Анализ нефрона Состав и функции в почках взрослых данио рерио

Резюме

Данио взрослых почки является отличной системой для почечных регенерации и болезненных исследований. Важным аспектом таких исследований является оценка структуры нефрона и функции. Этот протокол описывает несколько методик, которые могут быть реализованы для оценки нефрона канальцев состав и оценить почечную реабсорбцию.

Аннотация

Данио модель стала соответствующей системы для изучения развития почек, регенерации и болезни. Оба эмбриональные и взрослые данио почки состоят из функциональных блоков, известных как нефронов, которые высоко консервативных с других позвоночных, включая млекопитающих. Исследования на рыбках данио недавно показали, что два отличительных явления происходить после взрослых нефроны понести ущерб: во-первых, существует прочная регенерации в рамках существующих нефронов, что заменяет разрушенные канальцев эпителиальные клетки; Второй, совершенно новые нефроны изготавливаются из почечных клеток-предшественников в процессе, известном как neonephrogenesis. В отличие от этого, человека и других млекопитающих, похоже, только ограниченную способность к регенерации эпителия нефрона. На сегодняшний день, механизмы, ответственные за эти явления регенерации почки остаются плохо изучены. Поскольку взрослые данио почки пройти как нефроне регенерацию эпителия и neonephrogenesis, они обеспечивают выдающуюся экспериментальный пунктДигм изучать эти события. Кроме того, существует широкий спектр генетических и фармакологических средств, доступных в данио модели, которые могут быть использованы, чтобы очертить клеточные и молекулярные механизмы, которые регулируют почечной регенерации. Один из важнейших аспектов такого исследования является оценка структуры нефрона и функции. Этот протокол описывает набор методов маркировки, которые могут быть использованы для оценки почечной состав и функциональность тест нефроне в взрослых данио почки. Таким образом, эти методы широко применяются для будущего фенотипической характеристики взрослых данио парадигм повреждение почек, которые включают, но не ограничиваются ими, nephrotoxicant режимов воздействия или генетических методов направленного гибели клеток, таких как нитроредуктаза опосредованной клеточной техники абляции. Кроме того, эти методы могут быть использованы для изучения генетических возмущения в формировании почек взрослого, а также может применяться для оценки почечной статус при моделировании хронической болезни.

Введение

Почек представляет собой сложный орган, который выполняет множество физиологических функций в организме. Всего функция почек является метаболический выведение отходов, и эта задача тесно переплетается с поддержании гомеостаза жидкости. Почки выполняет эти работы по фильтрации крови и формирование мочи, в то время как одновременно регулируя кровяное давление, уровень электролитов и кислотно-щелочной баланс. Высоко специализированные эпителиальные трубочки называемые нефроны служить в качестве основного функционального блока почки ^1,2. У взрослых позвоночных, нефроны обычно организуются в плотно обмотанный договоренности окружающей централизованную систему дренажа, что позволяет многие трубочки упаковать в довольно небольшом органе. Например, каждый из почки человека могут содержать более 1 миллиона нефронов ^3. Другие млекопитающие, как мыши обладают порядка 8-10 тысяч нефронов в почке ^4. Степень сложности почечной отличается от этих млекопитающих и других вертebrates, вызванная колебаниями общего количества нефронов и их архитектурного макета в почках. Видов позвоночных образуют целых три последовательные структуры почек во время разработки, и каждая форма проявления Усложнение в отношении нефрона пожертвований и организации: предпочки, мезонефроса и metanephros. Последнее почечная структура будет сохранена служит взрослого почки орган-обычно мезонефроса или metanephros ^2. Каждая форма почки, однако, имеет состав нефрона основе ^2.

Нефрона является рабочей лошадкой почки и отвечает за фильтрацию крови наряду с секрецией метаболита и трудоустройство. Нефронов простые трубчатые структуры, состоящие из эпителиальных клеток и имеют сегментный организацию, в которой дискретные, узкоспециализированные домены дифференцированных эпителия выполнять конкретные задачи. В порядке фильтрата потока через нефрона, там, как правило, из трех основных частей, что в состае каждая единица: (1) почечное тельце, (2) трубочка с проксимальных, средних и дистальных сегментов, и (3) сбор канал ^1. Проксимальных канальцах отвечает за реабсорбции органических растворов, в первую очередь глюкоза и аминокислоты ^1. Промежуточный трубочка (или петля Генле) является основным местом соли и воды регулирования ^1. Наконец, тонкая настройка соли и других ионов происходит в дистальных канальцах и собирательных канальцев и строго регламентируется эндокринной системы ^1. Оттуда, фильтрат проходит через мочеточник и мочевой пузырь, в конечном счете, выхода из тела, как отходы ^1.

Потеря функции почек могут быть следствием множества причин, которые мешают нормальной нефроне деятельность. Эти причины могут возникнуть в ходе развития почек, например, врожденные дефекты, приводящие к пороков нефронов ⁵ или причин от различных видов травм (вызванным как генетическая и environmental происхождение). Приобретенные травмы широком смысле классифицируется как острого повреждения почек (AKI) или хронической травмы почек (ХБП). AKI включает резкую потерю функции почек, часто в результате ишемии или токсина воздействия ^6,7. У млекопитающих, нефрон эпителиальных ремонт возможен после таких травм ^8, и многие люди проявляют полное восстановление функции почек после AKI. Однако AKI также связано с высокой заболеваемостью и смертностью, который наблюдался в широком 30 - 70% диапазона падения ^6,7. CKD, напротив, связан с прогрессирующей потерей функции почек, что является результатом лет длительного повреждения, как правило, связанного с фиброзом ^8,9. Кроме того, взаимодействие существует между AKI и CKD, либо как можно предрасполагают индивидуума к другому ^10-12. Например, те, кто пострадал от AKI более восприимчивы к CKD и даже смерти ^13. Заболеваемость болезнью почек, как в США, и во всем мире, достигла epideмикрофонные пропорции и, по прогнозам, возрастет, как в возрасте населения расширяет-таким образом, существует растущая потребность в определении регенеративные вмешательства медицины для почек ^14,15.

Несмотря на знания, что пациенты AKI может восстановиться, она уже давно думал, что почка является органом без врожденных регенеративных полномочий. Этот традиционный вид был значительно пересмотрен в последние годы ^16. Исследования следственные повреждение почек у мышей и крыс после AKI показали, что нефрона канальцев эпителиальные клетки могут размножаться и восстанавливать функциональные нефронов ^17-20. Хотя млекопитающие обладают этим адаптивную способность к регенерации нефронов, имеются заметные ограничения и неадекватные ответные меры могут быть вызваны, которые приводят к фиброза почек и ХПН ^21. Например, недавнее исследование показало, что повторяется эпителиальных абляция сотовый в мышиных нефронов было связано с уменьшением регенерации и фиброза почек-предполагая нефронов ВГАеа ограничивается регенерации порог ^22. Там нет никаких доказательств, что взрослый почек млекопитающих формирует новые нефронов заменить потерянные или поврежденные, тем самым их разрушение приводит к постоянному дефицита нефрона ^8,9. Интересно, что некоторые позвоночные реагируют на AKI путем регенерации нефронов эпителий и также производство новых нефронов, процесс называют neonephrogenesis или нефрона регенерации ^23. Neonephrogenesis происходит в рыбе после воздействия токсина или частичной резекции, и модели травмы исторически включали золотую рыбку ^24,25, тилапия ^26, кататься на коньках ²⁷ оризия ^28, и в последнее время, данио ^29,30. Из них, данио обеспечить жизнеспособную генетическая модель исследования, чтобы обнаружить клеточные и молекулярные пути, ответственные за почечной регенерации.

В этом видео статье мы продемонстрируем, как маркировать сегменты нефрона во взрослой рыбок данио. Знание нефрона анатомии, молекулярных особенностей,и функциональные характеристики имеют важное значение для успешных будущих почечных исследований с использованием данио. Взрослый данио почек является структурой мезонефрос и по своей сути менее сложной с точки зрения количества нефронов и организации, чем структуры metanephros найденного у взрослых млекопитающих, птицы и рептилии ^31. Тем не менее, данио организация сегмент нефрона аналогично млекопитающих, и была впервые зарегистрирована в почки эмбриона на основе экспрессии генов исследований ^31-35. Данио рерио нефроны эмбрион содержит прямолинейных отрезков канальцев, которые включают проксимальных извитых канальцев (РСТ), проксимального прямо канальцев (PST), дистального рано (DE), и дистальной поздно (DL) ^31-35 (рисунок 1). Данио рерио взрослых нефроны обладают сходными трубчатые сегменты ^30,31,36,37 (Рисунок 1). РСТ также могут быть идентифицированы с помощью функционального фенотипа: эпителиальные клетки в РСТ будет включать флуоресцентно меченные соединения (декстран 10-70 кДа по размеру), присутствующих вциркуляции, который был использован как в эмбриональных и взрослых данио почки, чтобы оценить эндоцитотических поглощение на этих клетках проксимальных канальцев ^38-41 (рисунок 1). Одно из различий в сегментах нефрона между данио и млекопитающих является то, что данио не хватает промежуточное трубочку, или петлю Генле ^30-37; так как этот сегмент функции у млекопитающих для экономии воды, и данио приведены пресноводные виды без актуальности сконцентрироваться свою мочу, это не удивительно, что данио не хватает этого сегмента ^32,33. Таким образом, общий состав нефрона в значительной степени сохраняется между данио и почек млекопитающих ^32,33. Эти сходства позволили данио, чтобы быть эффективным инструментом исследования для расследования функций генов почечных выразил во время нефрогенеза развития ^32-35,42 и моделировать многочисленные болезни почек ^43,44, тем самым добавив к существенному списке человеческих условиях, которые могут быть исследованы с помощьюданио ^45,46.

