ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

Summary

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

Abstract

מודל דג הזברה התפתח כמערכת רלוונטית ללימודי פיתוח בכליות, התחדשות ומחלה. שני כליות דג הזברה העוברית ובוגרות מורכבות מיחידות פונקציונליות הידוע בשם nephrons, אשר שמורות ביותר עם חוליות אחרות, לרבות יונקים. מחקר בדג הזברה הוכיח לאחרונה כי שתי תופעות ייחודיות להתרחש לאחר nephrons המבוגר להיגרם נזק: ראשון, יש התחדשות חזקה בתוך nephrons הקיים המחליף את תאי האפיתל אבובית נהרסו; שני, nephrons החדש לחלוטין המיוצר מאבות כליות בתהליך המכונה neonephrogenesis. בניגוד לכך, נראה שבני אדם ויונקים אחרים יש יכולת מוגבלת בלבד להתחדשות אפיתל נפרון. נכון להיום, את המנגנונים אחראים לתופעות התחדשות כליות אלה יישארו הבינו היטב. מאז כליות דג הזברה מבוגרות לעבור שתי התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis, הם מספקים סעיף ניסיוני מצטייןdigm ללמוד את האירועים הללו. יתר על כן, יש מגוון רחב של כלים גנטיים ותרופתיים זמינים במודל דג הזברה, שניתן להשתמש כדי להתוות מנגנונים התאיים ומולקולריים המווסתים את התחדשות כליות. היבט חיוני אחת של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר קבוצה של טכניקות תיוג כי ניתן להשתמש כדי לאמוד את הרכב כליות ופונקציונליות נפרון המבחן בכליות דג הזברה המבוגר. לפיכך, שיטות אלה הן נרחב החלים על האפיון פנוטיפי העתיד של פרדיגמות מבוגרות דג הזברה פגיעה בכליות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, למשטרי חשיפת nephrotoxicant או שיטות גנטיות של מוות של תאים ממוקדים כגון טכניקת אבלציה תא nitroreductase בתיווך. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הפרעות גנטיות בהיווצרות כליה מבוגרת ויכולות להיות מיושמות גם כדי להעריך את מצב כליות במהלך דוגמנות מחלה כרונית.

Introduction

הכליות היא איבר מורכב המקיים מספר רב של פונקציות פיסיולוגיות בגוף. הפונקציה החשובה ביותר של הכליות היא הפרשת פסולת המטבולית, ומשימה זו כרוכה באופן הדוק עם השמירה על הומאוסטזיס נוזל. הכליות מבצעת עבודות אלה על ידי סינון הדם ויצירת שתן, ואילו במקביל ויסות לחץ דם, רמות אלקטרוליטים, ואיזון חומצה בסיס. צינוריות אפיתל מאוד מיוחדות הנקראות נפרונים לשמש כיחידה תפקודית הבסיסית של הכליות ^1,2. בבעלי חוליות מבוגרות, nephrons מאורגן בדרך כלל בהסדר מותח ביותר המקיף את מערכת ניקוז מרכזית, ובכך מאפשר לצינוריות רבות לארוז לתוך האיבר קטן למדי. לדוגמא, כל כליה אנושית יכולה להכיל מעל 1 מיליון nephrons ^3. יונקים אחרים כמו העכבר להחזיק על סדר 8-10,000 nephrons לכליות ^4. מידת המורכבות של כליות שונות בין יונקים אלה וvert האחרebrates בשל שינויים במספר כולל נפרון והפריסה האדריכלית שלהם בתוך הכליות. מינים של בעלי חוליות בצורה רבות כמו שלושה מבנים רצופים בכליות במהלך פיתוח, וכל אחד מציג טופס הגדלת מורכבות בכל קשור לתרומת נפרון והסדר: pronephros, כליה בינים, וmetanephros. מבנה הכליות האחרון להישמר משמש ככליה מבוגרת איבר בדרך כלל כליה בינים או metanephros ^2. כל טופס בכליות, לעומת זאת, יש לו הרכב מבוסס נפרון ^2.

נפרון הוא סוס העבודה של הכליות והוא אחראי על סינון דם יחד עם הפרשת המטבוליט וספיגה. Nephrons הם מבנים צינוריים פשוטים מורכבים מתאי אפיתל ויש לי ארגון מגזרי, שבו תחומים דיסקרטיים, מאוד מיוחדים האפיתלים מובחנים לבצע משימות ספציפיות. בצו של זרימת תסנין דרך נפרון, יש בדרך כלל שלושה חלקים עיקריים שcomprisדואר כל יחידה: (1) גופיף הכליה, (2) אבובית עם הפרוקסימלי, ביניים, ומגזרי דיסטלי, ו (3) צינור איסוף ^1. אבובית הפרוקסימלי היא אחראית לספיגה החוזרת של מומסים אורגניים, בעיקר חומצות אמינו וגלוקוז ^1. אבובית ביניים (או הלולאה של הנלה) היא אתר מרכזי של רגולציה מלח ומים ^1. לבסוף, כוונון עדין של מלח ויונים אחרים מתרחש באבובית דיסטלי וצינור איסוף ומוסדר מאוד על ידי המערכת האנדוקרינית ^1. משם, התסנין עובר דרך השופכן ושלפוחית ​​השתן, סופו של דבר לצאת מהגוף כתוצר פסולת ^1.

אובדן התפקוד הכלייתי יכול לנבוע ממספר רב של גורמים המונעים פעילות נפרון נורמלית. גורמים אלה יכולים להתרחש במהלך התפתחות כליות, למשל, מומים מולדים הגורמים לעיוות של nephrons ^5, או גורמים מסוגים שונים של פציעה (שנובעים משני גנטי וenvironmeמקורות פתיחות opening סגירות closures). פציעות שנרכשו מסווגות רחב כפגיעה אקוטית בכליות (AKI) או פגיעה כרונית בכליות (CKD). AKI כרוך אובדן פתאומי של תפקוד הכלייתי, לעתים קרובות כתוצאה מאיסכמיה או רעלן החשיפה ^6,7. ביונקים, תיקון אפיתל נפרון הוא אפשרי לאחר פציעות כגון ^8, ואנשים רבים להציג שיקום מלא של תפקוד הכלייתי לאחר AKI. עם זאת, AKI קשור גם גבוהה תחלואה ותמותה שדווחו ברחבי 30 רחב - טווח שכיחות 70% ^6,7. מחלת כליות כרונית, לעומת זאת, קשורה לאובדן הדרגתי של תפקוד כליות כתוצאה משנים של נזק ממושך, בדרך כלל קשור עם סיסטיק ^8,9. יתר על כן, יחסי גומלין קיים בין AKI וCKD, כמו גם אחד יכול להטות מראש פרט ^ל10-12 האחר. לדוגמא, אלה שסבלו מAKI רגישים יותר למחלת כליות כרונית ואף למוות ^13. השכיחות של מחלת כליות, גם בארה"ב ובעולם, הגיעה epideפרופורציות ומיקרופון צפויים לעלות כאוכלוסייה בגילים מתרחבת-לכן יש צורך הולך וגדל לזהות התערבויות רפואת רגנרטיבית לכליות ^14,15.

למרות הידיעה שחולי AKI יכולים לשחזר, זה כבר זמן רב חשב כי הכליות הוא איבר ללא סמכויות משובי מולדים. השקפה מסורתית זו תוקן באופן דרמטי בשנים האחרונות ^16. מחקרים חוקרים נזק כלייתי בעכברים וחולדות לאחר AKI הראו כי תאי אפיתל אבובית נפרון יכולים להתרבות ולבנות מחדש nephrons הפונקציונלי ^17-20. למרות יונקים בעלי יכולת הסתגלות זה להתחדש nephrons, יש מגבלות בולטות ותגובות הסתגלות יכולה להיות מופעלות על אשר תוביל לסיסטיק כליות ומחלת הכליות כרוני ^21. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי אבלציה תאי אפיתל החוזרת ונשנית בnephrons העכברי הייתה קשורה עם התחדשות מצומצמת וnephrons מרמז-סיסטיק כליות havea מוגבל סף התחדשות ^22. אין ראיות לכך שהכליות של יונקים הבוגרים מהוות nephrons החדש כדי להחליף את אלה שאבדו או ניזוקו, ובכך ההרס שלהם מוביל לגירעון נפרון ^8,9 קבוע. מעניין, כמה בעלי חוליות מגיבות לאקי על ידי התחדשות epithelia נפרון וגם על ידי הפקת nephrons החדש, תהליך המכונה neonephrogenesis או נפרון neogenesis ^23. Neonephrogenesis מתרחש בדגים לאחר חשיפת רעלן או כריתה חלקית, ומודלי פציעה באופן הסטורי כללו את דג הזהב ^24,25, אמנון ^26, להחליק ^27, medaka ^28, ולאחרונה, דג הזברה ^29,30. מתוכם, דג הזברה לספק מודל מחקר גנטי קיימא לגלות מסלולים התאיים ומולקולריים אחראים להתחדשות כליות.

במאמר זה וידאו, אנו מדגימים כיצד לתייג מגזרי נפרון בדג זברה מבוגרת. ידע של האנטומיה נפרון, תכונות מולקולריות,ומאפיינים פונקציונליים חיוניים למחקרי כליות עתיד מוצלחים באמצעות דג הזברה. כליות דג הזברה מבוגרת היא מבנה כליה בינים והוא מטבעו פחות מורכב במונחים של מספר נפרון וארגון מאשר מבנה metanephros מצא ביונקים בוגרים, avians, וזוחלים ^{ביום 31 ב.} עם זאת, ארגון קטע נפרון דג הזברה הוא דומה ליונקים, ותועד לראשונה בכליה העוברית מבוססת על מחקרי ביטוי גני ^31-35. nephrons עובר דג הזברה מכיל מקטעים ליניארי אבובית הכוללים הפרוקסימלי אבובית המפותלת (PCT), אבובית הפרוקסימלי ישרה (PST), דיסטלי המוקדם (DE), ודיסטלי מאוחר (DL) ^31-35 (איור 1). nephrons המבוגר דג הזברה יש מגזרים צינורי דומים ^30,31,36,37 (איור 1). PCT יכול גם להיות מזוהה על ידי פנוטיפ פונקציונלי: תאי האפיתל בPCT ישלבו תרכובות שכותרתו fluorescently dextran (10-70 KDA בגודל) נוכחת בבמחזור, אשר שימוש בו בשתי כליות דג הזברה העוברית ובוגרות להעריך ספיגת endocytic על ידי התאים אלה אבובית הפרוקסימלי ^38-41 (איור 1). הבדל אחד במגזרי נפרון בין דג הזברה ויונקים הוא שדג זברה חסר אבובית ביניים, או לולאה של Henle ^30-37; מאז פונקציות מגזר זה ביונקים כדי לחסוך במים, ודג זברה הן מיני מים מתוקים בלי דחיפות להתרכז השתן שלהם, אין זה מפתיע שדג זברה חסר מגזר זה ^32,33. לפיכך, הרכב נפרון הכולל נשמרת במידה רבה בין דג הזברה והכליות של יונקים ^32,33. קווי דמיון אלה אפשרו דג הזברה להיות כלי מחקר יעילים כדי לחקור את הפונקציות של גנים הביעו כליות במהלך nephrogenesis התפתחותית ^32-35,42 ולהדגים מחלות כליה רבות ^43,44, ובכך מוסיף לרשימה המשמעותית של תנאים אנושיים שיכול להיות נחקר באמצעותדג הזברה ^45,46.

