تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

Summary

الكلى الكبار الزرد هو نظام ممتاز للتجديد وأمراض الكلى الدراسات. جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول عدة المنهجيات التي يمكن تنفيذها لتقييم تكوين كليون أنبوب صغير وتقييم استيعاب الكلوي.

Abstract

وقد برز نموذج الزرد كنظام ذات الصلة لدراسة تطوير الكلى، وتجديد والمرض. كلا تتكون الكلى الزرد الجنينية والكبار من الوحدات الوظيفية المعروفة باسم النيفرون، والتي يتم حفظها للغاية مع الفقاريات الأخرى، بما في ذلك الثدييات. وقد أظهرت الأبحاث في الزرد مؤخرا أن اثنين من الظواهر المميزة ارشح بعد النيفرون الكبار تكبد الضرر: أولا، هناك تجديد قوي داخل النيفرون القائمة التي تحل محل الخلايا الظهارية أنبوب صغير تدميرها؛ الثانية، يتم إنتاج النيفرون جديدة كليا من الأسلاف الكلى في عملية تعرف باسم neonephrogenesis. في المقابل، البشر والثدييات الأخرى يبدو أن لديها سوى قدرة محدودة لكليون الظهارية التجدد. حتى الآن، الآليات المسؤولة عن هذه الظواهر تجديد الكلى لا تزال ضعيفة مفهومة. منذ الكلى الزرد الكبار على حد سواء الخضوع كليون الظهارية تجديد وneonephrogenesis، أنها توفر الفقرة التجريبية المتميزةdigm لدراسة هذه الأحداث. وعلاوة على ذلك، هناك مجموعة واسعة من الأدوات الوراثية والدوائية المتوفرة في نموذج الزرد التي يمكن استخدامها لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم تجديد الكلوي. واحد جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول مجموعة من تقنيات وضع العلامات التي يمكن استخدامها لقياس وظائف الكلى تكوين اختبار نفرون في الكلى الزرد الكبار. وهكذا، وهذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع على توصيف المظهري المستقبل الزرد نماذج الكبار إصابة الكلى، والتي تشمل ولكن لا تقتصر على الأنظمة التعرض nephrotoxicant أو الأساليب الوراثية لموت الخلايا المستهدفة مثل nitroreductase بوساطة تقنية الاجتثاث الخلية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الأساليب لدراسة الاضطرابات الوراثية في تشكيل الكلى الكبار ويمكن أن تطبق أيضا على تقييم الوضع الكلوي خلال النمذجة المرض المزمن.

Introduction

الكلى هو الجهاز المعقد الذي يحقق العديد من الوظائف الفسيولوجية في الجسم. أهم وظيفة الكلى هي إفراز النفايات الأيضية، وتتشابك هذه المهمة بشكل وثيق مع الحفاظ على توازن السوائل. الكلى يؤدي هذه الوظائف من خلال تصفية الدم وتشكيل البول، في حين تنظم بالتزامن ضغط الدم، ومستويات المنحل بالكهرباء، والتوازن الحمضي القاعدي. الأنابيب الظهارية درجة عالية من التخصص ودعا النيفرون بمثابة وحدة وظيفية أساسية في الكلى ^1،2. في الفقاريات الكبار، ويتم تنظيم النيفرون عادة في ترتيب ملفوف بإحكام المحيطة بها نظام الصرف الصحي المركزي، مما يسمح لكثير من الأنابيب لحزمة إلى الجهاز صغير إلى حد ما. على سبيل المثال، يمكن أن تحتوي كل كلية البشري أكثر من 1 مليون النيفرون ^3. الثدييات الأخرى مثل الماوس تمتلك بناء على أمر من 8-10000 النيفرون في الكلى ^4. درجة التعقيد الكلوي تختلف بين هذه الثدييات وغيرها من نبات أخضرebrates بسبب الاختلافات في إجمالي عدد كليون والتصميم المعماري في غضون الكلى. أنواع الفقاريات تشكل ما يصل الى ثلاثة هياكل الكلى المتعاقبة خلال التنمية، ويعرض كل شكل زيادة التعقيد فيما يتعلق الوقف كليون وترتيب: للسليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية. هيكل الكلوي الماضي ليتم الاحتفاظ بمثابة الكلى الكبار الجهاز، عادة mesonephros أو الكلوة التالية ^2. كل شكل الكلى، ولكن لديه تكوين القائم على كليون ^2.

النيفرون هو العمود الفقري في الكلى وهو المسؤول عن ترشيح الدم جنبا إلى جنب مع إفراز الأيض واستيعابهم. النيفرون هي هياكل أنبوبية بسيطة تتألف من الخلايا الظهارية ولها تنظيم المجزأ، التي المنفصلة، ​​مجالات متخصصة للغاية من ظهائر متباينة أداء مهام محددة. في ترتيب تدفق الترشيح من خلال كليون، هناك عادة ثلاثة أجزاء رئيسية comprisالبريد لكل وحدة: (1) كرية الكلى، (2) مع أنبوب صغير القريبة والمتوسطة والبعيدة قطاعات، و (3) جمع القناة ^1. نبيب الداني هو المسؤول عن استيعاب من المواد المذابة العضوية، وأهمها الجلوكوز والأحماض الأمينية ^1. نبيب المتوسطة (أو حلقة من هنلي) هو موقع كبير من الملح والماء التنظيم ^1. أخيرا، صقل من الملح والأيونات الأخرى يحدث في نبيب القاصي وجمع القناة ويتم تنظيم كبير من قبل نظام الغدد الصماء ^1. من هناك، ويسافر الراشح من خلال الحالب والمثانة، والخروج في نهاية المطاف الجسم كمنتج النفايات ^1.

فقدان وظائف الكلى يمكن أن تنبع من العديد من الأسباب التي تمنع النشاط كليون العادي. يمكن أن تحدث هذه الأسباب أثناء التطور الكلى، مثل العيوب الخلقية التي تؤدي إلى تشوه من النيفرون ^5، أو لأسباب من أنواع مختلفة من الإصابة (النابعة من كلا الوراثية وenvironmeأصول ntal). تصنف على نطاق واسع الإصابات المكتسبة وإصابة حادة في الكلى وكالة (آكي) أو إصابة الكلى المزمن (CKD). AKI ينطوي على خسارة مفاجئة من وظيفة الكلى، غالبا ما ينتج عن نقص التروية أو السم التعرض ^6،7. في الثدييات، وإصلاح الظهارية كليون ممكن بعد مثل هذه الإصابات ^8، وكثير من الناس تظهر الاستعادة الكاملة من وظيفة الكلى بعد AKI. ومع ذلك، يرتبط AKI أيضا مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات التي تم الإبلاغ عنها عبر واسع 30 - 70٪ النطاق الإصابة ^6،7. CKD، في المقابل، ويرتبط مع الفقدان التدريجي لوظائف الكلى الناتج عن سنوات من الضرر لفترات طويلة، التي ترتبط عادة مع التليف ^8،9. وعلاوة على ذلك، يوجد تفاعل بين AKI وCKD، وإما يمكن لأحد أن يهيئ الفرد للآخرين ^10-12. على سبيل المثال، أولئك الذين عانوا من AKI هم أكثر عرضة للCKD وحتى الموت ^13. الإصابة بأمراض الكلى، سواء في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم، وقد بلغ epideومن المتوقع النسب وهيئة التصنيع العسكري في الارتفاع مع توسع-بالتالي السكان الذين تتراوح أعمارهم بين أن هناك حاجة متزايدة لتحديد التدخلات الطب التجديدي ^ل14،15 الكلى.

على الرغم من معرفة أن المرضى AKI يمكن استرداد، منذ فترة طويلة يعتقد أن الكلى هو الجهاز دون صلاحيات التجدد الفطرية. تم عرض هذه النظرة التقليدية المعدلة بشكل كبير في السنوات الأخيرة ^16. وقد أظهرت دراسات التحقيق الضرر الكلوي في الفئران والجرذان بعد AKI أن الخلايا الظهارية كليون أنبوب صغير يمكن أن تتكاثر وإعادة بناء النيفرون الوظيفية ^17-20. على الرغم من أن الثدييات تمتلك هذه القدرة على التكيف لتجديد النيفرون، وهناك قيود ملحوظة والاستجابات غير القادرة على التأقلم يمكن أن تسبب التي تؤدي إلى التليف الكلوي وCKD ^21. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أن تكرار الاجتثاث الخلايا الظهارية في النيفرون الفئران ارتبط تجديد تقلص والنيفرون، مما يشير إلى تليف الكلى هفعصام محدودة تجديد عتبة ^22. ليس هناك أدلة على أن البالغين الكلى الثدييات يشكل النيفرون جديدة لتحل محل تلك المفقودة أو التالفة، وبالتالي تدميرها يؤدي إلى عجز دائم ^8،9 كليون. ومن المثير للاهتمام، وبعض الفقاريات لا تستجيب لAKI بواسطة ظهائر تجديد كليون وأيضا إنتاج النيفرون الجديدة، المشار إليها باسم عملية neonephrogenesis أو كليون neogenesis ^23. Neonephrogenesis يحدث في الأسماك بعد التعرض للسموم أو بتر جزئي، وشملت نماذج إصابة تاريخيا ذهبية ^24،25، البلطي ^{26، 27} تزلج، الميداكا ^28، ومؤخرا، الزرد ^29،30. من هذه، الزرد تقدم نموذجا قابلا للتطبيق الأبحاث الجينية لاكتشاف مسارات الخلوية والجزيئية المسؤولة عن تجديد الكلوي.