Сегодня, взрослых данио почки привлекательной моделью для сравнительных исследований почечной регенерации благодаря своей генетической сговорчивости и расширяющейся неба технологических ресурсов, имеющихся допросить функции гена и сигнальные пути у этого вида. Несколько исследований использовали данио мезонефрос чтобы исследовать механизмы регенерации после AKI ^29,30,37. Для продолжения исследований AKI помощью взрослых данио почку, важно иметь изысканные методы заклеймить различные регионы и методы нефрона обследовать функциональность нефроне. Существует несколько методов для анализа почек взрослого были адаптированы из эмбриональных протоколов почек. Внутрибрюшинное введение флуоресцентную метку декстрана в взрослых данио этикетки эпителий РСТ в мезонефрос нефронов через эндоцитоза ^30, как у эмбрионов рыбок данио ^38-41 (рисунок 1). Этот метод был использован для visualizэ, когда проксимальных канальцев вернуть их реабсорбции имуществом после ОПН, что позволяет один оценку восстановленной физиологической функции ³⁰ (рисунок 1). Еще одной особенностью в проксимальных канальцах нефрона является то, что эпителиальные клетки в этом сегменте имеют щеточной каемки ³⁷ показывает, что высокие уровни эндогенного активности щелочной фосфатазы. Таким образом, проксимальный эпителий может быть локализован визуально в почке взрослого данио с помощью метода флюоресценции на основе известного как Эльф (меченного ферментом флуоресценция) -97 ^47.

Здесь мы описываем, как выполнить люминесцентные анализы декстран поглощения ^30,48 в почке взрослого данио, так, чтобы получить функциональную оценку проксимальных канальцах и карта размер и контуры этого сегмента канальцев. Далее мы опишем методы, чтобы маркировать проксимальных канальцах регионы взрослого нефрона с флуоресцентной метки щелочной фосфатазы. В-третьих, мы показываем впервые, что Родамина с метками лектин Dolichos biflorus агглютинином (DBA), который был использован в качестве общего маркера из собирательных трубочек в почках млекопитающих ^49, отмечает дистальных канальцах взрослого данио почки. Как DBA является взаимоисключающим с щелочной фосфатазы окрашивания, эти ярлыки обеспечивают способ широко отличить пан-проксимально против пан-дистальных участках взрослого данио нефрона. На протяжении реализации этих флуоресцентных красителей в обоих всей горе и криостатных гистологических срезах, мы соотнести эти этикетки с доменов экспрессии генов растворенного вещества транспортеров, которые уникально идентифицируют каждый сегмент нефрона. Поэтому этот протокол также содержит руководство модифицированных процедур обработки тканей для взрослых тканей всей горе в гибридизация анализа (по желанию) на основе проведенного нами эмбриона WISH протокола ^50. Эти процедуры могут быть использованы в различных комбинациях (рисунок 2) к документу морфологические и функциональные признаки выводае взрослых нефроны данио почек. Таким образом, эти протоколы могут быть применены к регенерации исследований, фенотипической характеристики других моделей почечной недостаточности, и даже используется для изучения формирование взрослого почки.

протокол

Процедуры для работы с данио, описанной в этом протоколе были утверждены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животных на в Университете Нотр-Дам. Примечание: руководство почек и нефрона анатомии у рыбок данио предоставляется (Рисунок 1). Обзор методик, описанных в данном протоколе выполнен в виде блок-схемы (рисунок 2), чтобы проиллюстрировать, как несколько процедур маркировки может быть выполнена на том же образце почек. Для части 7 по подготовке желать исследований почек взрослых, шаги, приведенные здесь показывают, как изменить обработку эмбрионов рыбок данио, как недавно опубликовал ^50, чтобы обеспечить техническое руководство для успешного анализа WISH органа почек.

1 взрослых данио внутрибрюшинного введения с Декстраном интересов

1. Подготовьте нужный флуоресцентно меченого декстрана запаса (ов) путем растворения порошка декстран в дистиллированной воде при концентрации50 мг / мл, то хранить аликвоты в микропробирок при -20 ° С в темноте. Примечание: Различные флуоресцентно меченных декстранов являются коммерчески доступными. Выберите декстран для использования на основе сочетания других лейблов, которые желательны, и убедитесь, что соответствующие флуоресцентные фильтры доступны с микроскопами, которые будут использованы. Лизин-поправимо декстраны показать флуоресценцию без каких-либо дальнейших шагов маркировки в образцах живых, незакрепленного образец ткани от эвтаназии образцов, и фиксированные образцы.
2. Оттепель нужный декстран запас и хранить на льду в темноте при выполнении шаги 1.3-1.5. Оберните микроцентрифужную пробирку алюминиевой фольгой для защиты от света при работе.
3. Обезболить взрослую данио между 5-7 месяцев в возрасте, помещая рыбу в блюдо, содержащей либо 0,02% Tricaine или 0,001% 2-феноксиэтанол в течение приблизительно 1 - 2 мин. Примечание: Желательно использовать взрослых данио из этой возрастной потому молодые рыбы может иметь SMALL почки, которые трудно анализировать, и образцы почек от старых рыб могут содержать массу рубцовой ткани, которые не могут быть проанализированы. При правильном наркозом, взрослых данио не будут проявлять реакцию на ощупь стимуляции, которые могут быть проверены с помощью ложки или тупой зонд осторожно касаться хвостовой плавник рыбы.
4. Использование пластмассовую ложку, поднять рыбу из тарелки перелейте раствор и осторожно поместите животное на мокрой губкой плесени, брюшной стороной вверх.
5. Использование 31 G 1,0 куб инсулиновый шприц, вводят 20 мкл талой декстран раствора в внутрибрюшинного пространства. Расположите иглу так, чтобы вставка происходит под небольшим углом на вентральной средней линии живота. Чтобы избежать прокалывания органов, вставить иглу затем слегка приподнимите его, чтобы поднять тела стенку рыбы и создать пространство, в котором впрыснуть декстран решение ^48. Примечание: В качестве альтернативы, декстран изображения может быть разбавлен, например, в соотношении 1: 2 или 2: 1 (декстрана: диспропашных воду), чтобы уменьшить фоновой флуоресценции в образце.
6. Аккуратно вернуть рыбу в бак, чтобы восстановление после анестезии. Примечание: Поглощение Декстрана, проксимального отдела канальцев происходит в течение 8 - 12 часов и может быть обнаружено по крайней мере до 3 дней после инъекции (точек на дюйм). Анализ на 3 точек на дюйм обеспечивает сильную канальцев сигнал с низкой фоновой флуоресценции в почечных стромальных населения. Перейдите к части 2 для всей экспертизы монтирования декстран поглощения в одиночку, если дополнительная маркировка не требуется. Для комбинаторной маркировки, перейдите к части 3, чтобы подготовить ткань для всей экспертизы монтирования декстран поглощения, то часть 4 к двойным этикетка с щелочной фосфатазы и / или части 5, для выполнения DBA двойные или тройной маркировки. Для исследований с использованием гистологических срезов, перейдите к части 6 Инструкции о том, как сделать тонкие слои почки с использованием криостата и как окрасить их с различными лейблами и / или иммуногистохимии с первичной и вторичной Antibodies.