היום, בכליות דג הזברה מבוגרת היא מודל אטרקטיבי ללימודים השוואתיים של התחדשות כליות עקב tractability הגנטי שלו וחיך הרחבת של משאבים טכנולוגיים העומד לרשות לחקור את תפקוד גן ומסלולי איתות במין זה. מספר מחקרים השתמשו בכליה ביני דג הזברה כדי לחקור את המנגנונים של התחדשות לאחר AKI ^29,30,37. למחקר AKI המשיך באמצעות כליות דג הזברה מבוגרת, זה הכרחי יש שיטות מעודנות לתייג אזורי נפרון שונים ושיטות סקר פונקציונלי נפרון. מספר שיטות לניתוח בכליות מבוגר הותאמו מפרוטוקולי כליה עובריים. זריקת intraperitoneal של dextran שכותרתו fluorescently בדג הזברה המבוגר תוויות האפיתל PCT בnephrons כליה בינים באמצעות אנדוציטוזה ^30, כמו בעוברי דג הזברה ^38-41 (איור 1). שיטה זו נעשתה שימוש כדי visualizדואר כאשר צינוריות הפרוקסימלי חזרה את רכושם reabsorbing הבאות AKI, המאפשר הערכה אחת של פונקציה פיזיולוגית המשוחזר ³⁰ (איור 1). תכונה נוספת של אבובית הפרוקסימלי נפרון היא שתאי האפיתל במגזר זה יש גבול מברשת ³⁷ שמראה רמות גבוהות של פעילות phosphatase אלקליין אנדוגני. לפיכך, האפיתל הפרוקסימלי יכול להיות מקומי חזותי בכליות דג הזברה מבוגרות תוך שימוש בטכניקת הקרינה מבוססת הידוע בשם (הקרינה אנזים שכותרתו) ELF- -97 ^47.

כאן, אנו מתארים כיצד לבצע מבחני ספיגת dextran ניאון ^30,48 בכליות דג הזברה מבוגרות, כדי להשיג הערכה תפקודית של אבובית הפרוקסימלית ולמפות את הגודל וקווי מתאר של קטע אבובית זה. בשלב הבא, אנו מתארים טכניקות לתייג אזורי אבובית הפרוקסימלי של נפרון המבוגר עם phosphatase אלקליין תווית הניאון. שלישית, אנו מציגים בפעם הראשונה שRhodאמין מתויג הקטינים Dolichos biflorus agglutinin (DBA), אשר שימש כסמן כללי של צינורות האיסוף בכליות של היונקים ^49, מסמן את המבנים צינוריים של הכליה דג הזברה מבוגרת. כDBA הוא מוציאים לצביעת phosphatase אלקליין, תוויות אלה מספקים דרך להבחין מחבת-הפרוקסימלי לעומת מתיחות מחבת-הדיסטלי של נפרון דג הזברה המבוגר באופן רחב. אורך יישום כתמי ניאון אלה בשני הר שלם וסעיפים היסטולוגית cryostat, אנו לתאם תוויות אלה עם תחומים ביטוי של גני טרנספורטר המומס כי לזהות כל מגזר נפרון. לכן פרוטוקול זה מכיל גם מדריך לנהלים שונה רקמת עיבוד להר שלם רקמות בוגרות בכלאה באתר ניתוח (לוואי) המבוססים על פרוטוקול מאחלי העובר שלנו ^50. נהלים אלה יכולים להיות o משמשים בשילובים שונים (איור 2) לתיעוד תכונות מורפולוגיות ותפקודיותnephrons הכליה דג הזברה המבוגר f. כך, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים אלה ללימודי התחדשות, האפיון פנוטיפי של מודלים מחלת כליות אחרים, ואפילו בשימוש ללמוד היווצרות של הכליה מבוגרת.

Protocol

הנהלים לעבודה עם דג הזברה שתוארה בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת הנוטר דאם. הערה: מדריך לאנטומיה בכליות ונפרון בדג הזברה מסופק (איור 1). סקירה של השיטות שתוארו בפרוטוקול זה מסופקת כתרשים זרימה (איור 2) כדי להמחיש כיצד מרובה תיוג נהלים יכולים להתבצע על המדגם זהה בכליות. לחלק 7 על הכנת מאחלים ללימודים בכליות מבוגרות, הצעדים הניתנים כאן מצביעים כיצד לשנות את העיבוד של עוברי דג הזברה, כפי שפורסם לאחרונה ^50, כדי לספק מדריך טכני לניתוח מאחלים מוצלח של איבר הכליות.

.1 למבוגרים הזרקת דג הזברה Intraperitoneal עם Dextran של ריבית

1. הכן את רצוי מניית שכותרתו fluorescently dextran (ים) על ידי המסת אבקת dextran במים מזוקקים בריכוז50 מ"ג / מ"ל, ואז לאחסן aliquots בצינורות microcentrifuge ב -20 ºC בחושך. הערה: dextrans שכותרתו fluorescently שונה זמין באופן מסחרי. בחר את dextran לשימוש המבוסס על השילוב של תוויות אחרות שרצויות, ולוודא את מסנני הניאון המתאימים זמינים עם המיקרוסקופים שישמשו. dextrans ליזין-ניתן לתקן להראות הקרינה ללא כל צעדי תיוג נוספים בדגימות חיים, דגימת רקמה מבולבלת מדגימות מורדמים, ודגימות קבועות.
2. להפשיר את מניית dextran הרצויה ולאחסן על קרח בחושך בעת ביצוע צעדים 1.3-1.5. לעטוף את צינור microcentrifuge בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור בזמן הטיפול.
3. הרדימי דג הזברה מבוגרת בין 5-7 חודשים בגיל על ידי הצבת את הדג לצלחת המכילה גם tricaine 0.02% או 0.001% 2-phenoxyethanol כ 1 - 2 דקות. הערה: עדיף להשתמש בדג זברה מבוגרת של טווח הגילים הזה בגלל שדגים צעירים יכולים להיות SMAכליות ll שקשה לנתח, ודגימות כליות מדגים ישנים יכולים להכיל המונים של רקמת צלקת שלא ניתן לנתח. כשהרדים כראוי, דג הזברה המבוגר לא להציג תגובה לגירוי לגעת, אשר יכול להיבדק על ידי שימוש בכפית או בדיקה בוטה לגעת סנפיר הזנב של הדג בעדינות.
4. בעזרת כף פלסטיק, להרים את הדג מהצלחת, למזוג את הפתרון ואת המקום בזהירות את החיה על עובש ספוג רטוב, את צד הגחון.
5. באמצעות מזרק אינסולין 1.0 סמ"ק ביום 31 בG, להזריק 20 μl של פתרון מניות dextran מופשר למרחב intraperitoneal. כוון את המחט כך ההכנסה שמתרחשת בזווית רדודה על קו האמצע הגחון של הבטן. כדי להימנע מניקוב איברים, להכניס את המחט ולאחר מכן מעט להעלות אותו כדי להרים את קיר הגוף של הדג וליצור מרחב שבו מזריק את פתרון dextran ^48. הערה: לחלופין, יכולה להיות מדוללת המניה dextran, למשל, ביחס של 1: 2 או 2: 1 (dextran: דיסעבדו מים), כדי להפחית את הקרינה רקע במדגם.
6. בעדינות להחזיר את הדגים לאקווריום כדי לאפשר התאוששות מן ההרדמה. הערה: ספיגה של dextran ידי מגזר אבובית הפרוקסימלי מתרחשת בתוך 8 - שעה 12 וניתן לאתר לפחות עד 3 ימים לאחר הזרקה (dpi). ניתוח ב3 dpi מספק אות אבובית חזקה עם הקרינה רקע נמוכה באוכלוסיות סטרומה כליות. המשך חלק 2 לבדיקת הר שלמה של ספיגת dextran לבד, אם תיוג נוסף אינו רצוי. לתיוג קומבינטורית, המשך חלק 3 כדי להכין את הרקמה לבדיקת הר שלמה של ספיגת dextran, אז חלק 4 לכפול תווית עם phosphatase ו / או חלק 5 אלקליין, לבצע כפול DBA או משולש תיוג. למחקר באמצעות סעיפים היסטולוגית, להמשיך לחלק 6 להנחיות בדבר איך לגרום לחלקים עדינים של הכליות באמצעות cryostat ואיך להכתים אלה עם תוויות ו / או אימונוהיסטוכימיה שונות עם אנטיב הראשוני והמשניodies.