في هذه المقالة الفيديو، ونحن لشرح كيفية تسمية قطاعات كليون في الزرد الكبار. علم التشريح كليون، وميزات الجزيئية،والخصائص الفنية ضرورية للدراسات المستقبلية الكلى ناجحة باستخدام الزرد. الكلى الزرد الكبار هو بنية mesonephros وبطبيعتها هي أقل تعقيدا من حيث عدد كليون وتنظيم من هيكل الكلوة التالية وجدت في الثدييات الكبار، avians، والزواحف ^31. ومع ذلك، الزرد تنظيم قطاع كليون يماثل إلى الثدييات، وثقت لأول مرة في الكلى الجنينية استنادا إلى دراسات التعبير الجيني ^31-35. النيفرون الجنين الزرد تحتوي على شرائح خطية نبيب التي تشمل نبيب الملتوية القريبة (PCT)، النبيبات الدانية على التوالي (PST)، البعيدة في وقت مبكر (DE)، والقاصي الراحل (DL) ^31-35 (الشكل 1). النيفرون الزرد الكبار تمتلك قطاعات أنبوبي مماثلة ^{30،31،36،37} (الشكل 1). كما يمكن التعرف على معاهدة التعاون بشأن البراءات من قبل النمط الظاهري وظيفية: سوف الخلايا الظهارية في المعاهدة تتضمن مركبات ديكستران fluorescently المسمى (10-70 كيلو دالتون في حجم) موجودة فيالتداول، التي استخدمت في كل من الجنينية والكبار الكلى الزرد لتقييم امتصاص التقامي بواسطة هذه الخلايا نبيب الداني ^38-41 (الشكل 1). فارق واحد في قطاعات كليون بين الزرد والثدييات هو أن الزرد تفتقر إلى أنبوب صغير وسيطة، أو حلقة من هنلي ^30-37. لأن هذا جزء ظائف في الثدييات للحفاظ على المياه، والزرد هي أنواع المياه العذبة دون حاجة ملحة للتركيز البول، فإنه ليس من المستغرب أن الزرد تفتقر هذه الشريحة ^32،33. وهكذا، فإن الحفاظ تكوين كليون العام إلى حد كبير بين الزرد والكلى الثدييات ^32،33. وقد مكنت هذه التشابهات الزرد أن يكون أداة بحث فعالة للتحقيق وظائف الجينات وأعرب الكلوي خلال التنموية ^32-35،42 تكون الكلية ونموذج العديد من أمراض الكلى ^43،44، مما يضيف إلى قائمة كبيرة من الشروط البشرية التي يمكن أن تكون التحقيق باستخدامالزرد ^45،46.

اليوم، الكلى الزرد الكبار هو نموذج جذاب للدراسات المقارنة للتجديد الكلوي بسبب قابلية الإستطراق لها الجيني والحنك توسيع الموارد التكنولوجية المتاحة لاستجواب وظيفة الجين ومسارات الإشارات في هذا النوع. وقد استخدمت العديد من الدراسات وmesonephros الزرد للتحقيق في آليات تجديد بعد AKI ^29،30،37. لمواصلة البحث AKI باستخدام الكلى الزرد الكبار، فمن الضروري أن يكون طرق رائعة لتسمية المناطق كليون مختلفة وأساليب لدراسة وظائف كليون. وقد تم تكييف عدة طرق للتحليل الكلى البالغين من بروتوكولات الكلى الجنينية. حقن داخل الصفاق من ديكستران fluorescently المسمى في الزرد الكبار تسميات ظهارة معاهدة التعاون بشأن البراءات في mesonephros النيفرون عبر الإلتقام ^30، كما في الأجنة الزرد ^38-41 (الشكل 1). وقد استخدم هذا الأسلوب لvisualizه عندما الأنابيب القريبة استعادة الممتلكات إمتصاص ثانية في أعقاب AKI، والتي تمكن من تقييم واحد استعادة وظيفة فسيولوجية ³⁰ (الشكل 1). ميزة أخرى من كليون نبيب الداني هي أن الخلايا الظهارية في هذا القطاع تمتلك الحدود فرشاة ³⁷ التي تظهر مستويات عالية من النشاط الذاتية الفوسفاتيز القلوية. وهكذا، فإن ظهارة القريبة يمكن أن تكون مترجمة بصريا في الكلى الكبار الزرد باستخدام تقنية القائم على مضان المعروفة باسم ELF- (انزيم المسمى الإسفار) ⁴⁷ -97.

هنا، نحن تصف كيفية تنفيذ المقايسات امتصاص الفلورسنت ديكستران ^30،48 في الكلى الكبار الزرد، وذلك للحصول على التقييم الوظيفي للنبيب الداني ورسم خريطة للحجم وملامح هذه الشريحة أنبوب صغير. المقبل، ونحن تصف التقنيات لتسمية المناطق نبيب القريبة من كليون الكبار مع الفلورسنت الفوسفاتيز القلوية التسمية. الثالث، وتبين لنا لأول مرة أن rhodأمين الموسومة كتين Dolichos biflorus راصة (DBA)، والتي تم استخدامها كعلامة العامة للمجاري جمع في الكلى الثدييات ^49، يصادف الأنابيب البعيدة للبالغين الكلى الزرد. كما DBA تبادلية لالفوسفاتيز القلوية تلطيخ، هذه التسميات توفر وسيلة للتمييز على نطاق واسع لعموم الداني مقابل تمتد لعموم البعيدة للكليون الكبار الزرد. من خلال تنفيذ هذه البقع الفلورية في كل من جبل بأكمله والمقاطع النسيجية ناظم البرد، فإننا ربط هذه التسميات مع مجالات التعبير عن الجينات نقل المذاب التي تنفرد بتحديد كل قطعة كليون. لذا يحتوي هذا البروتوكول أيضا دليل لإجراءات معالجة الأنسجة تعديل لأنسجة البالغين جبل بأكمله في الموقع التهجين (WISH) في التحليل القائم على موقعنا على الجنين بروتوكول WISH ^50. يمكن استخدام هذه الإجراءات في توليفات مختلفة (الشكل 2) لتوثيق الصفات المورفولوجية والوظيفية سو الكبار النيفرون الكلى الزرد. وبالتالي، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها على الدراسات تجديد، وتوصيف المظهري من غيرها من النماذج مرض الكلى، وحتى تستخدم لدراسة تشكيل الكلى الكبار.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات للعمل مع الزرد الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة نوتردام. ملاحظة: يتم توفير دليل على الكلى وكليون التشريح في الزرد (الشكل 1). وتقدم لمحة عامة عن منهجيات الموصوفة في هذا البروتوكول باعتباره الرسم البياني (الشكل 2) لتوضيح كيفية وضع العلامات إجراءات متعددة يمكن أن يؤديها على عينة الكلى نفسها. عن الجزء 7 على إعداد WISH للدراسات الكلى الكبار، الخطوات المتوفرة هنا تشير إلى كيفية تعديل معالجة الأجنة الزرد، كما نشرت مؤخرا ^50، لتوفير دليل تقني للتحليل WISH الناجح لجهاز الكلى.

1. اسماك الزرد الكبار حقن داخل الصفاق مع ديكستران الاهتمام

1. إعداد المطلوب fluorescently المسمى الأسهم ديكستران (ق) عن طريق إذابة مسحوق ديكستران في الماء المقطر بتركيزمن 50 ملغ / مل، ثم تخزين مأخوذة في أنابيب microcentrifuge في -20 درجة مئوية في الظلام. ملاحظة: هي مختلفة dextrans fluorescently المسمى المتاحة تجاريا. حدد ديكستران للاستخدام على أساس مزيج من العلامات الأخرى التي يتم المطلوب، والتأكد من المرشحات الفلورسنت المناسبة المتاحة مع المجاهر التي سيتم استخدامها. تظهر dextrans يسين مضان قابل للتثبيت دون أي خطوات أخرى في وضع العلامات عينات المعيشة، عينة الأنسجة غير المثبتة من العينات الموت الرحيم، والعينات الثابتة.
2. ذوبان الجليد السهم ديكستران المطلوبة وتخزينها على الجليد في الظلام أثناء أداء خطوات 1.3-1.5. التفاف أنبوب microcentrifuge في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء في حين المناولة.
3. لتخدير الزرد الكبار بين 5-7 أشهر في العمر عن طريق وضع السمك في طبق يحتوي إما 0.02٪ تريكين أو 0.001٪ 2-فينوكسييثانول لحوالي 1 - 2 دقيقة. ملاحظة: من الأفضل استخدام الزرد الكبار من هذه الفئة العمرية الأصغر سنا لأن السمك يمكن أن يكون SMAالكلى ليرة لبنانية التي يصعب تشريح، وعينات الكلى من الأسماك القديمة يمكن أن تحتوي الجماهير ندبا التي لا يمكن تحليلها. عندما تخدير بشكل صحيح، سوف الزرد الكبار لا يحمل استجابة للمس التحفيز، والتي يمكن اختبارها باستخدام ملعقة أو التحقيق حادة للمس بلطف الزعنفة الذيلية للأسماك.
4. باستخدام ملعقة بلاستيكية، ورفع الأسماك من الطبق، صب الحل ووضع بعناية الحيوان على قالب اسفنجة رطبة، بطني حتى الجانب.
5. باستخدام 31 G 1.0 سم مكعب حقنة الأنسولين، وضخ 20 ميكرولتر من محلول المخزون إذابة ديكستران في الفضاء داخل الصفاق. توجيه الإبرة بحيث يحدث الإدراج في زاوية الضحلة في خط الوسط بطني من البطن. لتجنب ثقب الأجهزة، وادخال الإبرة قليلا ثم رفعه وذلك لرفع جدار الجسم من الأسماك وخلق الفضاء الذي لحقن محلول ديكستران ^48. ملاحظة: بدلا من ذلك، والأوراق المالية ديكستران يمكن أن تضعف، على سبيل المثال، في نسبة 1: 2 أو 2: 1 (ديكستران: ديسحرث الماء)، للحد من مضان الخلفية في العينة.
6. العودة بلطف الأسماك إلى خزان للسماح التعافي من التخدير. ملاحظة: امتصاص ديكستران من قبل شريحة نبيب الداني يحدث خلال 8-12 ساعة ويمكن الكشف عن ما لا يقل عن مدة تصل إلى 3 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة). تحليل في 3 نقطة في البوصة يوفر إشارة قوية أنبوب صغير مع انخفاض مضان الخلفية في السكان انسجة الكلى. انتقل إلى الجزء 2 لفحص كله جبل امتصاص ديكستران وحده، إن لم يكن هو المطلوب وضع العلامات إضافية. لوصفها اندماجي، انتقل إلى الجزء 3 لإعداد الأنسجة لفحص كله جبل امتصاص ديكستران، ثم الجزء 4 إلى مزدوجة التسمية مع الفوسفاتيز القلوية و / أو الجزء 5، لأداء مزدوج أو ثلاثي DBA وضع العلامات. للبحث باستخدام المقاطع النسيجية، انتقل إلى الجزء 6 للحصول على تعليمات حول كيفية جعل أقسام غرامة في الكلى باستخدام ناظم البرد وكيفية هذه وصمة عار مع تسميات مختلفة و / أو المناعية مع antib الابتدائي والثانويodies.