2 Вскрытие и плоским Mount Подготовка почек взрослых данио рерио от незафиксированного образца животных визуализировать Люминесцентная декстран маркировке проксимальных канальцах

1. Усыпить декстран впрыском взрослых данио, поместив его в блюдо с 0,2% Tricaine рН 7,0 для 4 - 5 мин. Примечание: Убедитесь, что рыба была эвтаназии, прежде чем продолжить, путем мониторинга тщательно ли жабры перестали движение и сердце перестало биться ^36.
2. Использование пластмассовую ложку, поднять рыбу из раствора Tricaine перелейте раствор и поместить животное на ткани или бумажным полотенцем.
3. Используйте острый пару рассечение ножницами, чтобы сделать разрез позади жаберной крышечки и удалить голову.
4. Сразу открыть тело рыбы с рассечение ножницами, сделав долгий вентральный вырез от головы до основания хвостового плавника.
5. Снимите внутренние органы рыбы, используя пару тонких щипцов.
6. С помощью супер-тонкие рассечение иглы к контакту с открытым стенки кузова, с тем, чтобы позволить визуализацию органа почек, который прилегает к спинной стенке животного.
7. Используйте тонкий пинцет, чтобы отсоединить почку от дорсальной стенки.
8. Аккуратно почку в стекл нный сосудик 5 мл 1X PBS, содержащего и промыть 3 раза с 3 - 5 мл свежей 1X PBS в течение 5 минут каждый. Примечание: Использование стеклянный флакон для обработки образцов почек у взрослых облегчает визуализацию ткани и позволяет промывок больших объемах (по отношению к массе ткани) примерно 3 - 5 мл. С другой стороны, клетки культуральной чашке 12-также может быть использован. В то время как пластик микроцентрифужных трубки могут быть использованы стандартные пробирки размером (1,5 мл) мог бы ограничить мытье.
9. Снимите почку с передачи пипетки и место на чистую стеклянную пластинку с 1-2 каплями 1X PBS.
10. Используйте тонкий пинцет, чтобы сгладить почку на слайде, убедившись, не ткань не свернулась или иным отменилна себе. Примечание: В качестве альтернативы, средство вольфрамовой проволоки может быть использован, чтобы сделать небольшие разрезы в соединительной ткани, чтобы облегчить плоскую позиционирование почки.
11. Поместите небольшие кусочки пластилина на каждом углу 18 х 18 мм покровным стеклом и медленно установите покровное на почки. Примечание: Слегка угол покровное в ходе размещения, чтобы минимизировать образования пузырьков в растворе ^50. Формовочной глины дерн примерно 2 мм в диаметре (Рисунок 2A). Кроме того, дерн из вакуумной смазки может быть заменен вместо пластилина. Добавление дополнительного каплю 1X PBS, чтобы заполнить пространство между покровное стекло и, если это необходимо.
12. Наблюдать и / или изображения почку, поместив предметное стекло в поле зрения на стереомикроскопа или сложного микроскопа с соответствующим фильтром. Примечание: Обратитесь к рисунку 2А для макроскопического появления этого препарата слайд.

3 FIXaние, Рассечение, Пермеабилизации и Удаление пигментации почек взрослых данио рерио

1. Приготовьте свежий фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA) / 1X PBS / 0,1% ДМСО или оттаивают замороженную аликвоту 4% PFA / 1 X PBS и добавляют 0,1% ДМСО. Внимание: PFA является токсичным и решения PFA должны быть обработаны на химическом капотом, а носить соответствующие средства индивидуальной защиты, в том числе перчатки и халате. Кроме того, PFA порошок следует использовать с осторожностью при принятии исходного раствора.
2. Заполните рассечение лоток с достаточным фиксирующего раствора, чтобы погрузить весь животное.
3. Усыпить и смонтировать выбранное данио в фиксирующем растворе (обратитесь к пунктам 2,2-2,6). Примечание: Выбранная рыба может быть необработанной образец данио почек или почки выделяют из рыбок данио, что ранее принятого внутрибрюшинную декстран инъекции (часть 1).
4. Закрепите образец O / N (12 - 16 ч) при 4 ° ^С.
5. На следующий день, использовать тонкий пинцет для уходаполностью отсоединить почку от дорсальной стенки тела и поместить на органе в стеклянный флакон с использованием передачи пипетки. Примечание: В качестве альтернативы, 12-а и 24-луночные культуральные антенна может быть использована. В то время как пластик микроцентрифужных трубки могут быть использованы стандартные пробирки размером (1,5 мл) мог бы ограничить мытье.
6. Вымойте расчлененный почки 3 раза с 3 - 5 мл 1X PBS с 0,05% Твин для 5 минут каждый.
7. Извлеките 1X PBS с 0,05% Tween и промыть почки с 3 мл 5% раствора сахарозы (в 1X PBS) в течение 30 мин.
8. Заменить 3 мл 30% раствора сахарозы (в 1X PBS) и магазина O / N (12 - 16 ч) при температуре 4 ° ^С. Примечание: растворы сахарозы проницаемыми клеточные мембраны, впоследствии позволяя определенную маркировку реагентов, как они проникают в ткани.
9. На следующий день, удалить 30% раствора сахарозы и промыть почки 2 раза с 5 мл 1X PBS с 0,05% Tween в течение 5 мин каждый.
10. Замените 1X PBS с 0,05% Твин с 3 -5 мл отбеливающего раствора для удаления меланоцитов пигментацию нынешний на органе почек.
11. Поместите стеклянный пузырек на ротатора и внимательно следить, как пигментация исчезает. Примечание: Депигментация обычно занимает около 20 мин, когда выполняется после сахарозы лечения, но иногда может занять до 60 мин. Если отбеливание раствор оставляют на почки слишком долго, распад органа может произойти; рекомендуется контролировать образца каждые 10-15 минут, чтобы проверить целостность тканей.
12. Когда пигментации был удален из почки, дважды промывали 3 - 5 мл 1X PBS с 0,05% Tween.
13. Заменить 1X PBS с 0,05% Tween с 3 - 5 мл 4% раствора PFA в течение 1 ч при комнатной температуре.
14. Снимите 4% раствор PFA и мыть почках 3 раза с 3 - 5 мл 1X PBS с 0,05% Твин в течение 5 мин каждый. Примечание: После того, как будет завершена фиксации, почки, также могут быть установлены на предметное стекло и оценивали на декстрана поглощения SAN, меланоцитов pigmентация, выполняя шаги 2.8-2.12.
15. Извлеките 1X PBS с 0,05% Tween и заменить 3 - 5 мл блокирующего раствора, а затем инкубируют при комнатной температуре в почку в блоке в течение 2 часов.
16. При блокировании завершения, перейдем непосредственно к выбранному протоколу окрашивания. Примечание: почки теперь могут быть обработаны с помощью одного или нескольких других процедур для проведения исследований маркировки с различными реагентами. Для всей горе маркировки проксимальных канальцах только с щелочной фосфатазы, перейти в разделе 4 для монтирования всей маркировки только дистальных канальцах идти в разделе 5 Кроме того, разделы 4 и 5 могут быть выполнены в линейной последовательности для двойной обнаружения во всей крепления .

4 Маркировка взрослого почек проксимальных канальцах сегменты щелочной фосфатазы обнаружения

1. Снимите блок и мыть почках 3 раза 3 - 5 мл 1X PBS с 0,05% Твин в течение 5 мин каждого, а затем заменить 1X PBS с 0,05% Твин с 3 - 5 млиз 1X PBS. Пусть почек впитаться в течение 10 мин. Примечание: В течение этого времени передачи почку 12-а и 24-а культуральную чашку, если ткань была сохранена в стеклянную ампулу для предыдущих стадий обработки.
2. Заменить 1X PBS с достаточной рабочей щелочного раствора субстрата фосфатазы (обратитесь к комплекту обнаружения, расположенный в таблице материалов), чтобы покрыть образец, затем поместить образец на ротатора в течение 30 мин при комнатной температуре. Держите образец защищенном от света месте.
3. Остановить реакцию путем промывания почек в щелочном растворе буферной фосфатазы стирки.
4. Промойте почку с 3 сменами буферного раствора стирки более 10 - 15 мин. Примечание: После этого шага, перейдем непосредственно к части 5, Шаг 5,1 (таким образом, временно опуская шаги 4,5-4,6), если маркировка с DBA также желательно. Необязательный шаг: Для маркировки и визуализировать клеточные ядра в органе, смочите почку пропидийиодида решения. Подготовьте пропидийиодида запас путем растворения порошка в ConCentraние 1 мг / мл (1,5 мМ) в дистиллированной воде. Развести запас до 500 нм в 2Х SSC и инкубировать почку в этом растворе в течение 30 мин. Промыть 1X PBS и перейдите к шагу 4.5.
5. Снимите мыть буферный раствор и смонтировать почку на чистую стеклянную пластинку в фосфатазы монтажной среды, входящей в комплект маркировки (Смотрите пункты 2.9-2.12). Примечание: гистологическая среда заменил 1X PBS, начиная с шага 2.9.
6. Визуализируйте щелочной фосфатазы окрашенных почек с использованием стереомикроскопа или сложный микроскоп с / DAPI фильтра набора Hoechst. Примечание: Факультативный шаг: Визуализируйте йодид пропидий использованием тетраметил-родамин (TRITC) или Texas красный фильтр.