.2 Dissection ושטוח הר הכנה של הכליה דג הזברה למבוגר מדוגמא חיה שאינה מקובעת למדמיינים פלורסנט Dextran תיוג של אבובית הפרוקסימלי

1. להרדים את דג הזברה המבוגר מוזרק dextran על ידי הצבת אותו לתוך צלחת עם 0.2% pH Tricaine 7.0 עבור 4 - 5 דקות. הערה: ודא שהדג כבר מורדמים לפני שימשיך, על ידי ניטור בזהירות אם הזימים חדלו תנועה והלב הפסיק לפעום ^36.
2. בעזרת כף פלסטיק, להרים את הדג מפתרון Tricaine, למזוג את הפתרון והמקום חי על מגבת רקמה או נייר.
3. השתמש בזוג מספריים חד לנתיחה כדי לעשות חתך מאחורי operculum הזימים ולהסיר את הראש.
4. מייד לפתוח את הגוף של הדג עם המספריים לנתיחה על ידי ביצוע חתך הגחון ארוך מהראש לבסיס של סנפיר הזנב.
5. הסר את האיברים הפנימיים של הדג בעזרת זוג מלקחיים בסדר.
6. השתמש במחטים לנתיחה סופר בסדר להצמיד פתוח גוף קירות כדי לאפשר להדמיה של איבר הכליות, אשר דוגל בקיר הגב של בעלי החיים.
7. השתמש במלקחיים עדינים לנתק את הכליה מהקיר הגבי.
8. מניח בעדינות את הכליה לתוך בקבוקון זכוכית 5 מ"ל מכיל 1X PBS ולשטוף 3 פעמים עם 3 - 5 מ"ל של טרי 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד. הערה: השימוש בבקבוקון זכוכית לטיפול בדגימות כליות בוגרות מאפשר הדמיה של הרקמות ומאפשר לשטיפה עם כמויות גדולות (יחסית למסת הרקמה) של כ 3 - 5 מ"ל. לחלופין, ניתן להשתמש בצלחת תרבית תאי 12 גם. ניתן אמנם להשתמש בצינור microcentrifuge פלסטיק, הצינורות בגודל הסטנדרטי (1.5 מ"ל) יכולים להגביל את הכביסה.
9. הסר את הכליות עם pipet העברה ומקום על גבי זכוכית נקייה עם 1-2 טיפות של 1X PBS.
10. השתמש במלקחיים עדינים כדי לשטח את הכליה בשקופית, כדי לוודא שאין רקמות מסולסלות או אחרת התהפכועל עצמו. הערה: לחלופין, כלי תיל טונגסטן יכול לשמש כדי להפוך את החתכים קטנים ברקמת החיבור כדי להקל על מיצוב שטוח של הכליות.
11. מניחים חתיכות קטנות של פלסטלינה בכל פינה של coverslip מ"מ זכוכית 18 x 18 ולהגדיר את coverslip הכליות לאט. הערה: מעט זווית coverslip במהלך ההשמה כדי למזער לכידת בועות אוויר בפתרון ^50. Divots פלסטלינה הם כ -2 מ"מ קוטר (איור 2 א). לחלופין, divots של שומן ואקום ניתן להחליף במקום פלסטלינה. להוסיף טיפה נוספת של 1X PBS כדי למלא את החלל שבין שקופיות coverslip וזכוכית במידת צורך.
12. שימו לב ו / או תמונה בכליות על ידי הצבת שקופיות הזכוכית לתוך שדה הראייה במיקרוסקופ סטראו או תרכובת עם המסנן המתאים. הערה: עיין באיור 2 א למראה מקרוסקופית של הכנת שקופית זו.

.3 Fixation, Dissection, permeabilization והסרת פיגמנטציה של הכליה דג הזברה למבוגר

1. הכן פתרון מקבע טרי של paraformaldehyde 4% (PFA) / DMSO% 1X PBS / 0.1 או להפשיר aliquot קפוא של PFA 4% / 1 X PBS ולהוסיף 0.1% DMSO. זהירות: PFA הוא רעיל ויש לטפל פתרונות PFA במנדף כימי בעת לבישת ציוד מגן אישי מתאים, הכולל כפפות וחלוק מעבדה. בנוסף, אבקת PFA יש לטפל בזהירות בעת ביצוע פתרון המניות.
2. מלא מגש לנתיחה עם פתרון מקבע מספיק כדי להטביע את כל בעלי החיים.
3. להרדים והר דג הזברה שנבחרה בפתרון קיבעון (מתייחס לשלבים 2.2-2.6). הערה: הדגים שנבחרו יכולים להיות דגימה לא טופלו דג הזברה כליה, או בכליות מבודדות מדג זברה שקיבלה זריקת intraperitoneal dextran (חלק 1) בעבר.
4. תקן O המדגם / N (12-16 שעות) בשעה 4 ^{מעלות צלסיוס}
5. למחרת, להשתמש במלקחיים בסדר אכפתלנתק באופן מלא את הכליה מן קיר גוף הגב והנח את האיבר לתוך בקבוקון זכוכית באמצעות pipet העברה. הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בצלחת תרבות 12 גם או 24 גם. ניתן אמנם להשתמש בצינור microcentrifuge פלסטיק, הצינורות בגודל הסטנדרטי (1.5 מ"ל) יכולים להגביל את הכביסה.
6. שטוף את הכליות גזורים 3 פעמים עם 3 - 5 מ"ל של 1X PBS עם Tween 0.05% במשך 5 דקות כל אחד.
7. הסר את PBS 1X עם 0.05 Tween% ולשטוף את הכליות עם 3 מ"ל של פתרון 5% סוכרוז (ב1X PBS) למשך 30 דקות.
8. החלף עם 3 מ"ל של תמיסת 30% סוכרוז (ב1X PBS) וO חנות / N (12-16 שעות) בשעה 4 ^{מעלות צלסיוס} הערה: פתרונות סוכרוז permeabilize ממברנות תאים, לאחר מכן מאפשר תיוג ספציפי של חומרים כימיים כמו שהם חודרים לרקמה.
9. למחרת, להסיר את תמיסת סוכרוז 30% ולשטוף את הכליות 2 פעמים עם 5 מ"ל של 1X PBS עם Tween 0.05% במשך 5 דקות כל אחד.
10. החלף את PBS 1X עם Tween 0.05% עם 3 -5 מ"ל של תמיסת הלבנה כדי להסיר את הפיגמנטציה melanocyte הנוכחית על איבר הכליות.
11. הנח בקבוקון זכוכית על הכתף ולצפות בזהירות כמו פיגמנטציה נעלמת. הערה: depigmentation בדרך כלל לוקח כ 20 דקות כאשר היא מבוצעת לאחר טיפול סוכרוז, אבל מדי פעם אפשר לקחת עוד 60 דקות. אם פתרון ההלבנה נשאר בכליות במשך זמן רב מדי, התפוררות של האיבר יכולה להתרחש; מומלץ לעקוב אחר המדגם כל דקות 10-15 כדי לבדוק שלמות רקמות.
12. כאשר פיגמנטציה הוסרה מהכליה, לשטוף פעמיים עם 3 - 5 מ"ל של 1X PBS עם Tween 0.05%.
13. החלף את PBS 1X עם Tween% 0.05 עם 3 - 5 מ"ל של 4% פתרון PFA עבור שעה 1 ב RT.
14. הסר את 4% פתרון PFA ולשטוף את הכליות 3 פעמים עם 3 - 5 מ"ל של 1X PBS עם Tween 0.05% במשך 5 דקות כל אחד. הערה: לאחר הקיבעון הוא מלא, בכליות יכולות גם להיות מותקנות על שקופית זכוכית והערכה לsans ספיגת dextran pigm melanocyteentation, על ידי ביצוע צעדים 2.8-2.12.
15. הסר את PBS 1X עם Tween 0.05% ולהחליף עם 3 - 5 מ"ל של תמיסת חסימה, אז דגירה הכליות ב RT בבלוק לשעה 2.
16. בעת החסימה היא מלאה, להמשיך ישירות לפרוטוקול מכתים נבחר. הערה: בכליות עכשיו יכולות להיות מעובד באמצעות אחד או יותר נהלים אחרים על מנת לבצע מחקרי תיוג עם חומרים כימיים שונים. לתיוג הר השלם של אבובית הפרוקסימלי עם phosphatase אלקליין בלבד, להמשיך לסעיף 4 לתיוג הר השלם של אבובית דיסטלי רק ללכת לסעיף 5 לחלופין, סעיפים 4 ו -5 ניתן לבצע ברציפות ליניארית לגילוי כפול בהר שלם .

.4 תיוג המגזרים הפרוקסימלי אבובית כליה למבוגרים עם אלקליין phosphatase איתור

1. להסיר את החסימה ולשטוף את הכליות 3 פעמים עם 3 - 5 מ"ל של 1X PBS עם Tween 0.05% במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן להחליף את PBS 1X עם Tween% 0.05 עם 3 - 5 מ"לשל 1X PBS. בואו הכליות לספוג לפחות 10 דקות. הערה: במהלך תקופה זו, להעביר את הכליה למנת תרבות 12 גם או 24 גם אם הרקמה נשמרה בבקבוקון זכוכית למדרגות עיבוד קודמים.
2. החלף את PBS 1X עם פתרון מצע phosphatase אלקליין מספיק העבודה (עיין בערכה לגילוי ממוקם בטבלה של חומרים) כדי לכסות את המדגם, ואז למקם את המדגם על הכתף ל30 דקות ב RT. שמור את המדגם המוגן מפני אור.
3. לעצור את התגובה על ידי שטיפה בכליות בפתרון חיץ לשטוף phosphatase אלקליין.
4. יש לשטוף את הכליות עם 3 שינויים של פתרון חיץ לשטוף מעל 10 - 15 דקות. הערה: לאחר שלב זה, להמשיך ישירות לחלק 5, שלב 5.1 (ובכך באופן זמני השמטת צעדים 4.5-4.6) אם תיוג עם DBA גם רצוי. שלב אופציונאלי: כדי לתייג ולדמיין גרעיני תאים באיבר, להשרות את הכליות בפתרון יודיד propidium. הכן מלאי יודיד propidium על ידי המסת האבקה בconcentration של 1 מ"ג / מ"ל ​​(1.5 מ"מ) במים מזוקקים. לדלל את המניות ל500 ננומטר ב2X SSC ו דגירה בכליות בפתרון זה למשך 30 דקות. לשטוף עם 1X PBS והמשך לשלב 4.5.
5. הסר את הפתרון לשטוף חיץ והר הכליות לשקופית זכוכית נקייה בהרכבה בינוני phosphatase הכלול בערכת התיוג (עיין בשלבים 2.9-2.12). הערה: ההרכבה בינונית החליף את PBS 1X מצעד 2.9.
6. דמיין את phosphatase אלקליין המוכתם בכליות באמצעות מיקרוסקופ סטראו או תרכובת עם סט / מסנן DAPI Hoechst. הערה: שלב אופציונאלי: דמיין את יודיד propidium באמצעות tetramethyl-rhodamine (TRITC) או מסנן אדום טקסס.