2. تشريح وشقة جبل إعداد الكلى اسماك الزرد الكبار من عينة الحيوانات غير الثابتة لتصور الفلورية ديكستران صفها للالدانية الأنبوب الصغير

1. الموت ببطء الزرد الكبار حقن ديكستران عن طريق وضعها في طبق مع 0.2٪ تريكين درجة الحموضة 7.0 ل 4-5 دقيقة. ملاحظة: تأكد من أن الأسماك قد يصرح باستخدامها قبل المتابعة، من خلال مراقبة بعناية ما إذا كانت قد توقفت حركة الخياشيم والقلب توقف عن الخفقان ^36.
2. باستخدام ملعقة بلاستيكية، ورفع الأسماك من الحل تريكين، صب الحل ووضع الحيوان على نسيج أو منشفة ورقية.
3. استخدام زوج من مقص حاد تشريح لاجراء خفض راء الوصاد الخيشومية وإزالة الرأس.
4. على الفور فتح جسم السمكة مع مقص تشريح بجعل شق بطني طويلة من الرأس إلى قاعدة الزعنفة الذيلية.
5. إزالة الأعضاء الداخلية للأسماك باستخدام زوج من ملقط غرامة.
6. استخدام الإبر تشريح فائقة غرامة يعلقون فتح الجدران الجسم وذلك للسماح التصور للجهاز الكلى، وهو تمسكا الجدار الظهري للحيوان.
7. استخدام ملقط غرامة لفصل الكلى من الجدار الظهرية.
8. وضع برفق الكلى في زجاجة 5 مل قارورة تحتوي على 1X PBS ويغسل 3 مرات مع 3-5 مل من 1X PBS الطازجة لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: استخدام قارورة زجاجية لمعالجة عينات الكلى الكبار يسهل تصور الأنسجة ويسمح لغسيل مع كميات كبيرة (نسبة إلى كتلة الأنسجة) ما يقرب من 3-5 مل. بدلا من ذلك، يمكن استخدام 12 طبق جيدا ثقافة الخلية. بينما أنبوب microcentrifuge البلاستيك يمكن استخدامها، يمكن للأنابيب الحجم القياسي (1.5 مل) تقييد الغسيل.
9. إزالة الكلى مع الماصة نقل ومكان على شريحة زجاجية نظيفة مع 1-2 قطرات من 1X PBS.
10. استخدام ملقط غرامة لشد الكلى على الشريحة، والتأكد من الأنسجة لا تمت كرة لولبية أو غير ذلك انقلبتعلى نفسها. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام أداة سلك التنغستن بعمل شقوق صغيرة في النسيج الضام لتسهيل تحديد المواقع شقة في الكلى.
11. وضع قطع صغيرة من الصلصال في كل زاوية من 18 × 18 مم الزجاج ساترة وببطء تعيين ساترة على الكلى. ملاحظة: زاوية قليلا ساترة خلال التنسيب لتقليل احتباس فقاعات الهواء في الحل ^50. وديفوتس النمذجة الطين ما يقرب من 2 مليمتر في القطر (الشكل 2A). بدلا من ذلك، ديفوتس من الشحوم فراغ يمكن أن تكون بديلا بدلا من الصلصال. إضافة قطرة إضافية من 1X PBS لملء الفراغ بين ساترة والزجاج الشريحة إذا لزم الأمر.
12. مراقبة و / أو صورة الكلى عن طريق وضع شريحة زجاجية في مجال الرؤية على stereomicroscope أو مجمع المجهر مع المرشح المناسب. ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الشكل 2A للظهور العيانية إعداد هذه الشريحة.

3. FIXAنشوئها، تشريح، Permeabilization وإزالة التصبغ من الكلى اسماك الزرد الكبار

1. إعداد محلول مثبت الطازجة بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) / 1X PBS / 0.1٪ DMSO أو ذوبان الجليد قسامة المجمدة من 4٪ PFA / 1 X PBS وإضافة 0.1٪ DMSO. الحذر: PFA غير سامة ويجب التعامل حلول PFA في غطاء محرك السيارة الكيميائية في حين يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي التعامل مع مسحوق PFA مع الرعاية عندما جعل محلول المخزون.
2. ملء علبة تشريح مع ما يكفي من حل تثبيتي لغمر الحيوان بأكمله.
3. الموت ببطء وجبل الزرد مختارة في حل تثبيت (يرجى الرجوع إلى خطوات 2،2-2،6). ملاحظة: اختيار الأسماك يمكن أن يكون غير المعالجة عينة الكلى الزرد، أو الكلى معزولة من الزرد التي حصلت سابقا حقن ديكستران داخل الصفاق (الجزء 1).
4. إصلاح العينة O / N (12-16 ساعة) عند 4 ^{درجة مئوية.}
5. في اليوم التالي، استخدم ملقط غرامة لرعايةفصل تماما الكلى من جدار الجسم الظهرية ووضع الجهاز في قارورة زجاجية باستخدام الماصة نقل. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام 12 أو 24 بشكل جيد جيدا صحن الثقافة. بينما أنبوب microcentrifuge البلاستيك يمكن استخدامها، يمكن للأنابيب الحجم القياسي (1.5 مل) تقييد الغسيل.
6. غسل الكلى تشريح 3 مرات مع 3-5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
7. إزالة 1X PBS مع 0.05٪ توين وشطف الكلى مع 3 مل من محلول السكروز 5٪ (في 1X PBS) لمدة 30 دقيقة.
8. استبدال مع 3 مل من 30٪ محلول السكروز (في 1X PBS) وتخزين O / N (12-16 ساعة) عند 4 ^{درجة مئوية.} ملاحظة: حلول السكروز permeabilize الأغشية الخلوية، والسماح بعد ذلك وضع العلامات معين من الكواشف لأنها تخترق الأنسجة.
9. في اليوم التالي، وإزالة الحل السكروز 30٪ ويغسل الكلى 2 مرات مع 5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
10. استبدال 1X PBS مع 0.05٪ توين مع 3 -5 مل من محلول التبييض لإزالة تصبغ الصباغية الموجودة على الجهاز الكلى.
11. وضع قنينة الزجاج على محور دوار ومشاهدة بعناية كما يختفي تصبغ. ملاحظة: تصبغ عادة ما يستغرق حوالي 20 دقيقة عندما يقوم بعد العلاج السكروز، ولكن أحيانا يمكن أن يستغرق ما دام 60 دقيقة. إذا تم ترك حل تبييض على الكلى لفترة طويلة جدا، يمكن أن يحدث تفكك الجهاز. ينصح لمراقبة عينة كل 10-15 دقيقة للتحقق من سلامة الأنسجة.
12. عندما تمت إزالة تصبغ من الكلى، ويغسل مرتين مع 3-5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين.
13. استبدال 1X PBS مع 0.05٪ توين مع 3-5 مل من 4٪ PFA حل ل1 ساعة على RT.
14. إزالة 4٪ PFA حل ويغسل الكلى 3 مرات مع 3-5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: بمجرد اكتمال التثبيت، الكلى أيضا يمكن تركيبه على شريحة زجاجية وتقييمها لامتصاص بلا ديكستران في pigm الصباغيةentation، عن طريق تنفيذ خطوات 2،8-2،12.
15. إزالة 1X PBS مع 0.05٪ توين واستبدالها مع 3-5 مل من عرقلة الحل، ثم احتضان الكلى في RT في كتلة لمدة 2 ساعة.
16. عندما منع اكتمال انتقل مباشرة إلى بروتوكول تلطيخ المحدد. ملاحظة: يمكن الآن معالجة الكلى من خلال واحد أو أكثر من الإجراءات الأخرى من أجل إجراء دراسات وضع العلامات مع الكواشف المختلفة. لوصفها جبل كامل من النبيبات الدانية مع الفوسفاتيز القلوية الوحيد، انتقل إلى القسم 4. لوضع العلامات جبل كله فقط نبيب القاصي انتقل إلى قسم 5. بدلا من ذلك، أقسام 4 و 5 لا يمكن أن يؤديها في سلسلة متوالية خطية للكشف المزدوج في جبل بأكمله .

4. وسم الكلى الكبار قطاعات الدانية الأنبوب الصغير مع الفوسفاتيز القلوية الكشف

1. إزالة كتلة ويغسل الكلى 3 مرات مع 3-5 مل من 1X PBS مع 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم قم باستبدال 1X PBS مع 0.05٪ توين مع 3-5 ملمن 1X PBS. السماح الكلى ينقع لمدة 10 دقيقة على الأقل. ملاحظة: خلال هذا الوقت، نقل الكلى إلى 12 أو 24 بشكل جيد جيدا صحن الثقافة إذا تم إبقاء الأنسجة في قارورة زجاجية لخطوات المعالجة السابقة.
2. استبدال 1X PBS مع قلوية عمل حلا كافيا الركيزة الفوسفاتيز (راجع عدة الكشف الموجود في جدول المواد) لتغطية العينة، ثم ضع العينة على محور دوار لمدة 30 دقيقة في RT. الحفاظ على عينة محمية من الضوء.
3. وقف رد فعل من جانب غسل الكلى في حل القلوية غسل العازلة الفوسفاتيز.
4. شطف الكلى مع 3 تغييرات من حل العازلة على غسل 10-15 دقيقة. ملاحظة: بعد هذه الخطوة، انتقل مباشرة إلى الجزء 5، خطوة 5.1 (وبالتالي الاستغناء مؤقتا خطوات 4،5-4،6) إذا كان المطلوب أيضا وضع العلامات مع DBA. خطوة اختيارية: لتسمية وتصور نوى الخلايا في الجهاز، ونقع الكلى في محلول يوديد propidium. إعداد الأسهم يوديد propidium عن طريق إذابة مسحوق في concentraنشوئها من 1 ملغ / مل (1.5 ملم) في الماء المقطر. تمييع الأسهم إلى 500 نانومتر في 2X SSC واحتضان الكلية في هذا الحل لمدة 30 دقيقة. شطف مع 1X PBS، والشروع في الخطوة 4.5.
5. إزالة حل العازلة غسل الكلى وجبل على شريحة زجاجية نظيفة في المتوسطة المتزايدة الفوسفاتيز في الطقم وضع العلامات (راجع خطوات 2،9 حتي 2،12). ملاحظة: حلت محل والمتوسطة تركيب 1X PBS من الخطوة 2.9.
6. تصور الفوسفاتيز القلوية الملون الكلى باستخدام stereomicroscope أو مجمع المجهر مع / مرشح دابي مجموعة هويشت. ملاحظة: خطوة اختيارية: تصور يوديد propidium باستخدام-رودامين ميثيل (TRITC) أو تكساس مرشح الأحمر.

5. ترسيم الكلى الكبار قطاعات القاصي الأنبوب الصغير مع رودامين DBA

1. إعداد العمل حل DBA 200 ميكرولتر من تمييع DBA (2 ملغ / مل) 1: 100 في 1X PBS.
2. استبدال 1X PBS مع 0.05٪ محلول توين مع الحل DBA 200 ميكرولتر.
3. وضع على محور دوار لل1 ساعة على RT.
4. إزالة حل DBA ويغسل الكلى 3 مرات مع 3-5 مل من 1X PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: خطوة اختيارية: لتسمية وتصور نوى الخلايا في الجهاز جنبا إلى جنب مع التسمية DBA، نقع في محلول دابي الكلى للكشف مع هويشت / مرشح دابي (يمكن أن يتم الكشف عن رودامين DBA صمة عار مع TRITC أو تكساس مرشح الأحمر). إعداد المخزون دابي عن طريق إذابة مسحوق بتركيز 5 ملغ / مل (14.3 ملم). تمييع الأسهم إلى 300 نانومتر في 2X SSC واحتضان الكلية في هذا الحل لمدة 20 دقيقة. شطف مع 1X PBS وانتقل إلى الخطوة 5.5. إذا تم تنفيذ الجزء 4 المعالجة، أن نضع في اعتبارنا أن دابي والفوسفاتيز القلوية كلاهما الكشف مع هويشت مرشح / دابي.
5. إزالة 1X PBS وجبل الكلى على شريحة زجاجية نظيفة (راجع خطوات 2،9 حتي 2،12).
6. تصور شرائح البعيدة الملطخة DBA في الكلى باستخدام معيار TRITC أو تكساس مرشح الأحمر موضوعة على stereomicroscope أو مجمع المجهر الفلورسنت. ملاحظة: S اختياريتيب: تصور دابي باستخدام هويشت مرشح / دابي.