5 демаркации взрослых почки дистальных канальцах сегменты родамином DBA

1. Подготовьте 200 мкл рабочего DBA решение путем разбавления DBA (2 мг / мл) 1: 100 в 1X PBS.
2. Заменить 1X PBS с 0,05% Tween раствора с раствором DBA 200 мкл.
3. Поместите на ротатор для1 ч при комнатной температуре.
4. Снимите DBA решение и мыть почках 3 раза с 3 - 5 мл 1X PBS в течение 5 минут каждый. Примечание: Факультативный шаг: Для маркировки и визуализировать клеточные ядра в органе вместе с лейблом DBA, смочите почку в растворе DAPI для обнаружения с Hoechst DAPI фильтра / (родамин DBA пятно может быть обнаружено с TRITC или Texas красным фильтром). Подготовка исходного DAPI путем растворения порошка в концентрации 5 мг / мл (14,3 мм). Развести запас до 300 нМ в 2Х SSC и инкубировать почку в этом растворе в течение 20 мин. Промыть 1X PBS и перейдите к шагу 5.5. Если часть 4 обработки была выполнена, имейте в виду, что DAPI и щелочной фосфатазы оба обнаруженного с фильтром / DAPI Hoechst.
5. Снимите 1X PBS и смонтировать почку на чистую стеклянную пластинку (обратитесь к пунктам 2.9-2.12).
6. Визуализация DBA-окрашенных дистальных сегментах почки, используя стандартный TRITC или Техасский красный набор фильтров на флуоресцентного стереомикроскопа или сложного микроскопа. Примечание: Дополнительные секТЭП: Визуализируйте DAPI, используя фильтр / DAPI Hoechst.

6 Вложение, Cryosectioning и окрашивание (Vital Красители и Иммуногистохимия Маркировка) из взрослых данио рерио почечной ткани

1. Выберите рыбу для анализа, то эвтаназии, исправить, и проницаемыми, как описано (шаги 3,2-3,8). Примечание: Фикс взрослых рыб в 9: 1 этанол: формальдегида / 0,1% ДМСО вместо 4% параформальдегида / 1X PBS / 0,1% ДМСО для процедуры cryosection для получения разделы для декстрана, щелочной фосфатазы, и DBA визуализации. Однако, имейте в виду, что параформальдегид основе фиксации могут быть совместимы для некоторых процедур иммуногистохимических. Кроме того, отбеливание взрослого почек не требуется для анализа cryosection, потому что меланоциты поверхностны и не влияют на визуализацию нефрона клеток, которые составляют "внутри" органа почек.
2. На следующий день, снять 30% раствор сахарозы и заменить 1: 1 замораживания тканей среды: 30% sucrosE в течение 4 ч при комнатной температуре.
3. Снимите 1: решение 1 и вставлять образцы в почках в 100% ткани замораживания среды в cryomolds и место при -80 ° ^С в течение не менее 1 часа.
4. Поперечно сократить серийных срезов, толщиной примерно 12 мкм, через всю взрослую почку.
5. Установите замороженные криосрезы на клеевых микроскопа и дайте высохнуть на воздухе в течение 1 часа при 50 ^° С.
6. Магазин скользит при -80 ^{° С} до использования.
7. Когда криосрезы готовы быть помечены, удалить предметных стекол от -80 ° ^С и места на слайде теплой при 50 ° ^С в течение 45 мин.
8. Использование жидкого ручку блокатор, нарисуйте круг вокруг криосрезов и дайте высохнуть в течение 15 мин на слайде теплее на 50 ^° С.
9. Удалить слайды из слайда теплой и поместите квартиру в камере влажности при комнатной температуре.
10. Увлажняет криосрезов добавлением 1X PBS с 0,05% Tween к окруженной части слайдов в течение 20 мин. Примечание: около 200 - 300 &# 956; л необходим для покрытия каждый окруженную часть на слайде.
11. Заменить 1X PBS с 0,05% Tween раствора со свежим 1X PBS и инкубировали в течение 10 мин.
12. Удалить 1X PBS и инкубируют криосрезов в блокирующем растворе в течение 2 часов. Примечание: Для 10 мл блокирующего раствора, объединить 8 мл 1X PBS с 0,05% Твин, 2 мл эмбриональной телячьей сыворотки и 150 мкл ДМСО. Для выполнения иммуногистохимии после стадии блокирования инкубировать слайд с нужной первичным антителом, разведенным в свежем блока O / N при температуре 4 ^{° С,} мыть один раз с помощью 1X PBS с 0,05% Tween, инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре раствором вторичного антитела, разбавленного в 1X PBS с 0,05% Твин, мыть один раз с помощью 1X PBS с 0,05% Твин, и смонтировать покровное на слайде с монтажной среды. Необходимые антител разведения будет меняться и испытания должны быть выполнены, чтобы выбрать оптимальные разведения. Извлечение антиген может также способствовать иммунного, и выполняется перед блокированием. Сразу после горки оттаивают при 50 ^о С(Шаг 6.8) инкубировать криосрезы между 95 ^{° С-100} ° С в течение 40 мин в разогретой 10 мМ цитрата натрия буфера. Охладите слайды в течение 30 мин, затем промыть два раза в 1X PBS с 0,05% Твин, и перейдите к шагу 6,11.
13. Удалить блокирующий раствор и промыть криосрезов 3 раза 1X PBS в течение 5 мин каждый.
14. Заменить 1X PBS с окрашиванием DBA раствора и инкубируют в течение 1 часа. Примечание: Развести 1 мкл DBA в 99 мкл 1X PBS, чтобы сделать красящий раствор 100 мкл.
15. Снимите окрашивания DBA решение и мыть криосрезы 3 раза 1X PBS в течение 5 минут каждый.
16. Применить щелочной фосфатазы этикетку и инкубировать на криосрезов в течение 10 мин.
17. Вымойте щелочной фосфатазы и выключение криосрезов с серией 3 стирок промывочного буфера в течение 10 минут каждый. Примечание: 100 мл раствора буфера для промывки, объединяют 5 мл 0,5 М ЭДТА и 120 мг левамизола в 95 мл 1X PBS. Для маркировки ядра, инкубировать разделы с пропидийиодидом или DAPI в диlutions отмечалось ранее (шаги 4,4, 5,4, соответственно) в течение 30 мин при комнатной температуре. Выбор окрашивающим ядра, совместимую с комбинацией других флуоресцентных красителей, которые были выбраны.
18. Удалите всю жидкость из криосрезов и поместите 2 капли монтажа среды на предметное стекло.
19. Осторожно поместите микро покровного стекла на предметном стекле микроскопа. Криосрезы теперь готовы изображение с соответствующим фильтр (ы).

7 WISH Обработка для взрослых данио образцов почек

1. Выберите нужные данио образец (ы), эвтаназии, исправить и рассекают почку, как описано (шаги 3.1-3.5). Примечание: Очень важно использовать фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA) / 1X PBS с 0,1% ДМСО в проницаемыми почку. Поместите почку в стекл нный сосудик для легкой визуализации во время последующих этапов обработки.
2. Снимите фиксатор и мыть почку дважды 5 мл 1X PBST.
3. Снимите 1X PBS и мыть почки в два раза Wiго 100% метанола, затем инкубировать почку при -20 ° С ^в течение не менее 20 мин, чтобы проницаемыми. Примечание: расчлененный почки могут храниться бесконечно -20 ° ^С.
4. Увлажняет почку, выполняя серию 5 мин моет с 3 - 5 мл 50% метанола / 1X PBST, 30% метанол / 1X PBST и дважды 1X PBST.
5. Bleach почку, чтобы удалить пигментацию, как описано (шаги 3,10-3,14).
6. Лечить почки с 10 мкг / мл протеиназы K / 1X PBST с 0,1% ДМСО в течение 20 мин, затем смойте дважды 1X PBST и после исправления в 4% PFA / 1X PBST в течение 20 мин до O / N. Примечание: Всегда подготовить протеиназы К рабочий раствор непосредственно перед образца пищеварения путем объединения 50 мкл свежей талой протеиназы K складе (10 мг / мл), 50 мл 1X PBST и 50 мкл ДМСО.
7. Обработайте почку для одинарной или двойной WISH, выполненного для синтеза рибозондом, предгибридизацию, гибридизации анти-дигоксигенин / анти-флуоресцеин инкубации антител и DETECние, как недавно описал ^49. Примечание: вся гора изображений пятен почек следует проводить в течение нескольких дней проведения реакции окрашивания. Нефрона пятна, как правило, исчезают очень быстро, особенно красные подложки этикетки. Для нефрона фотографии, плоским крепление образца почки, как описано выше в шагах 2,10 до 2,12, и изображение, используя стерео-или сложный микроскоп. Дифференциального интерференционного контраста фильтры могут быть использованы, чтобы лучше визуализировать клеточные контуры нефронов, чтобы облегчить анализ проб.

