قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Summary

يمكن قياس الاسموزي معامل نفاذية المياه (P _و) من خلايا تساعد على فهم الآليات التنظيمية من aquaporins (AQPs). P _و في تقرير كروية protoplasts الخلية النباتية المعروضة هنا ينطوي protoplasts العزلة والتحليل العددي من معدل الأولي للحجم التغيير نتيجة تحديا الاسموزي أثناء مستمر نضح حمام.

Abstract

دراسة آليات التنظيم AQP أمر حاسم لفهم العلاقات المائية في كل من الخلوية والمستويات مصنع كامل. المقدمة هنا هو طريقة بسيطة وفعالة جدا لتحديد ناضح معامل نفاذية المياه (P _و) في protoplasts النبات، المعمول بها في المبدأ أيضا على خلايا كروية أخرى مثل الضفدع البويضات. الخطوة الأولى للمقايسة هي عزل protoplasts من الأنسجة النباتية من الاهتمام من قبل الهضم الأنزيمي في غرفة مع محلول متساوي التوتر المناسب. تتكون الخطوة الثانية من التحدي فحص الاسموزي: وتقدم protoplasts ثبتوا على الجزء السفلي من الغرفة إلى نضح انطلاق مستمر مع حل متساوي التوتر ويليه حل منخفض التوتر. تورم الخلية الفيديو المسجلة. في الخطوة الثالثة، تتم معالجة الصور حاليا أن تسفر التغييرات في الحجم، ويرتبط على مدار الساعة من التغييرات في الحجم مع مسار الوقت للتغيير في osmolaاألمن للغرفة نضح المتوسطة، وذلك باستخدام منحنى الإجراء المناسب مكتوبة في Matlab (في 'PfFit ")، لانتاج P _و.

Introduction

امتصاص المياه وتدفقها عبر الأغشية الخلوية هو الشرط الأساسي لوجود محطة في كل من الخلوية والمستويات مصنع كامل. على المستوى الخلوي، aquaporins (AQPs) تلعب دورا رئيسيا في تنظيم الاسموزي معامل نفاذية المياه (P _و) من غشاء الخلية ^1-3.

حتى الآن، وقد استخدمت عدة طرق في قياس P _و الذاتية البروتوبلازم من الأعضاء النباتية المختلفة (أي الجذور، وورقة، البشرة الداخلية وغيرها، التي استعرضتها تشاومونت وآخرون. ^4). إحدى الطرق لقياس P _و هو لفضح protoplasts إلى التحدي ناضح ورصد معدل الأولي للتغيير حجمه (أي.، المنحدر من المرحلة الخطية الأولى للتغيير الحجم). وصفت طريقتين مختلفتين في السابق على أساس هذا النهج، سواء على أساس تبادل لحظية من الحلول. يتكون أول واحد من immobilizجي في البروتوبلازم مع micropipette شفط والتبديل تدفق الحل ⁵ والثاني واحد من نقل البروتوبلازم من حل واحد إلى آخر باستخدام micropipette ^6. هذه شفط micropipette وmicropipette طرق نقل، والتي تتيح الحصول على الصور في بداية جدا من تبادل حل سريع (لالتقاط المرحلة الخطية الأولى من تغيير الحجم)، من المرجح أن تنطوي على الاجهاد البدني لprotoplasts وتتطلب معدات متخصصة وخبراء المجهرية.

الطريقة الموصوفة هنا يقلل من اضطراب في الخلايا، لا ينطوي على أي المجهرية ويسمح اشتقاق P _و عندما نضح حمام ليست لحظية.

بعد الهضم الأنزيمي، وprotoplasts، مغمورة في محلول متساوي التوتر، وثبتوا على الجزء السفلي من الزجاج ساترة من زجاج شبكي (الملقب سيت أو المقوى) غرفة من تهمة التفاعل. ثم، خلال نضح حمام مستمر،يتم مسح حل متساوي التوتر بعيدا عن حل منخفض التوتر توليد تحديا hypoosmotic إلى protoplasts. تورم في البروتوبلازم هو الفيديو المسجل وبعد ذلك، من خلال الجمع بين المعلومات حول مدار الساعة من نضح حمام وبالطبع الوقت من تورم الخلية، ويتم تحديد بواسطة P _و معالجة الصور والإجراءات المناسب منحنى.