6. التضمين، Cryosectioning وتلطيخ (الأصباغ الحيوية والمناعية وصفها) من اسماك الزرد الكبار الكلى الأنسجة

1. اختيار الأسماك لتحليلها، ثم الموت ببطء، وتحديد، وpermeabilize كما هو موضح (خطوات 3،2-3،8). ملاحظة: إصلاح الأسماك البالغة في 9: 1 الإيثانول: الفورمالديهايد / 0.1٪ DMSO بدلا من 4٪ بارافورمالدهيد / 1X PBS / 0.1٪ DMSO لإجراء cryosection لإنتاج أقسام للديكستران، الفوسفاتيز القلوية، وDBA التصور. ومع ذلك، نضع في الاعتبار أن التثبيت القائم على امتصاص العرق يمكن أن تكون متوافقة لبعض الإجراءات المناعية. علاوة على ذلك، ليست هناك حاجة تبييض الكلى الكبار لتحليل cryosection، لأن الخلايا الصباغية هي سطحية ولا تؤثر على التصور الخلايا كليون التي تتألف منها "الداخل" من الجهاز الكلى.
2. في اليوم التالي، وإزالة الحل السكروز 30٪ واستبدالها مع 1: 1 تجميد الأنسجة المتوسطة: 30٪ sucrosه لمدة 4 ساعة عند RT.
3. إزالة 1: حل 1 و تضمين عينات الأنسجة في الكلى 100٪ تجميد المتوسطة في cryomolds ومكان في -80 ^درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
4. قطع مستعرض أقسام التسلسلية، ما يقرب من 12 ميكرون سميكة، من خلال الكلى الكبار بأكمله.
5. جبل cryosections المجمدة لاصقة على الشرائح المجهر والسماح للهواء الجاف لمدة 1 ساعة عند 50 ^{درجة مئوية.}
6. تخزين الشرائح في -80 ^درجة مئوية حتى الاستخدام.
7. عندما cryosections على استعداد ليكون المسمى، وإزالة المجهر الشرائح من -80 ^درجة مئوية ومكان على الشريحة الأكثر دفئا عند 50 ^درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
8. باستخدام مانع القلم السائل، ورسم دائرة حول cryosections واسمحوا الجافة لمدة 15 دقيقة على الشريحة دفئا عند 50 ^{درجة مئوية.}
9. إزالة الشرائح من الشريحة الأكثر دفئا ووضع شقة في غرفة الرطوبة في RT.
10. ترطيب cryosections بإضافة 1X PBS مع 0.05٪ توين إلى الجزء مطوقة من الشرائح لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: حوالي 200 - 300 ووهناك حاجة لتغطية كل جزء مطوقة على شريحة لتر؛ # 956.
11. استبدال 1X PBS مع 0.05٪ محلول توين مع 1X PBS الطازجة واحتضان لمدة 10 دقيقة.
12. إزالة 1X PBS واحتضان cryosections في عرقلة الحل لمدة 2 ساعة. ملاحظة: للحصول على 10 مل عرقلة الحل، والجمع بين 8 مل 1X PBS مع 0.05٪ توين، 2 مل مصل العجل الجنين و 150 ميكرولتر DMSO. لأداء المناعية بعد خطوة حجب، واحتضان الشريحة مع الأجسام المضادة الأولية المطلوب المخفف في كتلة يا الطازجة / N عند 4 ^درجة مئوية، ويغسل مرة واحدة باستخدام 1X PBS مع 0.05٪ توين، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT مع الحل الضد الثانوية مخففة في 1X PBS مع 0.05٪ توين، ويغسل مرة واحدة باستخدام 1X PBS مع 0.05٪ توين، وجبل ساترة على الشريحة مع تصاعد المتوسطة. والتخفيفات الأجسام المضادة المطلوبة تختلف ويجب أن يتم تنفيذ التجارب لتحديد التخفيفات الأمثل. يمكن استرجاع مستضد أيضا تسهيل immunolabeling، ويتم تنفيذ قبل الحجب. فورا بعد إذابة الشرائح عند 50 ^درجة مئوية(الخطوة 6.8) احتضان cryosections بين 95 ^س C-100 ^درجة مئوية لمدة 40 دقيقة في مسخن 10 ملي العازلة سيترات الصوديوم. تبريد الشرائح لمدة 30 دقيقة، ثم يغسل مرتين في 1X PBS مع 0.05٪ توين، والمضي قدما إلى الخطوة 6.11.
13. إزالة عرقلة الحل وغسل cryosections 3 مرات مع 1X PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
14. استبدال 1X PBS مع حل DBA تلطيخ واحتضان لمدة 1 ساعة. ملاحظة: تمييع 1 ميكرولتر DBA في 99 ميكرولتر من 1X PBS لجعل حل تلطيخ 100 ميكرولتر.
15. إزالة حل DBA تلطيخ وغسل cryosections 3 مرات مع 1X PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
16. تطبيق التسمية الفوسفاتيز القلوية واحتضان على cryosections لمدة 10 دقيقة.
17. غسل الفوسفاتيز القلوية قبالة cryosections مع سلسلة من 3 يغسل من غسل العازلة لمدة 10 دقيقة لكل منهما. ملاحظة: للحصول على 100 مل من محلول غسل العازلة، والجمع بين 5 مل من 0.5 M EDTA و 120 ملغ من الليفاميزول في 95 مل من 1X PBS. لتسمية النوى، احتضان المقاطع مع يوديد propidium أو دابي في ديوأشار lutions سابقا (خطوات 4.4 و 5.4 على التوالي) لمدة 30 دقيقة في RT. اختر صمة عار النووية متوافقة مع مزيج من البقع الفلورسنت الأخرى التي تم اختيارها.
18. إزالة جميع السائل من cryosections وضعت 2 قطرات من تصاعد المتوسطة على شريحة المجهر.
19. وضع بعناية غطاء زجاجي الصغير على الشريحة المجهر. Cryosections هم الآن على استعداد لصورة مع المرشح المناسب (ق).

7. معالجة WISH للاسماك الزرد الكبار عينات الكلى

1. اختيار العينة الزرد المطلوب (ق)، والموت ببطء، وتحديد وتشريح الكلى كما هو موضح (خطوات 3،1-3،5). ملاحظة: من الضروري استخدام حل تثبيتي من بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) / 1X PBS مع 0.1٪ DMSO إلى permeabilize الكلى. وضع الكلى في قارورة زجاجية لسهولة التصور أثناء خطوات المعالجة اللاحقة.
2. إزالة تثبيتي، وغسل الكلى مرتين مع 5 مل من 1X PBST.
3. إزالة 1X PBS وغسل الكلى مرتين وايعشر الميثانول بنسبة 100٪، ثم احتضان الكلى في -20 ^درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لpermeabilize. ملاحظة: تشريح الكلى يمكن تخزينها لأجل غير مسمى -20 ^{درجة مئوية.}
4. ترطيب الكلى عن طريق إجراء سلسلة من 5 دقائق يغسل مع 3-5 مل من 50٪ الميثانول / 1X PBST، 30٪ الميثانول / 1X PBST، ومرتين مع 1X PBST.
5. تبييض الكلى لإزالة تصبغ كما هو موضح (خطوات 3،10-3،14).
6. علاج الكلى مع 10 ميكروغرام / مل K بروتين / 1X PBST مع 0.1٪ DMSO لمدة 20 دقيقة، ثم يشطف مرتين مع 1X PBST وما بعد الإصلاح في 4٪ PFA / 1X PBST لمدة 20 دقيقة إلى O / N. ملاحظة: إعداد دائما بروتين K الحل العمل على الفور قبل عينة الهضم من خلال الجمع بين 50 ميكرولتر من بروتين إذابة حديثا K الأسهم (10 ملغ / مل)، 50 مل من 1X PBST، و 50 ميكرولتر من DMSO.
7. معالجة الكلى للWISH مفردة أو مزدوجة الخطوات التالية لتوليف riboprobe، prehybridization، التهجين، ومكافحة digoxygenin / مكافحة fluoroscein الأجسام المضادة الحضانة وDETECنشوئها صفها مؤخرا ^49. ملاحظة: الجامع جبل ينبغي إجراء تصوير البقع الكلى في غضون عدة أيام من إجراء رد فعل تلطيخ. كليون البقع تميل إلى تتلاشى بسرعة كبيرة، خصوصا تسميات الركيزة الحمراء. لكليون التصوير الفوتوغرافي، جبل العينة الكلى كما هو موضح أعلاه في خطوات 2،10-2،12، والصورة باستخدام مجهر مركب سرتيو أو شقة. مرشحات التفاضلية المقابل تدخل يمكن استخدامها لتصور أفضل الخطوط الخلوية من النيفرون لتسهيل تحليل العينة.