Результаты

Каждый из протоколов проводили на данио дикого типа. Примеры полученных данных документ нормальный структурный состав и свойства нефронов в рамках здорового взрослого данио почки. Взрослый данио обладает мезонефрос или вторую форму почек, что находится на спинной стенке тела (Рисунок 1А). Взрослый почек является относительно плоским и содержит так называемый голова, туловище и хвост область с поверхностных меланоцитов, разбросанных по всему этих регионах (Рисунок 1А). Почечная ткань содержит разветвленную массивы нефронов, которые соединяют и истощают в центральных каналах Сбор (Рисунок 1А). Каждый нефрона поляризован вдоль его длины, с фильтром в крови (или почечного тельца) на одном конце, за которым следует набор сегментов канальцев, и, наконец, заканчивающийся на канале, который собирает решение, которое будет выделено (фиг.1А). Каждый взрослый нефрона трубочка содержит ближним и дальним SegmenTS клеток, разграничены по экспрессии специфических растворенных транспортеров ^30,31,36,37, которая сохраняется с сегментной рисунком, демонстрируемого эмбриональных нефронов ^31-35 (фиг.1В). Например, cubilin стенограммы отметить проксимальных канальцах ³⁹ (РСТ и PST) и clcnk стенограммы отметить дистальных канальцах ³² (DE и DL) (Рисунок 1В). Кроме того, сегмент РСТ отличается экспрессией slc20a1a, PST отличается экспрессией slc13a1, DE отличается экспрессией slc12a1, и DL отличается экспрессией slc12a3 ³²   (Фиг.1В). Различия между взрослых нефрона канальцев по сравнению с эмбриональными них является то, что дистальные сегменты отображения свертки (DE, DL) и ветви сегмента DL широко во взрослом, который отличается от линейной, не-разветвленной анатомии этих регионах в EMBRлет ^30,31,36,37 (1А). В обоих взрослых и ³⁰ эмбриональной ^38-41 нефрона канальцев, эпителий РСТ можно отличить благодаря своим свойствам эндоцитотических и могут быть визуализированы и оценивали reabsorptive функции основан на способности к поглощению флуоресцентные конъюгаты декстран (рисунок 1b). Кроме того, как показано в последующих фигур, взрослого проксимальных канальцах (PCT и PST, или пан-проксимальная область) помечена щелочной фосфатазы, а дистальный каналец (DE и DL, или пан-дистальной области) помечена DBA (фиг.1В). Методы, используемые в данном документе, чтобы этикетка взрослых данио сегментов нефрона с помощью декстран поглощения, щелочную фосфатазу, DBA, иммуногистохимии или желание может быть выполнено в различных комбинациях, в целом, либо с креплением гистологических срезах почечной ткани (рисунок 2). Это позволяет большую гибкость и разнообразие, когда нефрон состав должны быть оценены (На рисунке 2).

Взрослых почек может быть установлен горизонтально на предметное стекло для анализа, с дерн по пластилином (или в качестве альтернативы, вакуумной смазки) используется для приостановки покровное над тканей (фиг.3А). Как типичная длина почки составляет примерно 5-7 мм, она имеет размеры, способствующей изображений на стерео или сложного микроскопа (фиг.3А). Под светлого освещения, поверхностное население меланоцитов с черной пигментацией могут быть визуализированы в ассоциации с почечной ткани, и сосудистой такие как аорты можно видеть, потому что циркулирующих эритроцитов имеют красный оттенок (фиг.3В). После внутрибрюшинного введения декстрана-FITC, РСТ доменов, расположенных на территории первичной почки были еще помечены 3 дня спустя, и отображаемого использованием FITC фильтр на флуоресцентным микроскопом (Рисунок 3C). В то время как меланоциты частично заслонять визуализацию отдельных почечных канальцев (FIGURe 3C '), меланоциты не мешают количественное определение числа нефрона или оценки диаметра и длины трубочки. После внутрибрюшинного введения декстрана фтор-рубин, отбеливание установленного образца устранили меланоцитов пигментацию, и сегменты РСТ наблюдались с только яркого освещения поля (Рисунок 3D). Липидные капли из брюшной полости тела иногда можно увидеть в сочетании с препаратами целых органов (почки фиг.3А) сегментов .Individual РСТ показать свертки, катушки (рисунок 3D "), но также может быть охарактеризовано относительно линейных отрезков (рисунок 3D").

Различные декстрановые сопряженные условии разные уровни общей ясности в проксимальных канальцах маркировки. В частности, декстран-FITC или декстран фтор-рубин привело к хрустящему картофелю нефрона этикетки с минимальной фоне (Цифры 3C-D "). И декстран каскад Bluе и Lucifer желтый конъюгаты показал поглощение проксимальный канальцев у взрослого почек (рис 4а, 4b). Интересно, что почки подвергаются декстрана каскадного синего показали относительно конкретного флуоресценции РСТ с некоторым фоне (Рисунок 4А, 4А '), в то время как почки подвергаются декстрана Люцифер желтый был помечены сегменты РСТ, но показал заметное фонового сигнала, с неспецифической флуоресцентного окрашивания настоящее протяжении в почечной стромы, или пространство между нефронов (фиг.4В, 4b '). И, наконец, использование декстран-фтор при условии, рубин превосходную проксимальных канальцах маркировки, с минимальным или без фона, даже если смотреть в диапазоне от разных увеличениях (фиг.4С, 4C '). Во всех случаях, отличительной трубчатая структура декстран поглощения коррелирует с желанием выражения транскриптов, кодирующих slc20a1a, установленный РСТ-специфическим маркером ^30-32 (Рисунок 4D). Nephrпо сегментам РСТ, окрашенных slc20a1a антисмысловом Riboprobe отображается S-образные катушки РСТ, а также менее резко, закрученные сегменты РСТ (Рисунок 4D '), как это наблюдается в течение меченых декстран анализов (Рисунок 3D', 3D ").

Другие препараты почек, такие как обнаружение проксимальных канальцах активности щелочной фосфатазы (5А, 5В, 5С) были выполнены аналогично после удаления меланоцитов пигментации. Это позволило проксимальных канальцах нефрона визуализации и анализа без любых препятствий. Эндогенный щелочной фосфатазы реактивность в нефрона является одним из основных признаком проксимальных канальцах ^1,47. Щелочной фосфатазы окрашивание высоко специфичен для проксимальных регионах нефрона, по сравнению с пан-проксимальной экспрессии WISH структуре гена cubilin ³⁹ (рисунок 5D, 5D '). Щелочная химическая фосфатазы был наиболее интенсивным в пихтыул раздел проксимальных канальцах, что соответствует РСТ (Рисунок 5Б), аналогично образцу cubilin выражения (Рисунок 5D, 5D '), у которого также были высокие относительные уровни транскриптов в РСТ. РСТ отличалась немного шире диаметра, определенного выражения фактора транскрипции mafba (Рисунок 5E, 5E '), и конкретное выражение гена растворенного вещества транспортер slc20a1a (Рисунок 4D, 4D'). Щелочной фосфатазы реакционная также помечены участок проксимального канальца с более тонким диаметром, который соответствует PST сегмента (фиг.5В) на основе сравнения с конкретным участкам транскрипта экспрессии гена транспортера растворенного вещества slc13a1 (рисунок 5F, 5F '). Выражение WISH домены маркера РСТ slc20a1a и PST маркера slc13a1 являются взаимоисключающими (Рисунок 5G ), и внимательное изучение отдельных нефронов показали, что эти соответствующие домены примыкают, с мало, если зазор между ними, и что вместе они воспроизводят домен экспрессии cubilin (черные стрелки в. Рисунок 5G », 5G", 5G "' ).

Для дальнейшего подтверждения отношение щелочной фосфатазы реактивности с проксимального канальца идентичности, вся монтировать со-маркировки щелочной фосфатазы окрашивания проводили на почки от данио, которые получали внутрибрюшинно инъекции декстран фтор-рубина 3 дней до (фиг.6А-С). Dextran фтор-рубин показал перекрытия с щелочной фосфатазы в просто шире диаметра участке проксимального области канальцев, что соответствует РСТ (примеры на рисунке 6D-I). Декстран-положительным домена резко остановился на том месте, где диаметр проксимальных канальцах разбавлять, то есть, где РСТ и PST встретились, (белая стрелкаголовы в рисунке 6), и только щелочной фосфатазы реактивности наблюдался в последующем сегменте PST (примеры на рисунке 6D-I). Фон флуоресценции от щелочной реакции фосфатазы также смутно изложил пару параллельных основных треков собирательных канальцев нашли во взрослом почки ^29,30 -ducts которые выделяются наличием самый широкий диаметр любой почечной связанных трубки (звездочки на рис 6А, 6D, 6E, 6G, 6H). Далее, со-маркировка нефрона канальцев с щелочной фосфатазы и декстран поглощения наблюдалась в анализе cryosection (Рисунок 6J, канальцев периметры изложил с белыми точками). В поперечном сечении, щелочной фосфатазы реактивность была отмечена в толстой полосы на апикальной поверхности трубчатого эпителия, в соответствии с щеточной каемки ультраструктуры, в то время как соответствующие трубчатые клетки цитозольного пространство показали, декстран фтор-рубиновый реактивность (рисунок 6J). Примечательно, staineд трубочки были либо дважды положительный результат на щелочной фосфатазы и декстран, приводит к их идентификации как сегментах РСТ, или по отдельности положительного для щелочной фосфатазы (Рисунок 6J, канальцев периметру изложены в желтых точек), что приводит к идентификации как сегмент PST (примечание: другой канальцы, присутствующие были отрицательными на обоих пятен, данные не приведены) (рис 6J). Кроме того, щелочной фосфатазы окрашивание (Рисунок 6K) был удачно сочетается с ядерной этикетке, пропидийиодидом (Рисунок 6 л), что облегчает подсчет клеток (наложения на рисунке 6М).