مزايا هذه الطريقة هي أن التجربة هي فعالة جدا، أي أنه من الممكن لمراقبة بضع خلايا في وقت واحد في فحص واحد، وأنه لا يحتاج إلى معدات خاصة أو مهارات معينة المجهرية. العديد من التطبيقات لهذه الطريقة ممكنة. على سبيل المثال، تحديد P _و الأم من مجموعة متنوعة من الخلايا من الأنسجة والنباتات المختلفة، مثل ورقة وخلايا غمد حزمة من أوراق نبات الأرابيدوبسيس ⁷ والذرة ورقة ورقة أو خلايا قشرة الجذر ^8-10 أو تعليق الخلايا المستزرعة ^11،12. كما تعهدعلى ذلك، فمن الممكن لتحديد P _و من الخلايا الحيوانية كروية مثل خلايا البويضة ^11. مثال آخر ينطوي فحص النشاط AQP بواسطة التعبير عابرة من الجينات الخاصة بهم في protoplasts (أو أي جينات أخرى والتي قد تؤثر عليهم، مثل تحركات جينات) وتحديد مساهمتها في P _و. على سبيل المثال، التعبير عن الطماطم AQP SlTIP2، 2 في protoplasts ورقة نبات الأرابيدوبسيس بواسطة PEG التحول وعزم SlTIP2؛ P 2 ذات الصلة _و ^13. أخيرا، فحص تأثير على P _و من جزيئات مختلفة / المواد (الأدوية والهرمونات وغيرها) إضافة إلى حلول يمكن أيضا أن تدرس، على سبيل المثال من مانع AQP HgCl ₂ ^7.

يصف البروتوكول بعد عزل protoplasts خلايا نبات الأرابيدوبسيس ورقة وعزم على P _و.

Protocol

1. إعداد حلول

1. إعداد متساوي التوتر (600 الميلي أسمول) وناقص التوتر (500 الميلي أسمول) الحلول التي تحتوي على 10 ملي بوكل، 1 مم CaCl _2، و 8 M 2- (N-المورفالين) حمض -ethanesulphonic (MES)، ودرجة الحموضة 5.7 وضبط الأسمولية مع كميات مناسبة من D-السوربيتول: 540 مم للمتساوي التوتر و 440 ملي من أجل حل منخفض التوتر. التحقق من الأسمولية من الحل (خلال 3٪ من القيمة المستهدفة) باستخدام مقياس التناضح.
2. إعداد الأسهم الجاف "مزيج الأنزيمية" التي تحتوي على الانزيمات التالية: 0.55 ز سلولاز، 0.1 غرام pectolyase، 0.33 غرام بوفيدون K 30، 0.33 ز BSA (انظر الجدول 1 أدناه)، خلط مسحوق جاف من دوامة، وجعل مأخوذة 5.7 ملغ و تخزين في -20 درجة مئوية.