النتائج

تم تنفيذ كل البروتوكولات على النوع البري الزرد. أمثلة على البيانات التي تم الحصول عليها الوثيقة التركيب الهيكلي الطبيعي وخصائص النيفرون داخل صحي الكلى الزرد الكبار. الزرد الكبار يمتلك mesonephros، أو شكل الكلى الثاني الموجود على جدار الجسم الظهرية (الشكل 1A). الكلى الكبار مسطح نسبيا ويحتوي على ما يسمى الرأس، والجذع، ومنطقة الذيل مع الخلايا الصباغية السطحية المنتشرة في جميع أنحاء هذه المناطق (الشكل 1A). يحتوي على أنسجة الكلى صفائف النيفرون التي تربط وتصب في مجاري جمع المركزية (الشكل 1A) تشعبت. ويستقطب كل كليون على طوله، مع فلتر الدم (أو كرية الكلوي) في نهاية واحدة، تليها سلسلة من شرائح أنبوب صغير، وتنتهي اخيرا في القناة التي تقوم بجمع الحل الذي سوف تفرز (الشكل 1A). كل كليون الكبار أنبوب صغير يحتوي segmen الداني والقاصيTS من الخلايا، رسمتها التعبير عن النقل المذاب محددة ^{30،31،36،37،} والتي يتم حفظها مع نمط قطعي التي أظهرتها النيفرون الجنينية ^31-35 (الشكل 1B). على سبيل المثال، النصوص cubilin بمناسبة القريبة نبيب ³⁹ (PCT وPST) والنصوص clcnk بمناسبة نبيب القاصي ³² (DE وDL) (الشكل 1B). علاوة على ذلك، يتميز قطاع معاهدة التعاون بشأن البراءات التي كتبها التعبير عن slc20a1a، وPST يتميز التعبير عن slc13a1، يتميز DE بواسطة التعبير عن slc12a1، ويتميز DL من التعبير عن slc12a3 ³²   (الشكل 1B). الاختلافات بين الأنابيب كليون الكبار مقارنة تلك الجنينية هي أن قطاعات البعيدة عرض تلافيف (DE، DL) وفروع قطاع DL على نطاق واسع في الكبار، والذي يختلف من الخطية، وعلم التشريح غير متفرعة من هذه المناطق في EMBRيو ^{30،31،36،37} (الشكل 1A). في البالغين ³⁰ و الجنينية ^38-41 الأنابيب كليون، يمكن تمييز ظهارة معاهدة التعاون بشأن البراءات وذلك بسبب خصائصه التقامي ويمكن تصور وتقييم لوظيفة reabsorptive على أساس القدرة على امتصاص تقارن ديكستران الفلورسنت (الشكل 1B). علاوة على ذلك، كما هو موضح في الأرقام اللاحقة، نبيب الكبار القريبة (PCT وPST، أو لعموم المنطقة القريبة) هو المسمى من قبل الفوسفاتيز القلوية، في حين يسمى نبيب القاصي (DE وDL، أو لعموم المنطقة البعيدة) بواسطة DBA (الشكل 1B). الأساليب المستخدمة هنا إلى تسمية الكبار قطاعات كليون الزرد باستخدام امتصاص ديكستران، الفوسفاتيز القلوية، DBA، أو WISH المناعية يمكن أن يؤديها في توليفات مختلفة، في جبل بأكمله أو مع المقاطع النسيجية من الأنسجة الكلوية (الشكل 2). وهذا يسمح للمرونة كبيرة ومتنوعة عند ليتم تقييمها تكوين كليون (الشكل 2).

الكلى الكبار يمكن تركيبه شقة على شريحة زجاجية للتحليل، مع ديفوتس من الصلصال (أو بدلا من ذلك، الشحوم فراغ) يستخدم لتعليق ساترة على الأنسجة (الشكل 3A). وطول الكلى النموذجي هو حوالي 5-7 ملم، لديها حجم يفضي إلى التصوير على جهاز ستيريو أو مجمع المجهر (الشكل 3A). تحت الإضاءة brightfield، يبلغ عدد سكانها سطحية من الخلايا الصباغية مع تصبغ أسود يمكن تصور بالتعاون مع أنسجة الكلى، والأوعية الدموية مثل الشريان الأبهر ويمكن ملاحظة ذلك لأن كريات الدم الحمراء تعميم لها لونا أحمر (الشكل 3B). بعد الحقن داخل الصفاق من ديكستران-FITC، المجالات معاهدة التعاون بشأن البراءات المنتشرة في جميع أنحاء mesonephros لا تزال صفت فيما بعد 3 أيام، وتصويرها باستخدام فلتر FITC على المجهر الفلورسنت (الشكل 3C). بينما الخلايا الصباغية تحجب جزئيا التصور من الأنابيب الكلوية الفردية (فيقوإعادة 3C ")، الخلايا الصباغية لا تمنع الكمي لعدد كليون أو تقييم قطرها أنبوب صغير والطول. بعد الحقن داخل الصفاق من ديكستران الفلورية روبي، تبييض العينة الثابتة القضاء على تصبغ الخلايا الصباغية، ووحظت قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات مع الإضاءة الساطعة الحقل حدها (الشكل 3D). يمكن في بعض الأحيان أن ينظر إلى قطرات الدهون من تجويف الجسم البطن بالاشتراك مع كامل الاستعدادات الجهاز الكلى (الشكل 3A) شرائح .Individual معاهدة التعاون بشأن البراءات تظهر تلافيف، لفائف (الشكل 3D ') ولكن أيضا يمكن أن تتميز تمتد الخطية نسبيا (الشكل 3D ").

قدمت تقارن ديكستران المختلفة مستويات مختلفة من الوضوح العام في وضع العلامات نبيب القريبة. على وجه الخصوص، أدى-ديكستران FITC أو ديكستران الفلورية روبي لهش تسميات كليون مع الحد الأدنى من الخلفية (أرقام 3C-D "). كل من شلال بلو ديكسترانأظهر الإلكترونية وإبليس تقارن الصفراء القريبة امتصاص أنبوب صغير في الكلى الكبار (الشكل 4A، 4B). ومن المثير للاهتمام، وأظهرت الكلى تتعرض لديكستران الأزرق سلسلة مضان PCT محددة نسبيا مع بعض الخلفية (الشكل 4A، 4A ")، في حين تتعرض الكلى إلى ديكستران الصفراء إبليس قد وصفت قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات ولكن أظهرت إشارة الخلفية ملحوظة، مع غير محددة تلطيخ الفلورسنت الحاضر في جميع أنحاء سدى الكلوي، أو الفضاء بين النيفرون (الشكل 4B، 4B). أخيرا، شريطة استخدام ديكستران الفلورية روبي متفوقة وضع العلامات نبيب الداني، مع خلفية ضئيلة أو معدومة حتى عندما ينظر في مجموعة من تكبير مختلفة (الشكل 4C، 4C '). في جميع الحالات، ونمط أنبوبي مميزة من ديكستران امتصاص المكورات ترتبط مع التعبير WISH ترميز النصوص slc20a1a، وأنشأت المعاهدة الخاصة علامة ^30-32 (الشكل 4D). Nephrعلى قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات ملطخة slc20a1a العقاقير riboprobe عرض ملفات معاهدة التعاون بشأن البراءات على شكل S، وكذلك قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات أقل ملفوف بشكل حاد (الشكل 4D ")، كما لوحظ خلال صفت المقايسات المكورات ديكستران (الشكل 3D، 3D").

الاستعدادات الكلى الأخرى، مثل الكشف عن أنبوب صغير القريبة النشاط الفوسفاتيز القلوية (الشكل 5A، 5B، 5C) أجريت بالمثل بعد إزالة تصبغ الخلايا الصباغية. هذا يسمح للنبيب نفرون القريبة التصوير والتحليل دون أي عائق. الذاتية التفاعل الفوسفاتيز القلوية في كليون هو السمة المميزة الرئيسية واحدة من نبيب الداني ^1،47. الفوسفاتيز القلوية تلطيخ هو محددة للغاية بالنسبة للمناطق القريبة كليون، بالمقارنة مع نمط WISH التعبير عموم القريب من الجين cubilin ³⁹ (الشكل 5D، 5D '). كان الفوسفاتيز القلوية التفاعل على أشده في التنوبالقسم الحادي من نبيب الداني الذي يتوافق مع معاهدة التعاون بشأن البراءات (الشكل 5B)، على غرار نمط التعبير cubilin (الشكل 5D، 5D ')، الذي كان أيضا أعلى مستويات النص النسبية في معاهدة التعاون بشأن البراءات. تميزت معاهدة التعاون بشأن البراءات التي لها القطر أوسع قليلا، تعبيرا محددا للعامل النسخ mafba (الشكل 5E، 5E)، والتعبير محدد من slc20a1a المذاب نقل الجين (الشكل 4D، 4D). كما وصفت الفوسفاتيز القلوية التفاعل امتداد أنبوب صغير القريبة التي يبلغ قطرها أرق الذي يتوافق مع شريحة PST (الشكل 5B) على أساس المقارنة إلى الجزء محددة نص تعبير عن slc13a1 المذاب نقل الجين (الشكل 5F، 5F). المجالات WISH تعبير عن slc20a1a علامة معاهدة التعاون بشأن البراءات وPST علامة slc13a1 لا يجتمعان (الشكل 5G )، والفحص الدقيق من النيفرون واحدة أظهرت أن هذه المجالات منها تتاخم، مع قليل إذا أي فجوة بينهما، والتي معا ألخص مجال التعبير عن cubilin (السهام السوداء في. الشكل 5G، 5G "5G" " ).

لمزيد من تأكيد علاقة تفاعلية الفوسفاتيز القلوية مع الهوية نبيب الداني، جبل بأكمله شارك في وضع العلامات على الفوسفاتيز القلوية تلطيخ أجريت على الكلى من الزرد التي تلقت حقنة داخل الصفاق من ديكستران الفلورية روبي قبل 3 أيام (الشكل 6A-C). أظهر ديكستران الفلورية روبي التداخل مع الفوسفاتيز القلوية في مجرد جزء قطرها أوسع من المجال نبيب الداني الذي يتوافق مع معاهدة التعاون بشأن البراءات (الأمثلة في الشكل 6D-I). توقف المجال ديكستران إيجابي فجأة في موقع حيث القطر من أنبوب صغير القريبة ضعيفة، أي حيث التقى معاهدة التعاون بشأن البراءات وPST، (السهم الأبيضوقد لوحظ رؤساء في الشكل 6) والوحيد الفوسفاتيز القلوية التفاعل في قطاع PST لاحق (الأمثلة في الشكل 6D-I). خلفية مضان من رد فعل الفوسفاتيز القلوية كما حددت بشكل خافت على زوج من المسارات المتوازية جمع القناة الكبرى وجدت في الكلى الكبار ^29،30 -ducts التي تتميز لها على أوسع نطاق القطر من أي أنبوب الكلوي المصاحب (العلامات النجمية في الشكل 6A، 6D، 6E، 6G، 6H). المقبل، وقد لوحظ المشارك وضع العلامات من الأنابيب كليون مع الفوسفاتيز القلوية وامتصاص ديكستران في تحليل cryosection (الشكل 6J، محيط أنبوب صغير المبينة مع بقع بيضاء). في المقطع العرضي، لوحظ الفوسفاتيز القلوية التفاعل في عصابة سميكة على السطح القمي للظهارة أنبوبي، بما يتفق مع التركيب الدقيق الحدود فرشاة، في حين أظهر المقابلة خلية أنبوبي الفضاء عصاري خلوي ديكستران الفلورية روبي التفاعل (الشكل 6J). والجدير بالذكر أن staineكانت د الأنابيب المزدوج إما إيجابية لالفوسفاتيز القلوية وديكستران، مما يؤدي إلى التعرف عليهم وقطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات، أو إيجابية منفردة لالفوسفاتيز القلوية (الشكل 6J، أنبوبية محيط المبينة في النقاط الصفراء)، مما أدى إلى تحديد وشريحة PST (ملاحظة: أخرى كانت الأنابيب الحالية السلبية على حد سواء البقع، لا تظهر البيانات) (الشكل 6J). وعلاوة على ذلك، تم الجمع بين الفوسفاتيز القلوية تلطيخ (الشكل 6K) بنجاح مع تسمية النووية، يوديد propidium (الشكل 6L)، وتسهيل الفرز الخلية (تراكب في الشكل 6M).