Дистальных канальцах взрослого данио нефрона метили родамина-сопряженных DBA (рисунок 7). Всего крепление двойной маркировки с DBA и щелочной фосфатазы проводили на почки от дикого типа данио (7А-С). DBA и щелочной фосфатазы реактивность не показали перекрытие в нефрона канальцев ( Рисунок 7D-H). DBA окрашенные трубочки показали заметно тоньше диаметра по сравнению с щелочной фосфатазы положительных канальцев, и DBA канальцы часто разветвленный (белые стрелки, рис 7G, 7H, 7J), в то время как ветвление никогда не наблюдалось в канальцев сегментов, окрашенных щелочной фосфатазы. Почечные криосрезы были собраны из дикого типа данио, которые несут трансген, в котором ENPEP промотора приводит в EGFP (Tg: ENPEP: EGFP), как GFP этикеток как проксимальный и дистальные канальцы нефрона ⁵¹ (7i) Рис. Иммуногистохимическое была выполнена для обнаружения GFP, таким образом, чтобы маркировать все почечных канальцев (зеленый, рис 7I), а затем с помощью флуоресцентного мечения щелочной фосфатазы и DBA (бирюзового и красного, соответственно, рис 7i). Анализ канальцев разделов показало, что трубочки были либо положительным для щелочной фосфатазы или DBA, но не оба этикетки (Рисунок 7I). Только редко ваннаULES показали реактивности ни с щелочной фосфатазы, ни DBA пятна, возможно, связано с углом разделе канальцев (белая стрелка, рис 7i). Кроме того, окрашивание DBA успешно объединены в целом монтажа окрашивания почек с ядерной этикетке DAPI (Рисунок 7J), снова подчеркивая характерный разветвленную природу дистальных сегментов канальцев (белые стрелки, рис 7J).

Далее, для дальнейшего сравнения образцы поглощение FITC-декстрана, щелочной фосфатазы, и DBA, тройной маркировки исследовали с помощью внутрибрюшинной инъекцией взрослых данио с декстран-FITC, с последующим выделением почек 3 дней с последующим cryosectioning и окрашивание щелочной фосфатазы и DBA (Примеры, приведенные на рисунке 8A-E). Почечных канальцев показал три категории комбинаций этикеток: канальцы, которые были дважды положительный результат на щелочной фосфатазы и декстрана обозначается сегментов РСТ (белые пунктирные линии), TUBULэс положительные для щелочной фосфатазы в одиночку обозначается сегменты PST (желтые пунктирные линии), и дистальных канальцев метили только DBA (красная пунктирная излагаются 8А-Е). Кроме того, только DBA положительный трубочки выставлены точки ветвления (Рисунок 8E). В результате анализа WISH, эта своеобразная ветвление из дистальной, DBA положительные канальцев коррелируют с паттернов экспрессии генов растворенного транспортеров транскриптов, которые являются специфическими для дистальных отделах канальцев (Рисунок 8F-I). Стенограммы кодирующие clcnk, который знаменует весь дистальных канальцах (DE и DL) были тонкими в диаметре, в изобилии в почках, и содержащиеся точки ветвления (черный наконечник стрелы Рисунок 8F, 8F »). Для сравнения, сегменты канальцев, что показали экспрессию slc12a1 или slc12a3, являющихся маркерами ДЭ и DL, соответственно, были менее многочисленны в образцах почек в целом по сравнению с clcnk выражение (сравните Рисунок 8 G и 8F, 8H). Кроме того, канальцев сегменты, которые выразили slc12a1 были редко, если вообще, разветвленной (рисунок 8 г, 8G '), в то время как канальцев регионы, выраженные slc12a3 часто разветвленные в характерных Вертушка-как механизмов (Рисунок 8H, 8H', 8h ", 8h" ' , черные стрелки). Наконец, дважды WISH для маркера РСТ slc20a1a и дистальной маркера clcnk показали, что эти пятна не были перекрытия (рисунок 8i). Примечательно, что участки slc20a1a экспрессирующие сегментов РСТ не были прикреплены к clcnk экспрессирующие канальцы, который, как ожидается, так как PST находится между этими регионами (Рисунок 8i). Взятые вместе, анализы маркировки почечные канальцы с декстран поглощения, щелочной фосфатазы реактивности, DBA, и желать конкретных генных транскриптов, позволяет различения проксимальных против дистальных отделах.

т "FO: держите-together.within-страницу =" всегда ">
Рис.1 Nephron анатомия в взрослых данио почки. Принципиальные чертежи (А) взрослого данио почек и (B) сравнительную таблицу сегментных молекулярных характеристик, проявляемых взрослого и эмбриональные данио нефронов. (А) (слева вверху) взрослых почки плоский орган, расположенный на спинной стенке тела. (Вверху справа), При осмотре брюшной точки зрения, почек имеет характерный изогнутый морфологию, состоящий из головы, туловища и хвоста регионах, а также имеет поверхностное население связанных меланоцитов. Расширение (внизу слева) показана схема типичной нефрона дерева во взрослом данио почки, в котором каждый отдельный нефрона обладает фильтр крови (почечная корпускулярно) на одном конце, с последующим проксимальных канальцах, дистальных канальцах, и канал. Цветные схематично (боttom справа) показывает линейную схему одного взрослого нефрона дерева, чтобы сравнить характеристики сегментов с таковыми из эмбриональных нефронов (B). Данио нефроны эмбрион содержат канальцев сегменты, которые включают проксимальных извитых канальцев (РСТ), ближний прямой трубочку (PST), дистального рано (DE), и дистальной поздно (DL), с соответствующей генных областей экспрессии, перечисленных ниже. Нефронов в взрослых данио имеют аналогичный состав сегментарный и аналогично молекулярной подписи на основе доменов экспрессии генов, которые кодируют растворенных транспортеры, хотя заметным отличием по сравнению с эмбрионом в том, что несколько нефронов могут быть объединены с помощью разветвленной сегмента DL. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2 Блок-схема на карте, показывающим соотношение между методами, изображенных в данном протоколе, с указанием того, методы могут быть выполнены по отдельности или в комбинации сборных. После внутрибрюшинного введения меченого лизин-декстрана фиксации в взрослых данио, почки могут быть визуализированы в Весь крепление препарат, либо по отдельности, либо в сочетании с щелочной фосфатазы и / или DBA пятен. С другой стороны, выбранный данио почек могут быть рассмотрены после того, как гистологическое ткани срезов с помощью криостата. Разделы могут быть окрашены, чтобы маркировать многочисленные комбинации атрибутов, с помощью иммуногистохимии, ядерное окрашивание, окрашивание DBA, и / или щелочной фосфатазы реактивность. Кроме того, почечные секции могут быть визуализированы непосредственно на наличие лизина-декстрана фиксации захвата в сегментах РСТ. Наконец, выбранные почки могут быть обработаны для пространственно-временного выражения экспрессии генов с помощью WISH. Номера в скобках относятся к correspoнахождении частей протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 взрослых данио почек плоским смонтировать подготовку и применение для визуализации сопряженную декстран поглощения в сегменте РСТ нефронов почек. () Светлое изображение образца почек плоских смонтировать подготовку, в которой орган был расположенных плашмя на предметное стекло, с покровным размещенного в верхней части ткани, который покоится на четырех дерн из пластилина (ярко-розовый цвет). Здесь почек препарат отображаемого вместе с метрической линейки, чтобы обеспечить уменьшенную сравнение. Типичный взрослый почек составляет приблизительно 5-7 миллиметров (мм) от головы к хвосту. (В) Светлое изображение небеленойпочек. Черная пигментация соответствует рассеянного населения меланоцитов, найденных в ассоциации с почки, и аорта проходит вдоль средней линии почки. (C) Визуализация нефрона сегментов РСТ 3 дней после внутрибрюшинного введения 40 кДа декстран-флуоресцеин (FITC) , без отбеливания взрослого почки. РСТ сегменты видно по всему почки, но частично закрыт в связи с меланоцитов. (C ') Цифровой зум одного нефрона, с меланоцитов (белая стрелка). (D) Изображение взрослой почки 3 дня после внутрибрюшинного введения 10 кДа декстран фтор-рубин, фиксация почки, и отбеливания. Меланоцитов пигментации удаляли и регионы РСТ были визуализированы здесь на основе их эндоцитоза поглощения декстрана при светлого освещения. Липидные капли (стрелками) от живота иногда можно увидеть в ассоциации с образцами почечной ткани. (D ', D ") Repreтель изображения изобразить небольшие морфологические различия между сегментами РСТ. В то время как многие нефрон ПХТ Натянутая струна (D '), другие нефроны содержать РСТ регионы, которые имеют минимальный намотки (D "). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