2. عزل ورقة نبات الأرابيدوبسيس Protoplasts

1. إعداد طبق بتري (10 سم) مع حوالي 6 قطرات (حوالي 30 ميكرولتر لكل منهما) من محلول متساوي التوتر.
2. قشر مجافي المحور البشرة (أقل) ورقة نبات الأرابيدوبسيس، جحزب التحرير ورقة مقشر إلى مربعات حوالي 4 × 4 مم ^2، ثم وضع المربعات على محلول متساوي التوتر يسقط مع الجانب مجافي المحور تتعرض باستمرار، لمس الحل.
3. حل 5.7 ملغ من مزيج الانزيم في 165 ميكرولتر حل متساوي التوتر (3.3٪ ث / ث) في أنبوب 1.5 مل، مزيج بلطف pipetting لمدة دقيقة أو نحو ذلك حتى يذوب، ووضع عدة قطرات مماثلة من الحل الأنزيمية في نفس بيتري الطبق.
4. نقل القطع على ورقة الحل الأنزيمية قطرات، أغلق طبق ختم الغطاء مع جولة واحدة من parafilm واحتضان لمدة 20 دقيقة، وتطفو الطبق في حمام مائي تعيين إلى 28 درجة مئوية.
5. إضافة عدة قطرات أكثر من الحل متساوي التوتر إلى الطبق (2 قطرات في كل قطرة محلول أنزيم). نقل كل قطعة ورقة إلى انخفاض حل متساوي التوتر الجديد، ثم، بالتتابع، إلى انخفاض الثاني (لغسل الحل بعيدا الأنزيمي). رفع قطعة من حافته باستخدام ملقط، والتخلص منه في الهبوط الثاني (مثل كيس الشاي) للافراج عن protoplasts.جمع قطرات مع protoplasts (باستخدام قص من 100 ميكرولتر ماصة تلميح) في أنبوب 1.5 مل.

3. ناقص التوتر التحدي الفحص: ورقة نبات الأرابيدوبسيس تورم الخلية

1. إعداد نظام نضح (الشكل 1A) عن طريق ملء عمود واحد مع حل متساوي التوتر وعمود آخر مع محلول ناقص التوتر. فتح صمام، السماح لبعض تدفق الحل (أولا منخفض التوتر، ثم متساوي التوتر) لملء الأنابيب على طول الطريق وصولا الى مدخل متعددة (الشكل 1B). ضمان عدم وجود فقاعات الهواء المحتبسة، ثم يغلق الصمام.
2. ختم ساترة، وذلك باستخدام سيليكون الشحوم (الجدول 1)، لجعل القاع للغرفة داخل الشريحة شبكي (الشكل 1B، وانظر أيضا الخطط للغرفة في الشكل 1C). لجعل أسفل الغرفة (والتصاعدي التي تواجه السطح المعرض من ساترة داخل حلقة الشحوم) "لزجة" لprotoplasts، ومعطف عليهمع الإيجابي المسؤول الحاملة بروتامين سلفات (1٪ في الماء؛ الجدول 1) أو بولي-L-يسين (0.1٪ في الماء؛ الجدول 1). نشر هذا 'الغراء' على ساترة باستخدام طرف ماصة، انتظر 1 - 2 دقيقة، شطف 3-4 مرات مع محلول متساوي التوتر ويهز بعيدا الحل المتبقية.
3. ملء تصل الغرفة مع محلول متساوي التوتر. ثم، تضاف قطرة من protoplasts تحتوي على حل للغرفة، وذلك باستخدام قص قبالة الطرف ماصة والانتظار 3-4 دقائق لprotoplasts ليستقر. تغطية غرفة مع غطاء شفاف (أرقام 1D، 1E) لمس السطح الحل (تجنب احتباس فقاعات الهواء تحت).
4. ضع الشريحة (بلطف!) على طاولة مجهر مقلوب، لأنه ربط نظام نضح ومضخة (حراسة ضد فقاعات الهواء في أنابيب!) وبدوره على تدفق محلول متساوي التوتر لنضح المستمر في 1 مل / دقيقة (معدلات أسرع يمكن استخدامها، تصل إلى 4 مل / دقيقة).
5. للتسجيلالتغييرات في الحجم، يتم استخدام مجهر مقلوب، مع الهدف 20X ومع كاميرا CCD الفيديو وصله بجهاز الكمبيوتر PC. استخدام 'جامعة كارنيجي ميلون 1394 كاميرا سائق' البرنامج المساعد لبرنامج ImageJ (انظر الجدول مواد محددة لعناوين حمل هذه القطع البرمجيات اثنين) لتسجيل فيلم فيديو 60 ثانية من protoplasts متحركة مختارة (يفترض، تلك عالقا إلى أسفل) بمعدل 1 صورة / ثانية (1 هرتز). بدء تسجيل مع غسل 15 ثانية من الحل متساوي التوتر (هذا يشكل خط الأساس)، والتحول إلى الحل ناقص التوتر لمدة 45 ثانية (لإكمال مجموع 60 ثانية من بداية نضح). حفظ الفيلم في صيغة TIF. ملاحظة: اختيار حقل الرأي مع العديد من الخلايا ممكن، الوفاء بالمعايير التالية: كروية في الشكل ومع كفاف خلية ركز جيدا في هم أكبر محيط (الشكل 2A).