وصفت نبيب القاصي من الكبار كليون الزرد مع رودامين مترافق DBA (الشكل 7). جبل بأكمله مزدوج وضع العلامات مع DBA والفوسفاتيز القلوية أجريت على الكلى من الزرد wildtype (الشكل 7A-C). أظهر DBA والفوسفاتيز القلوية التفاعل أي تداخل في الأنابيب كليون ( الشكل 7D-H). أظهرت DBA الأنابيب الملون قطر أرق بشكل ملحوظ مقارنة مع الأنابيب الإيجابية الفوسفاتيز القلوية، وكثيرا ما تشعبت الأنابيب DBA (السهام البيضاء، الشكل 7G، 7H، 7J)، في حين لوحظ المتفرعة أبدا في قطاعات أنبوب صغير ملطخة الفوسفاتيز القلوية. تم جمع cryosections الكلوي من wildtype الزرد التي تحمل التحوير الذي المروج ENPEP يدفع EGFP (تيراغرام: ENPEP: EGFP)، والعلامات GFP كل من القريبة والبعيدة ⁵¹ كليون الأنابيب (الشكل 7I). تم تنفيذ المناعية للكشف عن GFP، وذلك لتسمية كل من الأنابيب الكلوية (الأخضر والشكل 7I)، تليها العلامات الفلورية مع الفوسفاتيز القلوية وDBA (الفيروزي والأحمر، على التوالي، الشكل 7I). وكشف تحليل المقاطع أنبوب صغير أن الأنابيب كانت إما إيجابية لالفوسفاتيز القلوية أو DBA، ولكن ليس كل من التسميات (الشكل 7I). حوض نادر فقطأظهرت ules التفاعل مع لا الفوسفاتيز القلوية ولا DBA صمة عار، وربما يرجع ذلك إلى زاوية من قسم أنبوب صغير (السهم الأبيض، الشكل 7I). وعلاوة على ذلك، تم الجمع بين DBA تلطيخ بنجاح في جبل كله الكلى تلطيخ مع التسمية النووية دابي (الشكل 7J)، مؤكدا مرة أخرى طبيعة مميزة متفرعة من شرائح أنبوب صغير البعيدة (السهام البيضاء، الشكل 7J).

المقبل، لمواصلة المقارنة بين أنماط ديكستران-FITC امتصاص، الفوسفاتيز القلوية، وDBA، تم فحص العلامات الثلاثي عن طريق حقن داخل الصفاق الزرد الكبار مع ديكستران-FITC، تليها العزلة الكلى بعد 3 أيام تليها cryosectioning وتلطيخ للالفوسفاتيز القلوية وDBA (الأمثلة الواردة في الشكل 8A-E). أظهرت الأنابيب الكلوية ثلاث فئات من مجموعات التسمية: الأنابيب التي كانت إيجابية لضعف الفوسفاتيز القلوية وديكستران تدل قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات (الخطوط المنقطة البيضاء)، tubulوفاق إيجابية لالفوسفاتيز القلوية وحدها تدل شرائح PST (الخطوط المنقطة الصفراء)، وتم تسمية الأنابيب البعيدة بواسطة مجرد DBA (يحدد منقط أحمر الشكل 8A-E). نقاط فرع علاوة على ذلك، DBA فقط إيجابي الأنابيب أظهرت (الشكل 8E). من خلال تحليل WISH، هذا النمط المتفرعة المميز للالقاصي، الأنابيب الإيجابية DBA ترتبط مع أنماط التعبير الجيني من النصوص نقل المذاب التي هي محددة لقطاعات أنبوب صغير البعيدة (الشكل 8F-I). كانت النصوص ترميز clcnk، الذي يصادف نبيب القاصي بأكمله (DE وDL) رقيقة في القطر، وفيرة في الكلى، ونقاط فرع الواردة (رأس السهم الأسود الشكل 8F، 8F '). في المقابل، أظهرت أن قطاعات أنبوب صغير التعبير عن slc12a1 أو slc12a3، والتي هي من علامات DE وDL، على التوالي، كانت أقل وفرة في عينات الكلى عموما مقارنة clcnk التعبير (قارن الشكل 8 G و8F، 8H). وعلاوة على ذلك، كانت قطاعات نبيب التي أعربت عن slc12a1 نادرا ما، تشعبت (الشكل 8G، 8G)، في حين أن المناطق التي أعربت عن أنبوب صغير slc12a3 كثيرا ما تشعبت في ترتيبات شبيهة الدولاب على الهواء مميزة (الشكل 8H، 8H، 8H "، 8H" " ، السهام السوداء). أخيرا، أظهرت WISH مزدوجة للslc20a1a علامة معاهدة التعاون بشأن البراءات وعلامة clcnk القاصي أن هذه البقع لم تكن متداخلة (الشكل 8I). والجدير بالذكر، لم تعلق تمتد من slc20a1a -expressing قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات لclcnk -expressing الأنابيب، الذي كان من المتوقع منذ يقع PST بين هذه المناطق (الشكل 8I). أخذت معا، والمقايسات وصفها من الأنابيب الكلوية مع امتصاص ديكستران، الفوسفاتيز القلوية التفاعل، DBA، وأتمنى لنسخ الجينات المحددة، تمكن من التمييز الداني القاصي قطاعات مقابل.

ر "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما ">
الرقم 1. كليون التشريح في الكلى الزرد الكبار. رسومات تخطيطية لل(A) الكبار الكلى الزرد و (B) جدول مقارنة للخصائص الجزيئية التي أظهرتها شريحة الكبار والنيفرون الزرد الجنينية. (A) (أعلى اليسار) والكلى الكبار هو جهاز شقة تقع على جدار الجسم الظهرية. (أعلى اليمين)، عندما ينظر اليها من منظور بطني، والكلى لديه التشكل المنحني المميز، ويتألف من مناطق الرأس والجذع والذيل، وأيضا لديه السكان سطح الخلايا الصباغية المرتبطة بها. توسيع (يسار أسفل) يظهر التخطيطي شجرة كليون نموذجية في الكلى الزرد الكبار، التي في كل واحد يمتلك كليون مرشح الدم (كرية الكلوي) في نهاية واحدة، تليها نبيب الداني، نبيب القاصي والقناة. الملونة التخطيطي (بوttom اليمين) يظهر الرسم البياني الخطي للشجرة كليون شخص بالغ واحد مقارنة مع تلك الخصائص جزء من النيفرون الجنينية (B). النيفرون الجنين الزرد تحتوي على شرائح نبيب التي تشمل نبيب الملتوية القريبة (PCT)، على التوالي أنبوب صغير القريبة (PST)، البعيدة في وقت مبكر (DE)، والقاصي الراحل (DL)، مع مجالات التعبير الجيني المعنية المدرجة أدناه. النيفرون في الزرد الكبار لديها تركيبة مماثلة قطعي والتوقيع الجزيئي مماثل على أساس مجالات التعبير عن الجينات التي تكود النقل المذاب، على الرغم من تميز ملحوظ مقارنة الجنين هو أن العديد من النيفرون يمكن أن يكون متحدا من خلال شريحة DL تشعبت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم خريطة 2. مخطط انسيابي يدل على العلاقة بين أساليب مبين في هذا البروتوكول، مشيرا إلى الكيفية التي يمكن بها تنفيذ الطرق منفردة أو في مجموعات متنوعة. بعد الحقن داخل الصفاق المسمى يسين قابل للتثبيت ديكستران في الزرد الكبار، والكلى يمكن تصور في جبل بأكمله إعداد، إما وحدها أو بالاشتراك مع الفوسفاتيز القلوية و / أو البقع DBA. بدلا من ذلك، يمكن فحص الكلى الزرد المحدد بعد النسيجية باجتزاء الأنسجة مع ناظم البرد. الأقسام يمكن ملطخة لتسمية مجموعات عديدة من سمات، وذلك باستخدام المناعية، وتلطيخ النووي، DBA تلطيخ و / أو الفوسفاتيز القلوية التفاعل. بالإضافة إلى ذلك، أقسام الكلى يمكن تصور مباشرة عن وجود يسين قابل للتثبيت امتصاص ديكستران في قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات. أخيرا والكلى مختارة يمكن معالجة للتعبير الزماني المكاني في التعبير الجيني باستخدام WISH. الأرقام بين قوسين تشير إلى correspoالاكتشاف أجزاء البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3. الكبار الكلى الزرد جبل مسطح إعداد وتطبيق لتصور امتصاص ديكستران مترافق في قطاع معاهدة التعاون بشأن البراءات من النيفرون الكلى. (A) صورة Brightfield من عينة الكلى مسطحة جبل إعداد، الذي تم وضعه الجهاز شقة على شريحة زجاجية، مع ساترة وضعت على أعلى من الأنسجة التي يستريح على أربعة ديفوتس من الصلصال (اللون الوردي الساخن). هنا يتم تصويرها إعداد الكلوي إلى جانب حاكم متري إلى تقديم مقارنة تحجيمها. الكلى الكبار النموذجي هو حوالي 5-7 مليمتر (ملم) من الرأس إلى الذيل. (B) Brightfield صورة لغير مقصورالكلى. تصبغ أسود يتوافق مع السكان المتناثرة من الخلايا الصباغية وجدت بالتعاون مع الكلية، والشريان الأورطي يمتد على طول خط الوسط من الكلى. (C) التصور قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات كليون 3 أيام بعد الحقن داخل الصفاق من 40 كيلو دالتون-ديكستران فلوريسئين (FITC) ، دون تبييض الكلى الكبار. وتعتبر قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات في جميع أنحاء الكلى ولكنها تحجب جزئيا بسبب الخلايا الصباغية. (C ') تقريب رقمي لكليون واحد، مع الخلايا الصباغية (السهم الأبيض). (D) صورة من الكلى الكبار 3 أيام بعد الحقن داخل الصفاق من 10 كيلو دالتون ديكستران الفلورية روبي، تثبيت في الكلى، والتبييض. تم إزالة تصبغ الصباغية وكانت تصور المناطق PCT هنا بناء على استيعابها التقامي من ديكستران تحت الإضاءة brightfield. يمكن في بعض الأحيان أن ينظر إلى قطرات الدهون (السهم) من البطن بالتعاون مع عينات الأنسجة الكلوية. (D '، D ") Repreالصور sentative تصور الاختلافات الشكلية الطفيفة بين قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات. في حين أن العديد من الكلور كليون يتم لف بإحكام (D ')، النيفرون أخرى تحتوي على معاهدة التعاون بشأن البراءات المناطق التي لديها الحد الأدنى من اللف (D "). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