. Рис.4 взрослых почки нефрон РСТ сегмент трубочка маркировка дикого типа данио были интраперитонально с одной люминесцентной декстран; Затем их почки исследовали через 3 дня после инъекции для визуализации РСТ. (А, А ') Декстран каскада синий, 10 кДа (В, В') декстран Lucifer желтый, 10 кДа и (С, С ') декстран F фтор-рубин, 10 кДа все преимущественно маркировать сегменты РСТ в почечных нефронов. Оба декстран каскад синий и Люцифер желтый шоу некоторые неспецифические маркировка населения стромальных клеток, расположенных между нефронов, с гораздо более высокой фоне наблюдаемого в Люцифера желтых обработанных почек. В отличие от этого, декстран фтор-рубин, наблюдалось значительное снижение фон с интенсивным маркировки РСТ. (D, D ') Взрослых почку осквернена хотите определить местоположение транскриптов, кодирующих slc20a1a, определенный маркер типа транспортера клеток РСТ. Домен выражение slc20a1a соответствует характерный образец декстрана поглощения наблюдается в почках, с распределением различных плотно свернутых / зацикленных доменов РСТ, а также более удлиненных РСТ участков, которые показывают последовательную широкий диаметр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию из этой фигуры.

ontent "FO: держите-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 5 Представитель результат окрашивания для щелочной фосфатазы, пан-проксимальных канальцах маркер, во взрослом данио почек по сравнению с другими маркерами проксимальных канальцев начисленных с WISH. (AC) Щелочная окрашивание фосфатазы (бирюзовый) освещает нефрона проксимальных канальцах, выделяя как РСТ и PST. (DF ') Одно пожелание на перечисленных генов (каждый в фиолетовый окрашивания). (D, D') паттерн экспрессии cubilin , пан-проксимальный (РСТ-PST) маркера, коррелирует с щелочной фосфатазы (D, D '). Для сравнения, желать mafba отмечает РСТ (E, E ') и slc13a1 отмечает PST (F, F'). В (GG "') двойной желать маркера РСТ slc20a1a </ EM> (красный) и маркер slc13a1 PST (фиолетовый) показывает, что сегменты, обозначенные этими маркерами не перекрываются, и довольно, что их области экспрессии занимать соседние места, когда одиночные нефроны тесно рассмотрены (G'-G "'). Черные стрелки указывают соединение между сегментами РСТ и PST, который, как правило, связанные с изменением диаметра канальцев от большого к малому, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6 щелочной фосфатазы и декстран поглощения шоу перекрытия в сегменте РСТ нефронов почек взрослых, и щелочной фосфатазы окрашивание совместим с ядерной сотрудничества маркировки с пропидийиодидом. (AI) Всего крепление препараты щелочной фосфатазы окрашивания, выполненного на почки от данио взрослых, которые ранее получала внутрибрюшинным декстрана фтор-рубина. Щелочной фосфатазы (бирюзовый) и декстран фтор-рубин (красный) показывают перекрытие в РСТ, но не в PST, который является единственным положительным для щелочной фосфатазы. Фоновые уровни щелочной фосфатазы освещают пару крупных протоков собирающих в каждой почки (звездочки, *), которые Отличительной В связи с широким диаметром. (AC) объединенного изображения и отдельные образы седла области одной почкой. (DF) и (GI) Два комплекта объединенных изображений и отдельных образов например нефронов. (Я) анализ Cryosection подтверждает сотрудничество маркировку щелочной фосфатазы и декстрана фтор-рубин в сегментах РСТ (изложенной в белых точек), в то время как щелочной фосфатазы в одиночку маркирует PST сегмент (они изложены в желтых точек). (KM) почкапомечены (K) щелочной фосфатазы (бирюзовый) и (L) пропидийиодидом (фиолетовый), что позволяет (M) объединены визуализацию клетках проксимальных канальцев и их ядер, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7 щелочной фосфатазы и DBA являются взаимоисключающими сегмента этикетки, которые отмечают пан-ближний и пан-дистальных отделах, соответственно, присутствующие в взрослых данио нефронов почек. (AH) Целые препараты горе в данио почек окрашивали щелочной фосфатазы и родамин-DBA. Щелочной фосфатазы (бирюзовый) и DBA (красный) не показывают перекрытие в почках. Фоновые уровни щелочной фосфаTASE осветить пару крупных протоков собирающих в каждой почки (звездочками, *), которые являются отличительной благодаря широкому диаметре. DBA положительные канальцы тоньше в диаметре и характеризуется часто в присутствии ветвления (белые стрелки). (Переменного тока) объединенного изображения и отдельные изображения седловой области одной почки. (DF) Один набор объединенных изображений и отдельных изображений Пример нефроны. (G, H) Дополнительные примеры, с разветвленными DBA канальцев наряду щелочной фосфатазы положительных канальцев, объединены изображения. анализ (Я) Cryosection подтверждает, что щелочной фосфатазы и DBA этикеток различных разделах канальцев, и только редкие трубочки показать ни лейбл (белая стрелка ), вероятно, связано с углом разделе для этого трубочку. Для этого анализа дикого типа трансгенной рыбы, Tg: ENPEP: EGFP, были использованы, и все почечных канальцах почек в этом были immunolabeled с первичным антителом для обнаружения GFP (J). вся гора окрашивание почек для DBA (красный) и DAPI (синий) (Объединенная изображения), снова показывая разветвленные дистальных сегментов канальцев взрослого нефронов (белый стрелок). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8 Трехместный маркировка взрослых криосрезов почек с декстран поглощения, щелочной фосфатазы и DBA сравнению с дистальной анализа сегмент WISH. Почки (AE) взрослых внутрибрюшинно вводили декстран-FITC (зеленый), и почки собраны 3 дня спустя для встраивания и cryosectioning. Окрашивание щелочной фосфатазы (бирюзовый) и DBA (красный) выявлены три популяции канальцев: сегменты РСТ, которые были положительными для щелочной фосфатазы реактивности и DEXTпобежал (они изложены в белых точек), PST сегменты, которые были положительно только для щелочной фосфатазы реактивности (изложенной в желтых точек), и дистальных отделах канальцев, которые были положительны для администраторов баз данных только (изложенной в красных точек), который также показал характерные точки дистальной ветви. ( н.э.) объединенного изображения и отдельные образы один пример разделе. (E) Merged образ другом примере раздела. (FI) Сравнение дистальных паттернов экспрессии генов трубочка одинарные (FH ») и дважды (я) WISH. (FH ') Одноместный WISH для перечисленных генов (каждый в фиолетовый окрашивания). (F, F') Характер экспрессии clcnk, пан-дистальной (DE-DL) маркер, был обнаружен в тонких канальцев, содержащих точки ветвления (черный наконечник стрелы). (G, G ') Для сравнения, желать slc12a1 отмечает DE, без точек ветвления, обнаруженных и (HH' ") slc12a3 отмечает DL, сегмент характеризуется многочисленными точками ветвления по всему почек органа (черные стрелки). (Я) Двухместный WISH для маркера РСТ slc20a1a (красный) и пан-дистальной clcnk (фиолетовый). Сегменты, помеченные этих маркеров не перекрываются, и довольно их домены экспрессии занимают несмежные позиции, так что отдельные РСТ катушек (внизу справа) не упираются дистальных канальцев, а последняя занимают дискретные местоположения и обладают отличительным точки ветвления (черный стрелку ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы описали методы, которые позволяют визуализировать компонентов сегмента нефрона в взрослых данио. Инъекция люминесцентных декстрана конъюгатов позволяет преимущественное маркировку РСТ должное эндоцитотического свойств этих клетках проксимальных канальцев ^30,38. Этот метод может быть выполнена с большой гибкостью в связи с существованием декстраны, которые могут быть получены с собранием различных флуоресцентных конъюгатов. Кроме того, использование лизина-декстраны фиксации является особенно удобным способом для обозначения сегментов РСТ, как вторичные процедуры маркировки не требуется. Это позволяет достаточно простой обнаружение сигнала и совместим со многими другими флуоресцентных меток, иммунноокрашивания и использования трансгенных репортеров линий. Щелочная маркировка фосфатазы также отмечает проксимальных канальцах, с сильным реактивности в РСТ и несколько слабее реактивности в PST. Наконец, окрашивание DBA позволяет маркировку дистальных отделах канальцев, которые отображают СНaracteristic разветвленной морфологию. Различные молекулы лектина, которые сахара-связывающие белки из неиммунной происхождения, широко используются, чтобы отличить нефрона млекопитающих сегментов ^47. Интересно, что DBA в данио коррелирует с дистальных отделах канальцев, как она используется, чтобы отметить собирательных трубочек в почках млекопитающих ^47.