.5 סימון מגזרי דיסטלי אבובית כליה למבוגרים עם Rhodamine DBA

1. הכן פתרון DBA עובד 200 μl על ידי דילול DBA (2 מ"ג / מ"ל) 1: 100 ב1X PBS.
2. החלף את PBS 1X עם 0.05% פתרון Tween עם פתרון DBA 200 μl.
3. מניחים על הכתף לשעה 1 בRT.
4. הסר את פתרון DBA ולשטוף את הכליות 3 פעמים עם 3 - 5 מ"ל של 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד. הערה: שלב אופציונאלי: כדי לתייג ולדמיין גרעיני תאים באיבר יחד עם תווית DBA, להשרות את הכליות בפתרון DAPI לזהות עם מסנן Hoechst / DAPI (כתם DBA rhodamine יכול להיות מזוהה עם TRITC או מסנן אדום טקסס). הכן מלאי DAPI על ידי המסת אבקה בריכוז של 5 מ"ג / מ"ל ​​(14.3 מ"מ). לדלל את המניות ל300 ננומטר ב2X SSC ו דגירה בכליות בפתרון זה עבור 20 דקות. לשטוף עם 1X PBS והמשך לשלב 5.5. אם חלק 4 עיבוד שבוצע, יש לזכור כי DAPI וphosphatase אלקליין שניהם מזוהים עם מסנן / DAPI Hoechst.
5. הסר את PBS 1X והר הכליות בשקופית זכוכית נקייה (ראה צעדים 2.9-2.12).
6. דמיינו את מגזרי דיסטלי מוכתם DBA של הכליות באמצעות מסנן אדום סטנדרטי TRITC או טקסס נקבע על מיקרוסקופ סטראו או מתחם ניאון. הערה: s אופציונאליTEP: דמיין את DAPI באמצעות מסנן / DAPI Hoechst.

.6 הטבעה, Cryosectioning והכתמה (צבעים חיוניים ואימונוהיסטוכימיה תיוג) של רקמת כליה דג הזברה למבוגר

1. בחר דגים לניתוח, ולאחר מכן להרדים, לתקן, וpermeabilize כפי שתואר (צעדים 3.2-3.8). הערה: תקן דגים בוגרים ב9: 1 אתנול: DMSO פורמלדהיד / 0.1% במקום paraformaldehyde 4% / 1X PBS / DMSO 0.1% עבור הליך cryosection לייצר חלקים עבור dextran, phosphatase אלקליין, ויזואליזציה DBA. עם זאת, יש לזכור כי קיבעונות מבוססי paraformaldehyde יכולים להיות תואמים למספר הליכי אימונוהיסטוכימיה. יתר על כן, הלבנה של הכליה מבוגרת אין צורך לניתוח cryosection, כי מלנוציטים הם שטחיים ואינו משפיעים על ויזואליזציה של תאי נפרון המרכיבים את "בתוך" של איבר הכליות.
2. למחרת, להסיר את תמיסת סוכרוז 30% ולהחליף עם 1: מדיום הקפאת 1 רקמה: 30 sucros%דואר ל4 שעות ב RT.
3. הסר את 1: פתרון 1 ולהטביע דגימות כליות ברקמת 100% הקפאה בינוני בcryomolds ומקום ב -80 C ^o במשך שעה לפחות 1.
4. רוחבי לחתוך קטעי סדרתי, כ מיקרומטר 12 עבים, דרך כל הכליה הבוגרת.
5. הר cryosections הקפוא על גבי שקופיות מיקרוסקופ דבק ולאפשר לאוויר יבש לשעה 1 ב50 ^o C.
6. חנות מחליקה ב -80 C ^o עד לשימוש.
7. כאשר cryosections מוכן להיות מתויג, להסיר את שקופיות מיקרוסקופ מC -80 ^o ומניחים על שקופית חמה ב50 C ^o 45 דקות.
8. באמצעות עט חוסם נוזלי, לצייר עיגול סביב cryosections ולתת להתייבש במשך 15 דקות בשקופית חמה ב50 ^o C.
9. הסר שקופיות מהשקופית חמה ומקום שטוח בתא לחות ב RT.
10. רעננות cryosections ידי הוספת 1X PBS עם Tween 0.05% לחלק המכותר של השקופיות עבור 20 דקות. הערה: כ 200-300 &יש צורך בליטר כדי לכסות כל חלק מכותר בשקופית; # 956.
11. החלף את PBS 1X עם 0.05% פתרון Tween עם טרי 1X PBS ודגירה של 10 דקות.
12. הסר 1X PBS ודגירת cryosections בפתרון חסימה לשעה 2. הערה: לקבלת 10 מ"ל פתרון חסימה, לשלב 8 מ"ל 1X PBS עם Tween 0.05%, 2 מ"ל עוברי עגל בסרום ו150 μl DMSO. כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה לאחר שלב החסימה, דגירה השקופיות עם הנוגדן הראשוני הרצוי המדולל בO בלוק הטרי / N ב 4 ^o C, לשטוף פעם באמצעות 1X PBS עם Tween 0.05%, דגירה השעה 2 ב RT עם פתרון נוגדנים משני בדילול מלא ב 1X PBS עם 0.05 Tween%, לשטוף פעם באמצעות 1X PBS עם Tween 0.05%, והר coverslip בשקופית עם ההרכבה בינונית. דילולים הנוגדן הנדרשים ישתנו ויש לבצע ניסויים כדי לבחור את דילולים אופטימליים. אחזור Antigen יכול גם להקל immunolabeling, ומתבצע לפני החסימה. מייד לאחר שקופיות מופשרות ב50 ^o C(שלב 6.8) דגירה cryosections בין 95 ^o C ^o C-100 ל40 דקות במאגר ציטרט הנתרן 10 מ"מ שחומם מראש. לקרר את השקופיות עבור 30 דקות, לאחר מכן לשטוף פעמיים ב1X PBS עם 0.05 Tween%, והמשך לשלב 6.11.
13. הסר את פתרון החסימה ולשטוף cryosections 3 פעמים עם 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד.
14. החלף 1X PBS עם פתרון מכתים DBA ודגירה עבור שעה 1. הערה: לדלל DBA μl 1 ב99 μl של 1X PBS לעשות פתרון מכתים 100 μl.
15. הסר את הפתרון מכתים DBA ולשטוף cryosections 3 פעמים עם 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד.
16. החל תווית phosphatase אלקליין ולדגור על cryosections עבור 10 דקות.
17. לשטוף phosphatase אלקליין את cryosections עם סדרה של 3 שוטף של חיץ לשטוף 10 דקות כל אחד. הערה: לקבלת של חיץ כביסה פתרון 100 מ"ל, לשלב 5 מ"ל של 0.5 M EDTA ו120 מ"ג של levamisole ל95 מ"ל של 1X PBS. לתייג גרעינים, דגירה סעיפי propidium יודיד או DAPI בdilutions שצוין קודם לכן (שלבי 4.4, 5.4, בהתאמה) ל30 דקות ב RT. בחר כתם גרעיני בקנה אחד עם השילוב של כתמי ניאון אחרים שנבחרו.
18. הסר את כל הנוזל מcryosections ומניח את 2 טיפות של מדיום הרכבה בשקופית מיקרוסקופ.
19. בזהירות להניח מכסה זכוכית מיקרו לשקופית מיקרוסקופ. Cryosections מוכן כעת לתמונה עם המסנן המתאים (ים).

עיבוד מאחלים .7 לדוגמאות כליות דג הזברה למבוגר

1. בחר את הדגימה הרצויה דג הזברה (ים), להרדים, לתקן ולנתח את הכליה כפי שתואר (צעדים 3.1-3.5). הערה: זה חיוני כדי להשתמש בפתרון מקבע של paraformaldehyde 4% (PFA) / 1X PBS עם DMSO 0.1% לpermeabilize הכליות. מניחים את הכליות לתוך בקבוקון זכוכית להדמיה קלה במהלך שלבי עיבוד שלאחר מכן.
2. הסר את מקבע ולשטוף את הכליות פעמיים עם 5 מ"ל של 1X PBST.
3. הסר את PBS 1X ולשטוף את הכליות wi פעמייםה 100 מתנול%, אז דגירה הכליות ב -20 מעלות ^o לפחות 20 דקות לpermeabilize. ניתן לאחסן כליות גזור ללא הגבלת זמן -20 ^o ג: הערה
4. רעננותם הכליה על ידי ביצוע סדרה של 5 שטיפות דקות עם 3 - 5 מ"ל של 50% מתנול / 1X PBST, 30% מתנול / 1X PBST, ופעמים עם 1X PBST.
5. להלבין את הכליות כדי להסיר פיגמנטציה כפי שתואר (צעדים 3.10-3.14).
6. פנק את הכליות עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteinase K / 1X PBST עם 0.1% DMSO עבור 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 1X PBST והודעת תיקון-PFA 4% / 1X PBST עבור 20 דקות לO / N. הערה: תמיד להכין proteinase K פתרון עובד באופן מיידי לפני עיכול מדגם על ידי שילוב של 50 μl של מניית K proteinase המופשר טרי (10 מ"ג / מ"ל), 50 מ"ל של 1X PBST, ו50 μl של DMSO.
7. לעבד את הכליה למאחלים יחידים או כפולים בהתאם לשלבים לסינתזת riboprobe, prehybridization, הכלאה, אנטי digoxygenin / דגירה נוגדן אנטי fluoroscein וdetection כמו לאחרונה תאר ^49. הערה: כל הר הדמיה של כתמי כליות צריכה להתבצע תוך מספר ימים לבצע את התגובה מכתימה. כתמי נפרון נוטים לדהות מהר מאוד, במיוחד תוויות מצע אדומות. לצילום נפרון, שטוח הר מדגם הכליה כפי שתואר לעיל בשלבי 2.10-2.12, ותמונה באמצעות מיקרוסקופ סטריאוטיפים או תרכובת. יכולים להיות מועסקים מסנני התערבות ההפרש לעומת זאת כדי להמחיש טוב יותר את קווי המתאר הסלולריים של nephrons כדי להקל על ניתוח מדגם.