. وضع العلامات الرقم 4. الكبار قطاع نبيب نفرون الكلى PCT الزرد Wildtype تم حقن داخل الصفاق مع المكورات ديكستران فلوري واحد؛ ثم تم فحص الكلى الخاصة بهم بعد 3 أيام من الحقن لتصور معاهدة التعاون بشأن البراءات. (A، A ') تتالي ديكستران الأزرق، 10 كيلو دالتون (B، B') ديكستران وسيفر الأصفر، 10 كيلو دالتون و (C، C ') و ديكستران luoro روبي، 10 كيلو دالتون جميع تفضيلي تسمية قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات في النيفرون الكلى. كلا شلال المعرض أصفر أزرق وإبليس ديكستران بعض العلامات غير محددة من السكان الخلية اللحمية تقع بين النيفرون، مع أعلى بكثير خلفية لوحظ في لوسيفر الصفراء الكلى المعالجة. في المقابل، أظهر ديكستران الفلورية روبي خفضت بشكل كبير الخلفية مع وضع العلامات PCT مكثفة. (D، D ') ومن الكلى الكبار الملون بواسطة WISH للكشف عن مكان ترميز النصوص slc20a1a، علامة محددة لنوع من الخلايا نقل معاهدة التعاون بشأن البراءات. مجال التعبير عن slc20a1a تطابق نمط مميز من امتصاص ديكستران وحظ في الكلى، مع توزيع مختلف ملفوف بإحكام / يحلق المجالات معاهدة التعاون بشأن البراءات وكذلك معاهدة التعاون بشأن البراءات تمتد أكثر ممدود التي تظهر قطرها واسع ثابت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ontent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما ">
الشكل 5. نتيجة التمثيلية للتلطيخ لالفوسفاتيز القلوية، علامة أنبوب صغير عموم الداني في الكلى الكبار الزرد مقارنة مع علامات أخرى نبيب الداني تقييمها مع WISH. (AC) الفوسفاتيز القلوية تلطيخ (الفيروز) ينير كليون نبيب الداني، وإبراز كل من معاهدة التعاون بشأن البراءات وPST. (DF ') WISH واحدة للجينات المدرجة (في كل من تلطيخ البنفسجية). (D، D') نمط التعبير عن cubilin ، وعموم الداني (PCT-PST) علامة، يرتبط الفوسفاتيز القلوية (D، D '). في المقارنة، WISH لmafba تمثل معاهدة التعاون بشأن البراءات (E، E ') ويصادف slc13a1 في PST (F، F). في (GG "') WISH مزدوجة للعلامة PCT slc20a1a </ EM> (أحمر) وعلامة slc13a1 PST (اللون الأرجواني) يدل على أن قطاعات وصفت من قبل هذه العلامات لا تتداخل، وبدلا من أن مجالات التعبير عنها يشغلون مناصب المجاورة عندما يتم فحص النيفرون واحدة عن كثب (G'-G "'). السهام السوداء تشير إلى تقاطع بين معاهدة التعاون بشأن البراءات وPST قطاعات، والتي عادة ما يترافق مع تغيير في القطر أنبوب صغير من الكبير والصغير، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6. الفوسفاتيز القلوية وديكستران المعرض امتصاص التداخل في قطاع معاهدة التعاون بشأن البراءات من النيفرون الكلى الكبار، والفوسفاتيز القلوية تلطيخ متوافق مع التعاون النووي وضع العلامات مع يوديد propidium. (AI) الجامع جبل الاستعدادات لتلطيخ الفوسفاتيز القلوية التي أجريت على الكلى من البالغين الزرد التي تلقت سابقا حقنة داخل الصفاق من ديكستران الفلورية روبي. الفوسفاتيز القلوية (الفيروز) وديكستران الفلورية روبي (الأحمر) تظهر التداخل في معاهدة التعاون بشأن البراءات، ولكن ليس في PST، وهو أمر ايجابي فقط لالفوسفاتيز القلوية. مستويات خلفية الفوسفاتيز القلوية تسليط الضوء على زوج من القنوات الرئيسية في جمع كل الكلى (النجمة *)، التي تعتبر متميزه نظرا لقطرها واسع. (AC) الصورة المدمجة والصور منفصلة في منطقة السرج من الكلى واحد. (DF) و(GI) مجموعتين من الصور المدمجة والصور منفصلة المثال النيفرون. (I) تحليل Cryosection يؤكد التعاون وسم الفوسفاتيز القلوية وديكستران الفلورية روبي في قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات (المذكورة في النقاط البيضاء)، في حين الفوسفاتيز القلوية تسميات وحده PST وكان قطاع الكلى (المبينة في النقاط الصفراء). (KM)المسمى مع (K) الفوسفاتيز القلوي (الفيروز) و (L) يوديد propidium (اللون الأرجواني)، تمكين (M) اندمجت التصور الخلايا نبيب الداني والنواة، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. الفوسفاتيز القلوية وDBA بشكل متبادل تسميات قطاع الحصرية التي تميز الداني عموم المناطق وعموم البعيدة، على التوالي، موجودة في النيفرون الكلى الكبار الزرد. (ه) الاستعدادات جبل كامل من الكلى الزرد ملطخة الفوسفاتيز القلوية ورودامين-DBA. الفوسفاتيز القلوية (الفيروز) وDBA (أحمر) لا تظهر التداخل في الكلى. مستويات خلفية phospha القلويةTASE إلقاء الضوء على زوج من القنوات الرئيسية في جمع كل الكلى (النجمة *)، التي تعتبر متميزه نظرا لقطرها واسع. الأنابيب الإيجابية DBA هي أرق في قطر وتتميز في كثير من الأحيان من خلال وجود نقاط فرع (السهام البيضاء). (AC) مدموجة صورة وصور منفصلة في منطقة سرج من الكلى واحد. (DF) مجموعة واحدة من الصور المدمجة والصور منفصلة المثال النيفرون. (G، H) أمثلة إضافية، مع الأنابيب DBA تشعبت إلى جانب الأنابيب الإيجابية الفوسفاتيز القلوية، اندمجت الصور. يؤكد تحليل (I) Cryosection أن الفوسفاتيز القلوية والتسمية DBA أقسام أنبوب صغير متميزة، والأنابيب نادرة فقط لا تظهر تسمية (السهم الأبيض )، بسبب المرجح أن زاوية الباب لأن أنبوب صغير. لهذا التحليل، الأسماك المعدلة وراثيا wildtype، تيراغرام: ENPEP: EGFP، استخدمت وتم immunolabeled كل من الأنابيب الكلوية في هذه الكلية مع الأجسام المضادة الأولية للكشف عن GFP (J). الجامع جبل تلطيخ الكلى لDBA (أحمر) ودابي (الأزرق) (الصورة المدمجة)، والتي تبين مرة أخرى متفرعة قطاعات أنبوب صغير البعيدة للالنيفرون الكبار (رأس السهم الأبيض). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8. وضع العلامات الثلاثي من cryosections الكلى الكبار مع امتصاص ديكستران، الفوسفاتيز القلوية، وDBA مقارنة القاصي تحليل قطاع WISH. الكلى (AE) الكبار تم حقن داخل الصفاق مع ديكستران-FITC (الخضراء)، والكلى جمع 3 أيام في وقت لاحق لتضمين وcryosectioning. تلطيخ مع الفوسفاتيز القلوية (الفيروز) وDBA (الأحمر) كشف ثلاثة من السكان الأنابيب: شرائح معاهدة التعاون بشأن البراءات التي كانت ايجابية لالفوسفاتيز القلوية التفاعل وDEXTركض (المبينة في بقع بيضاء)، وقطاعات PST التي كانت إيجابية فقط لالفوسفاتيز القلوية التفاعل (المبينة في النقاط الصفراء)، وشرائح أنبوب صغير البعيدة التي كانت إيجابية للDBA فقط (المحددة في النقاط الحمراء) التي أظهرت أيضا مميزة نقاط فرع البعيدة. ( م) الصورة المدمجة والصور منفصلة من مثال واحد قسم (E) مدموجة صورة القسم مثال آخر. (FI) مقارنة البعيدة أنماط التعبير الجيني عن طريق أنبوب صغير واحد (FH ") ومزدوجة (I) WISH. و(FH ') WISH واحدة للجينات المدرجة (في كل من تلطيخ البنفسجية). (F، F، تم الكشف) نمط التعبير عن clcnk، وعموم البعيدة (DE-DL) علامة في الأنابيب الرقيقة التي تحتوي على نقاط فرع (رأس السهم الأسود). (G، G ') وبالمقارنة، WISH لslc12a1 يصادف DE بدون نقاط فرع الكشف و(HH ") <م> slc12a3 يصادف DL، شريحة تتميز العديد من نقاط فرعية في جميع أنحاء الجهاز الكلى (السهام السوداء). (I) WISH مزدوجة للslc20a1a علامة معاهدة التعاون بشأن البراءات (الأحمر) وclcnk عموم البعيدة (اللون الأرجواني). قطاعات وصفت من قبل هذه العلامات لا تتداخل، وبدلا مجالات التعبير عنها يشغلون مناصب غير متجاورة، بحيث فات معاهدة التعاون بشأن البراءات الفردية (أسفل اليمين) لا تتاخم الأنابيب البعيدة، وهذا الأخير احتلال مواقع متميزة وتمتلك نقاط فرع السمة المميزة (رأس السهم الأسود ). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا، التي وصفناها الأساليب التي تمكن التصور من مكونات قطاع كليون في الزرد الكبار. حقن تقارن ديكستران الفلورسنت يمكن وضع العلامات PCT تفضيلية بسبب خصائص التقامي هذه الخلايا نبيب الداني ^30،38. هذه الطريقة لا يمكن أن يؤديها مع مرونة كبيرة بسبب وجود dextrans التي يمكن الحصول عليها مع سرب من تقارن الفلورسنت مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام dextrans يسين قابل للتثبيت هو وسيلة مريحة وخاصة لتسمية قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات، وليس مطلوبا من إجراءات وضع العلامات الثانوية. وهذا يتيح الكشف عن إشارة واضحة نسبيا ومتوافق مع العديد من العلامات الأخرى الفلورسنت، immunolabeling، واستخدام خطوط مراسل المعدلة وراثيا. وضع العلامات الفوسفاتيز القلوية يصادف أيضا نبيب الداني، مع تفاعل قوي في معاهدة التعاون بشأن البراءات وأضعف قليلا التفاعل في PST. أخيرا، وتلطيخ DBA يمكن وسم قطاعات أنبوب صغير البعيدة، والتي عرض الفصلaracteristic تشعبت التشكل. مختلف الجزيئات كتين، والتي هي بروتينات ملزمة السكر المنشأ nonimmune، وقد استخدمت على نطاق واسع للتمييز بين شرائح كليون الثدييات ^47. ومن المثير للاهتمام أن DBA في الزرد يرتبط مع شرائح أنبوب صغير البعيدة، كما انها تستخدم للاحتفال القنوات جمع في الكلى الثدييات ^47.