4. تحليل تغيير حجم الخلية باستخدام يماغيج

ملاحظة: لتحليلسلسلة من الصور من خلية الورم، استخدم 'صورة إكسبلورر' والإضافات 'البروتوبلازم محلل "في برنامج ImageJ (كتبه خافيير Draye) ^14. بدءا من protoplasts المختار في أول نقطة وقتهم، أن 'البروتوبلازم محلل' البرنامج المساعد تلقائيا كشف حواف protoplasts (ملامح) وحساب مدار الساعة من مناطقهم خلال التجربة (هي الإضافات المتاحة مع برنامج تحليل PfFit أدناه) .

1. بدء يماغيج. لفتح الفيلم، انقر فوق "ملف" على لوحة يماغيج، ثم على التوالى على القوائم المنسدلة لأنها تتكشف: 'استيراد' ثم 'مستكشف صورة ". تسليط الضوء على فيلم المختار، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على ذلك، ثم اليسار انقر على 'محلل البروتوبلازم. تصفح من خلال فيلم (باستخدام شريط التمرير في البروتوبلازم الصورة أسفل) لتحديد protoplasts التي لا تزال إلى حد كبير غير متحرك أثناء التجربة - سيتم تحليل هذه. مرة أخرى على أول معهد العالم العربيجنرال الكتريك، وذلك باستخدام الماوس، رسم الدوائر (اختار من أدوات الرسم يماغيج) حول protoplasts مختارة (الشكل 2B)، ثم انقر فوق "موافق" في جدول "المعلمات الكشف" التي ظهرت.
2. لإطلاق خوارزمية الكشف البروتوبلازم، انقر فوق "المحلية" على الصورة البروتوبلازم أعلى لوحة، ثم "عملية" في القائمة المنسدلة. دراسة دوائر خضراء حول protoplasts مختارة (الشكل 2C) طوال الفيلم. حفظ "النتيجة" في ملف Excel. استقال يماغيج. ملاحظة: في حالة ظهور نقطة حمراء (للإشارة إلى كفاف نوبة سيئة - عادة بسبب ضعف تباين الصورة)، إعادة تشغيل مع معلمات مختلفة.
3. لفصل خطوط تنتمي إلى كل خلية (التي - إذا تم تحليل اثنين أو أكثر من الخلايا في وقت واحد - سيتم متشابكة، ليتم تحليل الإطار من جانب الإطار)، في Excel، فرز البيانات المحفوظة حسب العمود عدد الخلايا ('الكائن' ).
4. لDETErmine عامل التحويل بكسل إلى ميكرومتر للحصول على القيمة الحقيقية للP _و، والمفاجئة صورة لحاكم ميكرومتر عبر نفس الهدف 20X المجهر. اسحب خط (اختار من أدوات الرسم يماغيج) على طول صورة الحاكم وقراءة ما يعادل عدد بكسل لطول المسطرة في الجزء السفلي من لوحة رئيسية يماغيج. تحويل القيم منطقة بكسل التعسفية في ملف Excel إلى ² ميكرون. حفظ دوام مناطق (لكل خلية على حدة) كملف نصي (عمودين من الأرقام فقط). ملاحظة: وسوف يكون هذا مدخلا إلى برنامج تركيب الصوت "PfFit.