תוצאות

כל אחד מהפרוטוקולים בוצע על דג הזברה סוג בר. דוגמאות לנתונים המתקבלים מסמך ההרכב הנורמלי מבני ומאפיינים של nephrons בתוך כליות דג הזברה מבוגרת הבריאים. דג הזברה המבוגר בעל כליה בינים, או בצורת כליה שנייה שממוקמת על קיר הגוף הגבי (איור 1 א). הכליות בוגרות היא שטוחות יחסית ומכילה את הראש מה שנקרא, תא מטען, ובאזור זנב עם מלנוציטים שטחיים הפזורים ברחבי האזורים אלה (איור 1 א). רקמת הכליה מכילה מסועפת מערכים של nephrons שמתחברים ומתנקזים לתעלות מרכזיות איגום (איור 1 א). כל נפרון מקוטב לאורכו, עם מסנן דם (או גופיף כליה) בקצה אחד, ואחריו סדרה של קטעי אבובית, ומסתיים לבסוף בצינור שאוסף את הפתרון שיהיה מופרש (איור 1 א). כל אבובית נפרון הבוגר מכילה Segmen הפרוקסימלית ומ דיסטליts של תאים, מוגדר על ידי הביטוי של מובילים מומסים ספציפיים ^30,31,36,37, שנשמר עם הדפוס המגזרי הוצג על ידי nephrons העוברי ^31-35 (איור 1). לדוגמא, תעתיקי cubilin לסמן הפרוקסימלי אבובית ³⁹ (PCT וPST) ותמלילי clcnk לסמן אבובית דיסטלי ³² (DE וDL) (איור 1). יתר על כן, מגזר PCT מתאפיין בביטוי של slc20a1a, PST הוא מכובד על ידי ביטוי של slc13a1, DE מתאפיין בביטוי של slc12a1, וDL מתאפיין בביטוי של slc12a3 ³²   (איור 1). הבדלים בין צינוריות נפרון המבוגר בהשוואה לעוברית שבם הם שמגזרי דיסטלי להציג פיתולים (DE, DL) וענפי מגזר DL בהרחבה במבוגרים, והוא שונה ליניארי, האנטומיה הלא מסועפת של אזורים אלה בembr^30,31,36,37 (איור 1 א) יו. בשני המבוגרים ^{30 ו38-41} העוברי tubules נפרון, האפיתל PCT ניתן להבחין בשל מאפייני endocytic ויכול להיות דמיין והעריך לתפקוד reabsorptive מבוסס על היכולת הספיגה conjugates ניאון dextran (איור 1). יתר על כן, כפי שהודגם בדמויות שלאחר מכן, אבובית המבוגר הפרוקסימלי (PCT וPST, או באזור פאן-הפרוקסימלי) מסומן על ידי phosphatase אלקליין, בעוד אבובית דיסטלי (DE וDL, או האזור פאן-דיסטלי) מסומנת על ידי DBA (איור 1). השיטות המשמשות במסמך זה למגזרי נפרון דג הזברה מבוגרים תווית באמצעות ספיגת dextran, phosphatase אלקליין, DBA, אימונוהיסטוכימיה או רוצה יכולות להתבצע בשילובים שונים, בהר שלם או עם סעיפים היסטולוגית של רקמת כליה (איור 2). זה מאפשר גמישות ומגוון גדולים כאשר הרכב נפרון תוערך (איור 2).

הכליות מבוגרות יכולות להיות מותקנות שטוחות בשקופית זכוכית לניתוח, עם divots של פלסטלינה (או לחלופין, גריז ואקום) המשמש להשעות את coverslip על הרקמות (איור 3 א). כאורך כליות הטיפוסי הוא כ 5-7 מ"מ, יש לו גודל תורם להדמיה על מיקרוסקופ סטריאו או מתחם (איור 3 א). תחת תאורת brightfield, אוכלוסייה שטחית של מלנוציטים עם פיגמנטציה השחורה יכולה להיות דמיין בשיתוף עם רקמת הכליה, וכלי דם כגון אב העורקים ניתן לראות כי יש לי אריתרוציטים במחזור גוון אדום (איור 3 ב). בעקבות זריקת intraperitoneal של dextran-FITC, תחומים PCT הפרוסים בכל הכליה בינים עדיין שכותרתו 3 ימים לאחר מכן, וצלמו באמצעות מסנן FITC במיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3 ג). בעוד מלנוציטים לטשטש חלקית ויזואליזציה של צינוריות כליה בודדות (Figuמחדש 3C '), מלנוציטים אינם מונעים כימות של מספר נפרון או ההערכה של קוטר אבובית ואורך. בעקבות זריקת intraperitoneal של fluoro-אודם dextran, הלבנה של המדגם הקבוע בוטלה פיגמנטציה melanocyte, ומגזרי PCT נצפו עם תאורה בהירה שדה לבד (איור 3D). טיפות שומנים מחלל גוף הבטן לפעמים ניתן לראות בשיתוף עם הכנות איבר שלמות בכליות (איור 3 א) מגזרי .Individual PCT להראות פיתולים, סלילים (איור 3D '), אלא גם יכולות להיות מאופיינת על ידי מתיחות יחסית ליניארי (איור 3D ").

conjugates dextran שונה סיפק רמות של בהירות כוללת שונות בתיוג אבובית הפרוקסימלי. בפרט, fluoro-אודם dextran-FITC או dextran הוביל לחדות תוויות נפרון עם רקע מינימאלי (איורים 3C-D "). שני blu מפל dextranדואר וconjugates הצהוב לוציפר הראו ספיגת אבובית הפרוקסימלי בכליה הבוגרת (איור 4 א, ​​4 ב). מעניין, כליות חשופות למפל הכחול dextran הראו הקרינה PCT יחסית ספציפית עם קצת רקע (איור 4 א, ​​4 א '), ואילו כליות החשופות לצהוב לוציפר dextran שכותרתו קטעי PCT אבל הראו אות רקע מורגשת, עם הווה מכתים ניאון שאינו ספציפי בכל רחבי ב סטרומה הכליות, או הרווח בין nephrons (איור 4 ב, 4 ב '). לבסוף, השימוש בdextran-fluoro האודם סיפק תיוג אבובית הפרוקסימלי מעולה, עם רקע מינימאלי או ללא אפילו בעת הצגה בטווח של הגדלה שונה (איור 4C, 4C '). בכל המקרים, הדפוס צינורי הייחודי של ספיגת המצומד dextran מתואם עם ביטוי רצונם של תמלילי קידוד slc20a1a, סמן PCT-ספציפי שנקבע על ^30-32 (איור 4D). Nephrעל מגזרי PCT מוכתמים בriboprobe antisense slc20a1a מוצג סלילים בצורת אות S PCT, כמו גם מגזרי PCT פחות חד מפותלים (איור 4D '), כפי שנצפה במהלך מבחני המצומד dextran שכותרתו (איור 3D', 3D ").

הכנות כליות אחרות, כגון זיהוי של פעילות phosphatase אלקליין אבובית הפרוקסימלי (איור 5A, 5B, 5C) בוצעו באופן דומה לאחר הסרת פיגמנטציה melanocyte. זה אפשר להדמיה הפרוקסימלי נפרון אבובית וניתוח ללא כל חסימה. תגובתיות phosphatase אלקליין אנדוגני בנפרון היא סימן היכר עיקרי אחד של אבובית הפרוקסימלי ^1,47. צביעת phosphatase אלקליין היא מאוד ספציפית לאזורי נפרון הפרוקסימלי, בהשוואה לדפוס ביטוי מאחלי מחבת-הפרוקסימלי של הגן cubilin ³⁹ (איור 5D, 5D '). תגובתיות phosphatase אלקליין הייתה אינטנסיבית ביותר באשוחסעיף st של אבובית הפרוקסימלי המתאימה לPCT (איור 5), הדומה לדפוס ביטוי cubilin (איור 5D, 5D '), שהיו גם רמות התעתיק היחסית הגבוהות ביותר בPCT. PCT הצטיין בקוטרו מעט הרחב יותר, הביטוי ספציפי של mafba גורם שעתוק (איור 5E, 5E '), וביטוי ספציפי של slc20a1a גן טרנספורטר המומס (איור 4D, 4D'). תגובתיות phosphatase אלקליין גם כותרת קטע של אבובית הפרוקסימלי בקוטר דק יותר שמתאים למגזר PST (איור 5) המבוסס על השוואה לביטוי תמליל הקטע ספציפי של slc13a1 גן טרנספורטר המומס (איור 5F, 5F '). תחומים ביטוי רצונם של slc20a1a סמן PCT וslc13a1 סמן PST אינם יכולים להתקיים (איור 5G ), ובחינה מדוקדקת של nephrons אחד הראתה כי תחומים אלה בהתאמה ניגשים, עם מעט אם בכלל פער ביניהם, ויחד הם משחזרים תחום הביטוי של cubilin (ראשי חץ שחורים ב. איור 5G ', 5G ", 5G"' ).

כדי לאשר את הקשר של תגובתיות phosphatase אלקליין עם זהות אבובית הפרוקסימלי נוסף, הר שלם שיתוף תיוג של מכתים phosphatase אלקליין בוצע על כליות מדג הזברה שקיבלו זריקת intraperitoneal של fluoro-אודם dextran 3 ימים (6A-C איור) לפני. fluoro-אודם dextran הראה חפיפה עם phosphatase אלקליין רק החלק רחב יותר בקוטר של תחום אבובית הפרוקסימלי המתאים לPCT (דוגמאות באיור 6 ד-I). תחום dextran החיובי עצר בפתאומיות באתר שבו בקוטר של אבובית הפרוקסימלי דליל, כלומר, שבו PCT וPST נפגשו, (חץ לבןראשים באיור 6) ותגובתיות phosphatase אלקליין רק נצפו במגזר PST שלאחר מכן (דוגמאות באיור 6 ד-I). הקרינה רקע מתגובת phosphatase אלקליין גם התוותה את זוג מסלולים מקבילים עיקריים צינור האיסוף מצא בכליה הבוגרת במעומעם ^29,30 -ducts הנבדלים ביניהם בכך שהקוטר הרחב ביותר של כל צינור הקשורים כליות (כוכביות באיור 6 א, 6 ד, 6E, 6G, 6 שעות). בשלב הבא, שיתוף התיוג של צינוריות נפרון עם ספיגת phosphatase וdextran אלקליין נצפה בניתוח cryosection (איור 6J, היקפה אבובית התווה עם נקודות לבנות). בחתך, תגובתיות phosphatase אלקליין צוינה ברצועה עבה במשטח הפסגה של האפיתל צינורי, עולה בקנה אחד עם ultrastructure גבול מברשת, ואילו חלל cytosolic תא צינורי המקביל הראה תגובתיות fluoro-אודם dextran (איור 6-י). יש לציין, staineצינוריות ד היו או חיוביות כפולות לphosphatase אלקליין וdextran, שהובילו לזיהוי שלהם כמגזרי PCT, או ביחידות חיובית לphosphatase אלקליין (איור 6J, אבובית היקפית המפורטים בנקודות צהובות), שמוביל לזיהוי כמגזר PST (הערה: אחרות צינוריות הנוכחיות היו שליליות לשני הכתמים, מידע לא מוצגים) (6J איור). יתר על כן, מכתים phosphatase אלקליין (איור 6K) היה משולב בהצלחה עם תווית גרעינית, יודיד propidium (איור 6L), להקל על ספירת תאים (כיסוי באיור 6M).