أخذت معا، وهذه الأساليب يمكن استخدامها في تركيبات مختلفة لتوثيق تكوين الكلوي وظيفة. حيث أن جميع هذه الأساليب يمكن استخدامها في الأعمال التحضيرية الكلى كلها، لأنها توفر أدوات لتقييم هيكل كليون وظيفة في جميع أنحاء الجهاز دون الاعتماد كليا على استخدام المزيد من الوقت تستغرق وأساليب مملة، على سبيل المثال، العمل cryosection وimmunolabeling. ومع ذلك، فإن البقع الموضحة في هذه المقالة الأساليب هي قابلة للحياة في cryosection. تحليل عينات Cryosection يولد (مقارنة كله جبل) التي هي أكثر ملاءمة لالمناعية للكشف عن pepti محددةقصر، على الرغم بالطبع هذا النوع من التحليل يتطلب توافر الأجسام المضادة الأولية المناسبة. للأسف الحد رئيسي واحد في العمل مع نموذج حيواني الزرد يبقى توافر الفقراء من الأجسام المضادة. وهكذا تبقى WISH الأكثر استخداما، أي "بأول ل،" إجراء لتحليل التعبير الجيني. أتمنى باستخدام تفاعلات الركيزة BCIP، NBT، و / أو INT لإنتاج رواسب الأرجواني أو الأحمر غير متوافق مع تلطيخ الفلورسنت على cryosections. ويتمثل أحد الخيارات لاستدعاء استخدام الكشف WISH الفلورسنت، وهو الإجراء الذي تم الأمثل لعينات الجنينية الزرد، ويمكن أن تكون مصممة للاستخدام مع الكلى الكبار. وصف الأساليب في هذه المقالة الفيديو يجب أن تسمح لمزيد من التجارب مع تقنيات مثل WISH الفلورسنت في تركيبة مع خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي وصفت شرائح الفردية مع مراسل مثل EGFP أو mCherry. بدلا من ذلك، الأساليب المذكورة هنا قد يزيد عدد الجياعد يتم اختبارها في تركيبة مع الأصباغ الحيوية الأخرى، على سبيل المثال، يكتينس الأخرى. وبالتالي، يمكن الاحتجاج مزيد من التكيف وتوسيع الطرق الموضحة هنا لتناسب احتياجات الباحث عن كامل الاستعدادات جبل الكلى والتحليل.

على هذا النحو، وهذه الأساليب لها إمكانات العامة للتنفيذ مع نموذج الزرد للدراسات تجديد الجارية، وكذلك في النمذجة مرض وراثي. هناك حاجة ملحة للبحث والعلاجات المبتكرة للالآلام الكلوية. الملايين من الناس يعانون من شكل ما من أشكال أمراض الكلى في كل عام أن ينتج عن أسباب خلقية، الحادة و / أو المزمنة. وعلاوة على ذلك، وانتشار أمراض الكلى في ارتفاع مستمر في جميع أنحاء العالم، مما يجعل هذه الأمراض مشكلة صحية عامة عالمية ^14،15. تتوفر العلاجات مثل غسيل الكلى حيث تخدم آلة غسيل الكلى الخارجية لتخليص دم المريض من النفايات الأيضية إذا كلاهم ليست قادرة على أداء هذا الدور. للأسف، هذا التدخل له حدود، والعلاج الجارية ضرورية من أجل البقاء. وعلاوة على ذلك، سوف تحتاج في نهاية المطاف مرضى زرع الكلى، والذي يمكن أن يستغرق سنوات للحصول مرة واحدة يتم وضع المريض على قائمة الانتظار. حتى بعد الحصول على عملية زرع الكلى، العديد من المرضى يعانون من آثار سلبية نتيجة لهذا الإجراء، ويجب أن المعركة هذه الآثار لبقية حياتهم. هذه الصعوبات تظهر الحاجة جادة لتطوير علاجات جديدة لمساعدة إما منع أمراض الكلى أو ربما إلى زيادة تجديد الأنسجة ^{8،16،52،53.} نظرا للقيود أخلاقية واضحة لاستخدام اختبار المواضيع الإنسان في المختبرات الطبية الحيوية، النماذج الحيوانية ضرورية لدراسة الأمراض التي تصيب البشر والتسبب لاختبار علاجات جديدة. نتيجة لتشابهه التشريحية والقرب التطوري، أصبح الماوس النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من الأمراض التي تصيب البشر ^45. ومع ذلك، هناك بعض القيود مع هذا الحيوان، امبعجز جي لتصور تطوير الجهاز في الجسم الحي والتطبيق العملي استكمال شاشات جينية واسعة النطاق. الزرد هي نموذج كائن ذات صلة ومفيدة لدراسة تطوير الجهاز والنمذجة من الأمراض التي تصيب البشر ^45،46. في ما يخص الأمراض التي تصيب البشر، homologs الوظيفية في الزرد وجود ما يقرب من 70٪ من جميع الجينات البشرية ^54،55.

وقد أبرزت الأعمال الأخيرة فائدة الزرد لكثير من مجالات البحث ^31،37،56 الكلى. وتشير الدراسات إلى التجديد والإصلاح في الزرد بعد AKI أن تجديد أنبوب صغير الظهارية وneonephrogenesis نوعان من العمليات التي تحدث وتتداخل في جميع أنحاء تجديد timecourse ^30،37. وقد استخدمت استخدام المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد دعا جنتاميسين باعتبارها النموذج إصابة من خلالها لدراسة نتائج AKI في ^29،30،37 الزرد الكبار. على مدى ما يقرب من أسبوعين من اصابة في الفترة التالية جنتاميسين، وtubul الدانيتجديد وفاق، وفي الوقت نفسه النيفرون جديدة تشكل في جميع أنحاء الجهاز ^29،30،37. بشكل عام، فإن الآليات التي تنظم تجديد الظهارية لا تزال مثيرة للجدل. في واحدة آلية المقترحة من عملية الإصلاح، هناك حالة الإصابة الحادة الأولي تليها النزع من الخلايا الميتة في التجويف. بعد ذلك، هناك سلسلة من دي التمايز، والانتشار، وأحداث الهجرة، وبعد ذلك تفرق خلايا جديدة، إعادة إسكانها الغشاء القاعدي الجرحى واستعادة وظيفة إلى الموقع المصاب. بدلا من ذلك، واشارت دراسات أخرى أن الخلايا تنشأ من استبدال الخلايا الجذعية / السلف الموجودة داخل الأنابيب كليون. وفيما يتعلق بعملية neonephrogenesis في الزرد، وقد لوحظت المجاميع الخلوية التالي AKI بواسطة حقن جنتاميسين ^29،30. هذه المجاميع تنضج لاحقا إلى النيفرون الجديدة التي راسيا في الأنابيب القائمة بالفعل ^29،30. القاسم المشترك الذي يوحد كليون الظهارية تجديد وneonephrogenesis هو عامل الغموض الهائل من: في الوقت الحاضر هناك أضعافا مضاعفة المزيد من الأسئلة حول كيفية حدوث هذه المفاخر التجدد من هناك رؤى المتاحة.

حتى الآن، ومع ذلك، العديد من خطوط مثيرة للأدلة تدعم فكرة أن الأبحاث تجديد الكلوي باستخدام الزرد يمكن أن توفر في الواقع رؤى المقارنة ذات الصلة في AKI الإنسان التي قد يكون لها أيضا متعدية المباشر المحتمل ^56-58. الفحص الكيميائي لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تزيد من انتشار الخلايا الكلوية السلف في الجنين الزرد أدى مؤخرا إلى تحديد deacetylase هيستون المانع ميثيل 4- (phenylthio) -butanoate (m4PTB) ^56،57. كشفت إدارة هذا المجمع ليرقات الزرد مع الناجم عن جنتاميسين AKI أن بقاء اليرقات وزادت وتعززت أن انتشار أنبوبي كلوي ^56،58. عندما عولجت فئران مع المعتدل الناجم عن نقص التروية AKI مع m4PTB، وتسارع الانتعاش في مساعدينتقم مع انخفاض في كل من ضمور أنبوبي ودورة الخلية القبض على الخلايا المتكاثرة أنبوبي كلوي ^58. وتشير هذه النتائج إلى أن مسارات طبيعية المسؤولة عن تطوير الكلى الزرد و / أو استجابة التجدد إلى AKI سيتم حفظها مع الثدييات ^56.

وهكذا، في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لندف بصرف النظر آليات تجديد وهما لتحديد مسارات الإشارات التي تشارك ويوفر لهم فهم التفاعلات الزرد واحد سيلة واعدة لتحقيق هذا الهدف المهم في مجال أمراض الكلى. أدوات مثل التسميات خلية كليون الموصوفة في هذا البروتوكول تمثل مجموعة من المقايسات التي يمكن استخدامها لتقييم تكوين الكلوي وظائف في نماذج AKI. علاوة على ذلك، يمكن تطبيقها لوصف النماذج المعدلة وراثيا من مرض في الكلى ويمكن أن توفر طرق لتحديد العلاجات الكيميائية قادرة على تعزيز استعادة هيكل كليون بعد سد الكلويالعمر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Pbs			Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.
1X Pbst			0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.
1X Pbs with 0.05 % Tween			0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X Pbs			Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Fine Forceps	Roboz	RS-1050	Dumont Tweezers Pattern #55
Glass Slide	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Glass Coverslip	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Modeling Clay	Hasbro	Playdoh	Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide Holder	Thermo-Fisher	12-587	Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution			Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 mL with distilled water
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009
Blocking solution			Blocking Solution (for a 10 mL solution): 8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 2 mL of fetal calf serum 150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection	Invitrogen	E6601	We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions.
Alkaline phosphatase wash solution			Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 5 mL of 0.5M EDTA 120 mg of Levamisole 95 mL of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW	Invitrogen	D1844	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW	Invitrogen	D1976	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW	Invitrogen	D1825	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW	Invitrogen	D1817	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine	Vector laboratories	RL-10-32	DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS
Propidium iodide	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield Hard Set Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Micro cover glass	VWR	48393081
Dimethyl Sulfoxide, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Sucrose	Sigma	S0289
EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502
Levamisole	Sigma	L-9756
Tissue Freezing Medium	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380 Adhesive Microscope Slides	Tru Scientific	0380W
Liquid Blocker – Super PAP Pen	Electron Microscopy Sciences	71312
Immuno stain moisture chamber	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Cryostat	Therm	Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC	Filter set used was as follows:  Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.
Compound microscope	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.