Взятые вместе, эти методы могут быть использованы в различных комбинациях, чтобы документировать почечной состав и функцию. Поскольку все эти методы могут быть использованы в целых препаратов в почках, они обеспечивают инструменты для оценки структуры нефрона и функции на всей территории органа без полностью полагаться на использование более трудоемкий, утомительных методов, например, cryosection работы и иммунноокрашивания. Тем не менее, пятна, описанные в этой статье методы являются жизнеспособными в cryosection. Анализ Cryosection генерирует образцы (по сравнению с целой горе), которые лучше подходят для иммуногистохимии для определения специфических peptiде, хотя, конечно, этот тип анализа требует наличия соответствующих первичных антител. К сожалению, одна из основных ограничений в работе с данио животной модели остается бедным наличие антител. Таким образом WISH остается наиболее широко используется, т.е., "идти к" Процедура анализа экспрессии генов. ЖЕЛАЕМ помощью реакции субстрата BCIP, НБТ, и / или INT производить пурпурный или красный осадок не совместим с флуоресцентной окраски на криосрезов. Одним из вариантов было бы ссылаться на использование флуоресцентной детекции WISH, процедуры, который был оптимизирован для рыбок данио эмбриональных образцов и может быть адаптирована для использования с взрослого почки. Описание методов в этом видео статьи должны позволить для дальнейшего экспериментирования с методами, как флуоресцентного WISH в сочетании с трансгенных данио строк, в которых отдельные сегменты помечены с репортером например, EGFP или mCherry. С другой стороны, способы, описанные здесь, КоулаD испытываться в сочетании с другими жизненно важными красителей, например, других лектинов. Таким образом, дальнейшая адаптация и расширение методов, описанных здесь можно ссылаться в соответствии с потребностями исследователя для целых препаратов и анализа почек монтирования.

Как таковые, эти методы имеют широкий потенциал для реализации с данио модели для текущих исследований регенерации, а также в моделировании генетического заболевания. Существует настоятельная потребность в инновационных исследований и методов лечения почечных недугов. Миллионы людей страдают от той или иной форме заболевания почек каждый год, что является результатом врожденных, острых и / или хронических причин. Кроме того, распространенность заболевания почек продолжает расти во всем мире, что делает эти заболевания глобальная проблема общественного здравоохранения ^14,15. Процедуры, такие как гемодиализ доступны посредством внешнего диализа служит избавить кровь пациента метаболического отходов, если их почки не в состоянии выполнить эту роль. К сожалению, Это вмешательство имеет ограничения, как текущее лечение необходимо для выживания. Кроме того, пациенты в конечном итоге потребует пересадки почки, что может занять годы, чтобы получить один раз пациент помещается на листе ожидания. Даже после получения трансплантата почки, многие пациенты страдают неблагоприятных последствий в результате процедуры и должны бороться эти эффекты для остальной части их жизни. Эти трудности продемонстрировать серьезный необходимость разработки новых методов лечения либо помочь предотвратить болезни почек или, возможно, увеличить регенерацию тканей ^8,16,52,53. Учитывая очевидные этические ограничения использования испытуемых человека в биомедицинских лабораториях, животные модели имеют важное значение для изучения патогенеза заболеваний человека и для тестирования новых методов лечения. В результате его анатомического сходства и эволюционной близости, мышь стала самой широко используемой моделью человеческого заболевания ^45. Тем не менее, есть определенные ограничения с этим животным, ВКЛЮЧАЕТчисле неспособность визуализировать развитие органов в живом организме и практичности завершения масштабных генетических экраны. Данио рерио являются актуальными и полезными модельным организмом для изучения развития органов и моделирования болезней человека ^45,46. В отношении болезней человека, функциональные гомологи у рыбок данио существует почти 70% всех генов человека ^54,55.

Недавняя работа подчеркнули полезность данио для многих областей научных исследований почек ^31,37,56. Исследования регенерации и ремонта у рыбок данио после AKI предположить, что регенерация трубочка эпителиальных и neonephrogenesis два процесса, которые происходят и перекрываются по всей регенерации timecourse ^30,37. Использование аминогликозидный антибиотиков под названием гентамицин была использована в качестве травмы парадигмы, через которую можно изучать результаты AKI во взрослой данио ^29,30,37. Над примерно двухнедельного периода после получения травмы от гентамицин, ближний TUBULэс регенерировать, а тем временем новые нефронов образуют по всей органа ^29,30,37. В целом механизмы, которые регулируют регенерации эпителия остаются весьма спорным. В одном предлагаемом механизме процесса ремонта, есть исходное событие острое повреждение с последующим отторжением мертвых клеток в просвет. Далее, существует ряд де-дифференциации, пролиферации и миграции событий, после чего новые клетки дифференцироваться, репопулирующих травмированного базальную мембрану и восстановления функции потерпевшей сайте. Кроме того, другие исследования показали, что запасные клетки возникают из стволовых клеток / клеток-предшественников, которые находятся в пределах нефрона канальцев. Что касается процесса neonephrogenesis у рыбок данио, сотовые заполнители наблюдались следующий AKI на гентамицин инъекции ^29,30. Эти агрегаты позже созревают в новых нефронов, что отвес в уже существующие канальцев ^29,30. Общая нить, которая объединяет нефроне регенерацию эпителия и neonephrogenesis является их явная фактором тайна: в настоящее время существует экспоненциально больше вопросов о том, как эти регенеративные подвиги происходят, чем есть в наличии идеи.

На сегодняшний день, однако, несколько захватывающих линий доказательств поддерживают идею о том, что исследования почек регенерации с помощью данио может действительно обеспечить соответствующие сравнительные понимание человеческой AKI, что может также иметь прямое поступательное потенциальную ^56-58. Химический анализ, чтобы определить малые молекулы, которые увеличивают пролиферацию почечных клеток-предшественников в эмбрионов рыбок данио недавно привело к идентификации деацетилаза ингибитор гистонов метил-4-(фенилтио) бутаноата (m4PTB) ^56,57. Введение этого соединения к данио личинки с гентамицином-индуцированной ОПН показало, что выживаемость личинок увеличивается, и почечных канальцев, которые пролиферации была увеличена ^56,58. Когда мыши с умеренной ишемией AKI лечили m4PTB, их восстановление было ускорено в доцтельная со снижением как трубчатой ​​атрофии и клеточного цикла ареста пролиферирующих клетках почечных канальцев ^58. Эти данные позволяют предположить, что проводники, отвечающие за нормальное данио почечной развития и / или регенеративного ответ на AKI будет сохраняться с млекопитающих ^56.

Таким образом, в то время как необходимы дальнейшие исследования, чтобы дразнить друг от друга механизмы регенерации, а именно определить сигнальные пути, которые участвуют и понять их взаимодействия-данио предоставляет Одним из перспективных путей для достижения этой важной цели в области нефрологии. Такие инструменты, как нефрона клеточных меток, описанных в этом протоколе представляют одну группу анализов, которые могут быть использованы для оценки почечной состав и функциональность в модели Аки. Кроме того, они могут быть применены для характеристики трансгенных моделей заболеваний почек, и может обеспечить способы идентификации химических терапевтических средств, способных способствуя восстановлению структуры нефрона почек после плотинывозраст.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Pbs			Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.
1X Pbst			0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.
1X Pbs with 0.05 % Tween			0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X Pbs			Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Fine Forceps	Roboz	RS-1050	Dumont Tweezers Pattern #55
Glass Slide	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Glass Coverslip	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Modeling Clay	Hasbro	Playdoh	Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide Holder	Thermo-Fisher	12-587	Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution			Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 mL with distilled water
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009
Blocking solution			Blocking Solution (for a 10 mL solution): 8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 2 mL of fetal calf serum 150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection	Invitrogen	E6601	We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions.
Alkaline phosphatase wash solution			Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 5 mL of 0.5M EDTA 120 mg of Levamisole 95 mL of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW	Invitrogen	D1844	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW	Invitrogen	D1976	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW	Invitrogen	D1825	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW	Invitrogen	D1817	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine	Vector laboratories	RL-10-32	DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS
Propidium iodide	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield Hard Set Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Micro cover glass	VWR	48393081
Dimethyl Sulfoxide, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Sucrose	Sigma	S0289
EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502
Levamisole	Sigma	L-9756
Tissue Freezing Medium	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380 Adhesive Microscope Slides	Tru Scientific	0380W
Liquid Blocker – Super PAP Pen	Electron Microscopy Sciences	71312
Immuno stain moisture chamber	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Cryostat	Therm	Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC	Filter set used was as follows:  Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.
Compound microscope	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.