אבובית הדיסטלי של נפרון דג הזברה המבוגר תויגה עם DBA rhodamine מצומדות- (איור 7). הר שלם כפול תיוג עם phosphatase DBA ואלקליין בוצע על כליות מדג הזברה wildtype (איור 7 א-C). תגובתיות DBA וphosphatase אלקליין לא הראתה שום חפיפה בtubules נפרון ( איור 7D-H). צינוריות מוכתמות DBA הראו קוטר ניכר דק יותר בהשוואה לצינוריות חיוביות phosphatase אלקליין, וצינוריות DBA לעתים קרובות מסועפות (ראשי חץ לבנים, איור 7G, 7H, 7J), ואילו הסתעפות מעולם לא נצפה במגזרי אבובית מוכתמים בphosphatase אלקליין. cryosections הכליות נאספו מדג הזברה wildtype שנושא transgene בי אמרגן enpep מניע eGFP (TG: enpep: eGFP), כתוויות GFP שתי הפרוקסימלית וtubules נפרון דיסטלי ⁵¹ (איור ט 7). אימונוהיסטוכימיה בוצעה כדי לזהות GFP, כדי לתייג את כל צינוריות הכליה (הירוקה, איור ט 7), ואחריו תיוג ניאון עם phosphatase וDBA אלקליין (בצבע טורקיז ואדום, בהתאמה, איור ט 7). ניתוח סעיפי אבובית גילה כי צינוריות היו או חיוביות לphosphatase אלקליין או DBA, אך לא את שניהם התוויות (איור ט 7). רק אמבטיה נדירהules הראה תגובתיות עם לא phosphatase אלקליין ולא כתם DBA, ככל הנראה בשל הזווית של סעיף אבובית (החץ לבן, איור ט 7). יתר על כן, מכתים DBA שולב בהצלחה בצביעת כליות הר שלמה עם התווית הגרעינית DAPI (איור 7J), שוב תוך שימת דגש על האופי האופייני מסועף של מגזרי אבובית דיסטלי (ראשי החץ לבנים, איור 7J).

בשלב הבא, כדי להשוות עוד יותר את דפוסי ספיגת dextran-FITC, phosphatase אלקליין, וDBA, תיוג משולש נבדק על ידי דג הזברה מבוגרת intraperitoneally הזרקה עם dextran-FITC, ואחריו בידוד כליות 3 ימים לאחר מכן ואחריו cryosectioning וצביעה לphosphatase אלקליין וDBA (דוגמאות הניתנות באיור 8A-E). tubules הכליות הראה שלוש קטגוריות של שילובי תווית: צינוריות שהיו חיוביים כפולים לphosphatase אלקליין ומגזרי PCT dextran המסומן (קווים מקווקווים לבנים), טובולes החיובי לphosphatase אלקליין לבד כונה על מגזרי PST (קווים מקווקווים צהובים), ומבנים צינוריים בתויגו על ידי רק DBA (אדום מקווקו מתאר איור 8A-E). נקודות נוספות, tubules רק DBA החיובי הציג ענף (איור 8E). על ידי ניתוח מאחלים, דפוס הסתעפות ייחודי זה של דיסטלי, tubules החיובי DBA מתואם עם דפוסי ביטוי גנים של תמלילי טרנספורטר המומס שהם ספציפיים למגזרי דיסטלי אבובית (איור 8F-I). תמלילי קידוד clcnk, אשר מסמנת את אבובית דיסטלי כולו (DE וDL) היו דקים בקוטר, בשפע בכליות, ונקודות סניף הכילו (ראש החץ שחור איור 8F, 8F '). לשם השוואה, מגזרי אבובית שהראו ביטוי של slc12a1 או slc12a3, שהם סמנים של DE וDL, בהתאמה, היו פחות בשפע בדגימות כליות לעומת הכולל לclcnk ביטוי (השווה איור 8 G ו8F, 8h). יתר על כן, מקטעי אבובית שהביעו slc12a1 היו רק לעתים נדירות, אם בכלל, מסועפים (איור 8G, 8G '), ואילו אזורי אבובית שהביעו slc12a3 היו לעתים קרובות מסועפים בהסדרים כמו שבשבת-אופייניים (איור 8h, 8h', 8h ", 8h" ' , ראשי חץ שחורים). לבסוף, מאחלים כפולים לslc20a1a סמן PCT וclcnk סמן דיסטלי הראו כי כתמים אלה לא חופפים (איור 8i). יש לציין, משתרע מגזרי PCT slc20a1a -expressing לא צורף לclcnk tubules -expressing, שהיה צפוי מאז PST ממוקם בין האזורים אלה (איור 8i). יחדיו, מבחני של תיוג tubules כליות עם ספיגת dextran, תגובתיות phosphatase אלקליין, DBA, ומאחלים לתעתיקי גנים ספציפיים, מאפשרים ההבחנה של הפרוקסימלי לעומת מגזרי דיסטלי.

t "FO: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
איור 1 האנטומיה נפרון בכליה דג הזברה מבוגרת. ציורים סכמטי של (A) בכליות דג הזברה מבוגרות וטבלת השוואה של מאפיינים מולקולריים קטע הוצגו על ידי מבוגרים וnephrons דג הזברה עוברי (B). (א) (למעלה משמאל) בכליות מבוגרות הוא איבר שטוח הממוקם על קיר גוף הגבי. (למעלה מימין), כאשר שנצפו מנקודת מבט הגחון, יש לו את הכליה מורפולוגיה מעוקלת ייחודית, הכוללת אזורי הראש, תא מטען וזנב, ויש גם אוכלוסייה של מלנוציטים הנלווים פני השטח. הגדלה (משמאל למטה) מראה סכמטי של עץ אופייני נפרון בכליה דג הזברה המבוגר, שבו כל נפרון יחיד בעל מסנן דם (גופיף כליה) בצד אחד, ואחריו אבובית הפרוקסימלי, אבובית דיסטלי, ודביק. סכמטית (bo צבעוניttom ימין) מראה תרשים ליניארי של עץ נפרון מבוגר אחד כדי להשוות את מאפייני קטע עם אלה של nephrons העוברי (B). Nephrons עובר דג הזברה מכיל מקטעי אבובית הכוללים אבובית הפרוקסימלי המפותל (PCT), אבובית ישרה הפרוקסימלי (PST), דיסטלי המוקדם (DE), ודיסטלי מאוחר (DL), עם תחומים ביטוי גנים המתאימים המפורטים להלן. Nephrons בדג הזברה המבוגר יש לי הרכב מגזרי וחתימה מולקולרית דומה המבוססת על תחומים הביטוי של גנים שמקודדים מובילים מומסים דומה, אם כי הבחנה ראויה לציון בהשוואה לעובר היא שיכול להיות מאוחד כמה nephrons דרך קטע DL מסועף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מפת איור 2 תרשים זרימה המצביעה על הקשר בין השיטות המתוארות בפרוטוקול זה, המצביע על איך ניתן לבצע את השיטות בנפרד או בשילובים שונים. בעקבות זריקת intraperitoneal של dextran יזין-ניתן לתקן שכותרתו לתוך דג הזברה המבוגר, בכליות יכולות להיות דמיינו ב הר שלם הכנה, לבד או בשילוב עם phosphatase אלקליין ו / או כתמי DBA. לחלופין, בכליות דג הזברה שנבחרו ניתן לבדוק לאחר רקמה היסטולוגית חתך עם cryostat. יכולים להיות מוכתמים הסעיפים לתייג רבים שילובים של תכונות, באמצעות אימונוהיסטוכימיה, הכתמה גרעינית, מכתים DBA, ו / או תגובתיות phosphatase אלקליין. בנוסף, יכולים להיות דמיינו סעיפי כליות ישירות לנוכחות של ספיגת dextran יזין-ניתן לתקן במגזרי PCT. לבסוף, יכולות להיות מעובד כליות שנבחרו לביטוי spatiotemporal של ביטוי גנים באמצעות מאחלים. מספרים בסוגריים מתייחסים לcorresponding חלקי פרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כליות דג הזברה 3 מבוגרים איור שטוחים הר הכנה ויישום לדמיין ספיגת dextran מצומדות במגזר PCT של nephrons הכליה. (א) תמונת brightfield של דגימת כליות שטוחה הר הכנה, שבו האיבר כבר ממוקם שטוח בשקופית זכוכית, עם coverslip ממוקם על גבי הרקמה הנשענת על ארבעה divots של פלסטלינה (בצבע ורוד חם). הנה הכנת הכליות היא הדמיה לצד שליט מטרי לספק השוואת קנה מידה. כליות המבוגר טיפוסיות היא כ 5-7 מילימטרים (מ"מ) מהראש ועד זנב. (ב ') תמונת brightfield של מולבןכליות. פיגמנטציה השחורה מתאימה לאוכלוסייה המפוזרות של מלנוציטים מצאו בשיתוף עם הכליות, והאב העורקים עוברים לאורך קו האמצע של הכליות. ויזואליזציה (C) של מגזרי PCT נפרון 3 ימים לאחר הזרקת intraperitoneal של 40 kDa dextran-והעמסת (FITC) , ללא הלבנה של הכליה מבוגרת. מגזרי PCT הם נצפו בכליות אבל הם מוסתרים בחלקו בשל מלנוציטים. הזום הדיגיטלי של נפרון בודד (C '), עם מלנוציטים (חץ לבן). תמונה (D) של כליות בוגרות 3 ימים לאחר הזרקת intraperitoneal של 10 kDa fluoro-אודם dextran, קיבעון של הכליה, והלבנה. פיגמנטציה melanocyte הוסרה ואזורי PCT היו דמיינו כאן מבוססים על ספיגת endocytic של dextran תחת תאורת brightfield. Repre טיפות שומנים (חץ) מהבטן לפעמים ניתן לראות בשיתוף עם דגימות רקמת כליה. (ד ', ד')תמונות sentative מתארות וריאציות מורפולוגיות קלות בין מגזרי PCT. בעוד PCTs נפרון רבים בחוזקה מפותלת (ד '), nephrons אחר מכיל אזורי PCT שיש לי מינימאלי התפתלות (D "). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. תיוג קטע אבובית איור 4 מבוגרים PCT נפרון הכליה דג הזברה wildtype הוזרק intraperitoneally עם המצומד dextran ניאון בודד; אז הכליות שלהם נבדקו 3 ימים לאחר ההזרקה להדמיה PCT. (, ') מפל Dextran כחול, 10 kDa (B, B') לוציפר dextran הצהוב, f dextran 10 KDA ו( C, C ') luoro-אודם, 10 kDa כל מעדיף לתייג מגזרי PCT בnephrons הכליה. שניהם מופע dextran המפל הכחול והצהוב לוציפר כמה תיוג הלא ספציפי של אוכלוסיות תאי סטרומה ממוקמות בין nephrons, עם רקע הרבה יותר גבוה שנצפה בכליות שטופלו צהובות לוציפר. בניגוד לכך, fluoro-אודם dextran הראה רקע מופחת באופן דרמטי עם תיוג PCT אינטנסיבי. (D, D ') בכליות מבוגרות המוכתמות על ידי רצון לזהות את המיקום של תמלילי קידוד slc20a1a, סמן ספציפי של סוג תא טרנספורטר PCT. תחום הביטוי של slc20a1a תואם את הדפוס האופייני של ספיגת dextran נצפתה בכליות, עם הפצה של תחומים שונים בחוזקה מפותלים / כרך PCT כמו גם מתיחות PCT מוארכות יותר המראות בקוטר רחב עולה בקנה אחד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

