедленно экспериментаэ и помещены внутри коробки цели, чтобы отдохнуть.
2. Положите одну мышь в окне цели в течение 2 мин, чтобы она стала знаком с этой средой. Закройте отверстие в окне цели с рукой в ​​перчатке в течение 5 сек, если мышь пытается ходить на балку в течение этого времени, чтобы препятствовать такому поведению.
3. Поезд мышь, поместив его на балку в непосредственной близости от открытия в окне цели и позволяет ему ходить в поле цели. Продолжайте тренироваться мышь, поместив его на балку постепенно дальше от коробки ворот, пока мышь не в состоянии идти от линии старта к коробке цели, без помощи и минимальным колебанием. Оставьте мышь, чтобы отдохнуть в коробке цели в течение 1 мин после каждого запуска.
4. Начать тестирование мышь, когда обучение закончено.
   1. Начало видеозаписи на камерах.
   2. Наведите мышь на стартовой линии пучка и ждать, пока он проходит луч в направлении коробки ворот.
   3. Остановить запись видео на окMeras когда мышь достигает коробку.
   4. Оставьте мышь, чтобы отдохнуть в коробке цели в течение 1 мин. Удалите мочи или кала, которые могут быть осажденный во время пробы во время ожидания.
   5. Повторите шаги 3.4.1 до 3.4.4, пока в общей сложности 5 исследований не были завершены.
5. Включите индивидуальному заказу ротатора на 3 Гц в течение 20 сек (как в тесте rotarod фиксированной скоростью), что позволяет мыши, чтобы ознакомиться со звуком. Остановите ротатор через 20 сек, отключив дрель и поместите руки на обе стороны от ходового колеса, чтобы остановить его от прядения.
6. Место мыши внутри камеры в центре поворотного устройства и заменить крышку.
7. Включите ротатора на минимальное значение 3 Гц в течение 20 сек. Начало видеозаписи на фотоаппаратах в это время, в рамках подготовки к предстоящему суду. Выключить сверло в конце 20-сек и поместите руки на обе стороны от ходового колеса, чтобы остановить его от продолжает вращаться после начальной 20 сек. Тransfer мышь к началу бревне как можно быстрее и ждать, пока мышь пересекает луч в окне цели.
8. Остановить запись видео на камерах, когда мышь достигает коробку цели и вернуться мышь в клетку.
9. Для очистки устройства бревне с 70% этанола и изменить бумажное полотенце в коробке ворот после каждой мыши была испытана.

Результаты

Rotarod

Двигательная активность мышей был описан как время влюбляться (TTF), записанного для каждой мыши в течение 8 испытаний. Используя эти измерения TTF, учебные кривые для каждой мыши могут быть построены. Рисунок 2 показывает примеры двигательной одного 1 месячного ...

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Предыдущая работа показала, что это легко перетренироваться мышей как на rotarod и устройства бревне и, как следствие, приобретение точных измерений может быть сложным ^15. Например, перетренированности на rotarod может привести к мышей н...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotarod	IITC Life Science Inc.	#755	"Rat dowels" = 70 mm diameter. Do not allow ethanol to contact perspex.
iPhone	Apple		Can use any type of camera. Velcro fixed to the back surface for attachment to the the 3D articulated arm.
3D articulated arm	Fisso/Baitella	Classic 3300-28	Any type of stable vertical stand would be adequate. Velcro is fixed to the apical end of the arm for iPhone attachment.
Wooden walking beam: 1 m long strip of smooth wood with a circular cross-section of 14 mm diameter			A range of diameters and cross section shapes can be used to suit experimental parameters
Wooden goal box (130 x 140 x 220 mm) made from 11 mm thick boards
Support stand made of 41 x 41 mm beams: 2 vertical beams 525 and 590 mm from ground at the start and goal ends respectively; 803 mm horizontal beam that runs along the ground directly under the walking beam; two 20 mm long beams act as "feet", joining the horizontal and vertical beams at each end; a 21 x 21 x 36 mm block hewn at the apical end of the "starting" vertical beam; a 13 x 13 mm aperture cut out of the center of this block, forming a tunnel which runs perpendicular to the walking beam.			Brace all joins with small steel brackets.
Black paint (water based)	Handycan	Acrylic Matt Black	2-3 coats for all wooden surfaces of the balance beam apparatus
Clear finish	Wattle Estapol	Polyurethane Matt	Single coat for all beams. Double coat for all other surfaces of the balance beam apparatus
Foam, packaging material			To cushion any falls from the balance beam
70% Ethanol, paper towels			Clean beam and goal box between each animal.
Gauze pads/paper towels			To line the floor of the goal box
Mouse house (from home cage)