ontent "FO: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
איור 5 תוצאת נציג של מכתים לphosphatase אלקליין, סמן אבובית מחבת-הפרוקסימלי, בכליות דג הזברה מבוגרות בהשוואה לסמני אבובית הפרוקסימלי אחרים העריכו עם הרצון. צביעת phosphatase (AC) אלקליין (טורקיז) מאירה את אבובית הפרוקסימלי נפרון, המדגישה את שני PCT וPST. (DF ') משאלה אחת לגנים ברשימה (כל אחד בכתמים סגולים). (D, D') דפוס הביטוי של cubilin , סמן הפאן הפרוקסימלי (PCT-PST), בקורלציה עם phosphatase אלקליין (D, D '). לשם השוואה, מאחלים לmafba מסמן את PCT (E, E ') וslc13a1 מסמן את PST (F, F'). ב( GG "') מאחלים כפולים עבור סמן PCT slc20a1a </ Em> (אדום) וslc13a1 סמן PST (הסגול) מראה כי המגזרים שכותרתו על ידי סמנים אלה אינם חופפים, ולא שתחומי הביטוי שלהם תופסים עמדות סמוכות כאשר nephrons היחיד נבחנים מקרוב (G'-G "'). ראשי חץ שחורים מצביעים על הצומת בין מגזרי PCT וPST, אשר מזוהה בדרך כלל עם שינוי בקוטר אבובית מגדול לקטן, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

צביעת איור 6 phosphatase אלקליין וחפיפת מופע ספיגת dextran במגזר PCT של nephrons כליה המבוגר, וphosphatase אלקליין תואמת עם עמיתים לתיוג גרעיני עם יודיד propidium. (AI) הר שלם הכנות של מכתים phosphatase אלקליין בוצע על כליות ממבוגרי דג הזברה, שקיבלו זריקת intraperitoneal של fluoro-אודם dextran בעבר. phosphatase אלקליין (טורקיז) וחפיפת אודם fluoro-מופע (אדום) dextran בPCT, אך לא בPST, שהוא רק חיובי לphosphatase אלקליין. רמות רקע של phosphatase אלקליין להאיר את זוג צינורות איסוף מרכזיים בכל כליה (כוכביות, *), שהנן ייחודיים בשל הקוטר הרחב שלהם. (AC) תמונה ממוזגת ותמונות נפרדות של אזור האוכף של כליות אחת. (DF) ו( GI) שני סטים של תמונות הממוזגות ותמונות נפרדות של nephrons ירושלים. ניתוח (I) cryosection מאשר שיתוף תיוג של phosphatase אלקליין וfluoro-אודם dextran במגזרי PCT (המפורטים בנקודות הלבנות), ואילו phosphatase אלקליין לבד תוויות PST קטע (שמתואר בנקודות צהובות). (KM) בכליות היושכותרתו עם phosphatase (K) אלקליין (טורקיז) ויודיד propidium (L) (סגול), מה שמאפשר (M) מוזגה להדמיה של תאים הפרוקסימלי אבובית והגרעינים שלהם, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7 phosphatase אלקליין וDBA הם הדדית תוויות בלעדיות קטע המציינות את הפאן הפרוקסימלית ואזורי מחבת-דיסטלי, בהתאמה, בהווה בnephrons הכליה דג הזברה המבוגר. (AH) הכנות הר שלמות של כליות דג הזברה מוכתמות בphosphatase אלקליין וrhodamine-DBA. phosphatase אלקליין (טורקיז) וDBA (אדום) לא מראים חפיפה בכליות. רמות רקע של phospha אלקלייןבורסה להאיר את זוג צינורות איסוף מרכזיים בכל כליה (כוכביות, *), שהנן ייחודיים בשל הקוטר הרחב שלהם. צינוריות חיוביות DBA הן דקות בקוטר ומאופיין לעתים קרובות על ידי הנוכחות של נקודות סניף (ראשי חץ לבנים). (AC) מוזגה תמונה ותמונות נפרדות של אזור האוכף של כליות אחת. (DF) קבוצה אחת של תמונות הממוזגות ותמונות נפרדות של nephrons ירושלים. (G, H) דוגמאות נוספות, עם צינוריות DBA מסועפות לצד צינוריות חיוביות phosphatase אלקליין, התמזגו תמונות. ניתוח cryosection (I) מאשר כי חלקי phosphatase אלקליין ותווית DBA ברורים אבובית, ורק tubules הנדיר להראות לא תווית (חץ לבן ), כנראה עקב הזווית של סעיף לאבובית ש. בניתוח זה, דג מהונדס wildtype, Tg: enpep: eGFP, שימש וכל tubules הכליות בכליות זה היה immunolabeled עם נוגדן ראשוני כדי לזהות GFP (J). הר שלם מכתים כליות לDBA (אדום) וDAPI (כחול) (תמונה ממוזגת), מראה שוב קטעי אבובית דיסטלי קנים של nephrons הבוגר (החץ לבן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8 תיוג לשלושה של cryosections כליות המבוגר עם ספיגת dextran, phosphatase אלקליין, וDBA בהשוואה לניתוח מאחלי קטע דיסטלי. כליות (AE) למבוגרים הוזרקו intraperitoneally עם dextran-FITC (ירוק), והכליות שנאספו 3 ימים לאחר מכן להטבעה וcryosectioning. צביעה עם phosphatase אלקליין (טורקיז) וDBA (אדום) חשפה שלוש אוכלוסיות של צינוריות: מגזרי PCT שהיו חיוביים לתגובתיות phosphatase אלקליין וDextרצתי (שמתואר בנקודות הלבנות), מגזרי PST שהיו חיוביים רק לתגובתיות אלקליין phosphatase (המפורטים בנקודות צהובות), ומגזרי אבובית דיסטלי שהיו חיוביים לDBA בלבד (המפורטים בנקודות אדומות) שהראה גם נקודות סניף דיסטלי אופייניות. ( תמונה לספירה) תמונה ממוזגת ותמונות נפרדות של דוגמא אחת סעיף. (E) מוזגה סעיף דוגמא נוספת. (השוואת FI) של דפוסי ביטוי גני אבובית דיסטלי על ידי אחד (FH '") ומאחלים כפולים (I). (FH ') המשאלה אחת לגנים ברשימה (כל אחד בכתמים סגולים). (F, F' דפוס הביטוי של clcnk), סמן הפאן דיסטלי (DE-DL), התגלה בצינוריות דקות שהכילו נקודות סניף (ראש החץ שחור). (G, G ") לשם השוואה, מאחלים לslc12a1 מסמן את DE ללא נקודות סניף זוהו, ו( HH '") slc12a3 מסמן את DL, קטע מתאפיין בנקודתי סניף רבות ברחבי איבר הכליות (ראשי חץ שחורים). מאחלים זוגי (I) לslc20a1a סמן PCT (אדום) וclcnk מחבת-דיסטלי (הסגול). המגזרים שכותרתו על ידי סמנים אלה אינם חופפים, ולא תחומים הביטוי שלהם תופסים עמדות שאינן סמוכות, כך שסלילי PCT בודדים (מימין למטה) לא ניגש מבנים צינוריים, והאחרון לכבוש מקומות דיסקרטיים ולהחזיק נקודות סניף סימן היכר (ראש חץ שחור ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הנה, יש לנו תארנו שיטות המאפשרות ההדמיה של רכיבי קטע נפרון בדג הזברה המבוגר. ההזרקה של conjugates dextran ניאון מאפשרת תיוג PCT מועדף בשל מאפייני endocytic של תאי אבובית הפרוקסימלי אלה ^30,38. שיטה זו יכולה להתבצע עם גמישות רבה בשל קיומו של dextrans שניתן להשיג עם להקה של conjugates ניאון שונה. בנוסף, השימוש בdextrans יזין-ניתן לתקן הוא דרך נוחה במיוחד לתייג PCT מגזרים, כפי שנהלי תיוג משניים אינם נדרשים. זה מאפשר זיהוי אות פשוט יחסית והוא תואם עם הרבה מדבקות אחרות ניאון, immunolabeling, ושימוש בקווי כתב מהונדסים. תיוג phosphatase אלקליין גם מסמן את אבובית הפרוקסימלי, עם תגובתיות חזקה בPCT ותגובתיות מעט חלשה יותר בPST. לבסוף, מכתים DBA מאפשר סימון של קטעי אבובית דיסטלי, המציגים characteristic מסועף מורפולוגיה. מולקולות לקטינים שונות, אשר מחייב חלבוני סוכר ממוצא nonimmune, נעשו שימוש נרחב להבחין מגזרי נפרון היונקים ^47. זה מעניין, כי DBA בדג הזברה בקורלציה עם מגזרי אבובית דיסטלי, כפי שהוא מנוצל לציון צינורות איסוף בכליות של יונקים ^47.

יחדיו, יכולות להיות מנוצלים בשיטות אלה בצירופים שונים כדי לתעד הרכב ובתפקוד כליות. מאחר וכל השיטות הללו ניתן להשתמש בתכשירי כליה שלמים, הם מספקים כלים להערכת מבנה נפרון ותפקוד לאורך האיבר ללא כל הסתמכות על השימוש של יותר זמן רב, שיטות מייגע, למשל, עבודת cryosection וimmunolabeling. עם זאת, הכתמים מתוארים במאמר זה הם שיטות קיימא בcryosection. ניתוח cryosection מייצר דגימות (בהשוואה להר שלם) שהם מתאימים יותר לאימונוהיסטוכימיה כדי לזהות pepti הספציפיdes, אם כי כמובן זה סוג של ניתוח דורש הזמינות של נוגדנים ראשוניים מתאימים. למרבה הצער מגבלה העיקרית אחת בעבודה עם מודל החיה דג הזברה נשארת עניה הזמינות של נוגדנים. כך המאחלים נשאר בשימוש נרחב ביותר, כלומר, 'ללכת ל, "הליך לניתוח של ביטוי גנים. מאחל באמצעות תגובות מצע BCIP, NBT, ו / או INT לייצר משקעים סגולים או אדומים אינו תואם עם מכתים ניאון על cryosections. אפשרות אחת תהיה להפעיל את השימוש בזיהוי מאחלי ניאון, הליך שעבר אופטימיזציה עבור דגימות עוברי דג הזברה ויכול להיות מותאם לשימוש עם הכליה הבוגרת. התיאור של השיטות במאמר זה וידאו צריך לאפשר לניסויים נוספים עם טכניקות כמו מאחלי ניאון בשילוב עם קווי דג הזברה מהונדסים שבו קטעים בודדים מסומנים עם כתב כגון eGFP או mCherry. לחלופין, השיטות שתוארו כאן could להיבדק בשילוב עם צבעים אחרים חיוניים, למשל, לקטינים אחרים. לפיכך, הסתגלות והרחבת השיטות שתוארו כאן עוד יכולים להיות מופעלת כדי שיתאימו לצרכימים של החוקר להכנות הר שלמים בכליות וניתוח.

ככזה, יש להם שיטות אלה פוטנציאל רחב ליישום עם מודל דג הזברה ללימודי התחדשות מתמשכים וגם בדוגמנות מחלה גנטית. יש צורך דחוף במחקר חדשני וטיפולים לייסורי כליות. מיליוני אנשים סובלים מצורה כלשהי של מחלת כליות בכל שנה כתוצאה מגורמים מולדים, אקוטיים, ו / או כרוניים. יתר על כן, השכיחות של מחלת כליות ממשיכה לעלות ברחבי העולם, מה שהופך את המחלות הללו נושא בריאות הציבור עולמי ^14,15. טיפולים כגון המודיאליזה זמינים לפי מכונת דיאליזה חיצונית משמשת ללהיפטר הדם של מטופל של פסולת מטבולית אם הכליות שלהם אינן מסוגלות לבצע את התפקיד הזה. לרוע המזל, יש התערבות זו מגבלות, כטיפול מתמשך הוא הכרחי להישרדות. יתר על כן, חולי סופו של דבר דורשים השתלת כליה, אשר יכול לקחת שנים כדי לקבל פעם במטופל שוכבים על waitlist. גם לאחר קבלת להשתלת כליה, חולים רבים סובלים מתופעות לוואי כתוצאה מההליך וחייבים לקרב את ההשפעות הללו לשארית חייהם. קשיים אלה מדגימים את הצורך הרציני לפיתוח טיפולים חדשניים לאו לסייע במניעת מחלת כליות או כדי להגדיל את התחדשות רקמות ^8,16,52,53 אולי. בהתחשב במגבלות האתיות הברורה של השימוש במבחן בבני אדם במעבדות ביו, מודלים של בעלי החיים הם חיוניים למחקר של היווצרות מחלה אנושית ועבור הבדיקות של טיפולים חדשים. כתוצאה מהדמיון האנטומי שלה וקרבה אבולוציונית, העכבר הפך המודל הנפוץ ביותר של מחלות בבני אדם ^45. עם זאת, יש מגבלות מסוימות עם בעל חיים זה, including חוסר יכולת לחזות התפתחות איבר בגוף חי ומעשיות של השלמת מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה. דג הזברה הוא אורגניזם מודל רלוונטי ושימושי ללימוד פיתוח איבר ומודלים למחלות אנושיות ^45,46. בכל הקשור למחלות של בני אדם, homologs התפקודי בדג הזברה קיים עבור כמעט 70% מכל הגנים האנושיים ^54,55.

מחקר שנערך לאחרונה הדגיש את התועלת של דג הזברה לתחומים רבים של ^31,37,56 מחקר כליות. מחקרים של התחדשות ותיקון בדג זברה לאחר AKI מצביעים על כך שהתחדשות אפיתל אבובית וneonephrogenesis הם שני תהליכים המתרחשים וחפיפה לאורך כל ההתחדשות timecourse ^30,37. השימוש בגנטמיצין נקרא האנטיביוטיקה aminoglycoside נוצל כפרדיגמה פציעה אשר דרך ללמוד את התוצאות של AKI ^ב29,30,37 דג הזברה מבוגר. במהלך פציעה כשני שבוע תקופה שלאחר מגנטמיצין, טובול פרוקסימליes להתחדש, ובינתיים nephrons החדש להיווצר בכל רחבי האיבר ^29,30,37. באופן כללי, המנגנונים המווסתים את התחדשות אפיתל יישארו שנויים במחלוקת. במנגנון מוצע אחד של תהליך התיקון, יש אירוע פציעה אקוטית הראשוני ואחריו השלת תאים מתים לתוך לומן. בשלב הבא, יש סדרה של דה בידול, התפשטות, ואירועי הגירה, לאחר שתאים חדשים לבדל, אכלוס מחדש את הקרום במרתף נפצע ושחזור פונקציה לאתר נפצע. לחלופין, מחקרים אחרים הראו כי תאים חלופיים נובעים מתאי גזע / אב המתגוררים בתוך צינוריות נפרון. באשר לתהליך של neonephrogenesis בדג זברה, אגרגטים הסלולר נצפו AKI הבא על ידי הזרקת גנטמיצין ^29,30. אגרגטים אלה מאוחר יותר יבשילו לnephrons החדש שאנך לצינוריות כבר קיימות ^29,30. החוט המקשר, המאחד התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis הוא גורם המסתורין המוחלט שלהם: כיום יש באופן אקספוננציאלי יותר שאלות על איך מעללי משובי הללו מתרחשים מאשר יש תובנות זמינות.

עד כה, עם זאת, כמה שורות מרגשות של ראיות תומכות ברעיון שמחקר התחדשות כליות באמצעות דג הזברה אכן יכול לספק תובנות השוואתיות רלוונטיות לAKI האנושי שיכול להיות גם ^56-58 פוטנציאל translational ישיר. הקרנה כימית לזהות מולקולות קטנות המגבירות את השגשוג של תאי אב כליות בעובר דג הזברה, הביא לאחרונה לזיהוי -butanoate מעכב deacetylase היסטון מתיל-4 (phenylthio) (m4PTB) ^56,57. מנהל של תרכובת זו לזחלי דג הזברה עם AKI-Induced גנטמיצין גילה כי הישרדות זחל גדלה ושהשגשוג צינורי הכליות היה משופר ^56,58. כאשר עכברים עם AKI-Induced איסכמיה המתון טופלו בm4PTB, ההתאוששות שלהם הואצה בassociation עם ירידה בשני מעצר הניוון ומחזור התא צינורי של תאים מתרבים צינורי כליות ^58. ממצאים אלה מראים כי המסלולים אחראים להתפתחות תקינה של דג הזברה כליה ו / או תגובת משובי לאקי יהיו נשמרים עם יונקים ^56.

וכך, בעוד יש צורך במחקרים נוספים כדי להפריד את מנגנוני התחדשות, כלומר לזהות את מסלולי האיתות כי הם מעורבים ולהבין האינטראקציות-דג הזברה שלהם מספקת השדרה מבטיחה אחד להמשיך מטרה חשובה זו בתחום נפרולוגיה. כלים כגון תוויות תא נפרון המתוארות בפרוטוקול זה מייצגים קבוצה אחת של מבחני שיכולים להיות מנוצל כדי להעריך הרכב ופונקציונליות כליות במודלי AKI. יתר על כן, הם יכולים להיות מיושמים לאפיין מודלים מהונדסים של מחלת כליות ועשויים לספק דרכים לזיהוי תרופות כימיות מסוגלות לקדם שיקום של מבנה נפרון לאחר סכר הכליהגיל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Pbs			Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.
1X Pbst			0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.
1X Pbs with 0.05 % Tween			0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X Pbs			Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Fine Forceps	Roboz	RS-1050	Dumont Tweezers Pattern #55
Glass Slide	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Glass Coverslip	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Modeling Clay	Hasbro	Playdoh	Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide Holder	Thermo-Fisher	12-587	Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution			Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 mL with distilled water
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009
Blocking solution			Blocking Solution (for a 10 mL solution): 8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 2 mL of fetal calf serum 150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection	Invitrogen	E6601	We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions.
Alkaline phosphatase wash solution			Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 5 mL of 0.5M EDTA 120 mg of Levamisole 95 mL of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW	Invitrogen	D1844	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW	Invitrogen	D1976	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW	Invitrogen	D1825	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW	Invitrogen	D1817	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine	Vector laboratories	RL-10-32	DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS
Propidium iodide	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield Hard Set Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Micro cover glass	VWR	48393081
Dimethyl Sulfoxide, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Sucrose	Sigma	S0289
EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502
Levamisole	Sigma	L-9756
Tissue Freezing Medium	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380 Adhesive Microscope Slides	Tru Scientific	0380W
Liquid Blocker – Super PAP Pen	Electron Microscopy Sciences	71312
Immuno stain moisture chamber	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Cryostat	Therm	Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC	Filter set used was as follows:  Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.
Compound microscope	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.