5. نمذجة أسعار الأسمولية تغيير في غرفة التجريبية عن طريق يماغيج _وو صالح برنامج ماتلاب P

1. إضافة 2 ملغ الزيلين cyanol (الجدول 1 أدناه) إلى 100 ​​مل من محلول متساوي التوتر (لإنتاج "المؤشر صبغ ').
2. إعداد نظام الارواء (كما في 3.1) مع صبغ المؤشر وح غير مصبوغحل ypotonic.
3. ختم زلة تغطية باستخدام الشحوم السيليكون إلى الجزء السفلي من الغرفة زجاج شبكي، ثم بلطف ملء الغرفة مع صبغ المؤشر، وتغطية ذلك مع انزلاق الغطاء (كما هو الحال مع protoplasts قبل) ووضعه على المسرح المجهر.
4. ربط الغرفة لنظام نضح ومضخة، وبدوره على تدفق المؤشر صبغ لنضح المستمر في لتر مل / دقيقة.
5. تسجيل فيلم 60 ثانية بمعدل 1 هرتز. بدء تسجيل مع 15 ثانية من صبغ المؤشر، قم بالتبديل إلى حل منخفض التوتر لمدة 45 ثانية. وقف التصوير. مطاردة مع صبغ المؤشر (على الأقل لمدة 30 ثانية)، ثم البدء في فيلم جديد. كرر حوالي 5 - 6 مرات وحفظ جميع الأفلام
6. استخدام البرنامج يماغيج لتحليل صور الفيديو من النفاذية المؤشر صبغ للحصول على دوام المتوسط ​​للتغيير النفاذية.
   1. بدء يماغيج، انقر فوق "ملف"، ثم على 'فتح'، وتصفح للفيلم. عن كل فيلم، رسم 10 بكسل واسعة العموديالمستطيل في أي مكان على ^شارع 1 صورة من الفيلم. انقر فوق "صورة" على لوحة رئيسية يماغيج، ثم انقر فوق "المحاصيل" في القائمة المنسدلة.
   2. لمحاذاة 60 لقطة (الفيلم 60 ثانية) في صف واحد، ثم اضغط ثانية "صورة"، ثم انقر على التوالي في القوائم المنسدلة لأنها تتكشف: "الأكوام" و "جعل المونتاج" (60 الأعمدة، الصفوف 1). رسم مستطيل أفقي 1 بكسل عالية في أي مكان على طول صف كامل من الصور وانقر على 'تحليل' في اللوحة الرئيسية يماغيج، ثم انقر فوق نبذة عن مؤامرة "في القائمة المنسدلة. ملاحظة: A 'مؤامرة من المونتاج "سوف تظهر (لا يظهر) النافذة، وقائمة بيانات النفاذية يمكن فتح من القائمة الخاصة. يتم تمثيل كل صورة من الفيلم في هذه القائمة 10 قيم النفاذية الناشئة في المستطيل واسعة في 10 بكسل، وبالتالي "قاعدة الوقت" (الصورة الرقم المتسلسل) هو 10 مرات أطول.
   3. نسخ من قوائم دات النفاذيةو(قائمة واحدة في الفيلم) في ملف إكسل. متوسط ​​الدورات الوقت النفاذية الحصول عليها من عدة أفلام من الهبات المؤشر صبغ. توليد قاعدة في الوقت الحقيقي بضرب صورة الرقم المتسلسل بنسبة 0.1. حفظ دوام المتوسط ​​(عمودين) إلى ملف نصي. ملاحظة: قبل المتوسط، إذا رغبت، رسم الدورات الفردية الوقت، رفض أي مخالفات. تأكد من أن الفيلم يتضمن على الأقل 5 ثانية النهائي من النفاذية الحالة المستقرة للصبغ المؤشر.
7. بدء تشغيل برنامج ماتلاب المناسب P _و صالح (لوحة "المؤشر صالح"، الشكل 3) لحساب البارامترات المختلفة للدوام الأسمولية. ملاحظة: استنادا إلى تركيزات الأولية والنهائية معروفة من الحل في الحمام، ويتم احتساب مدار الساعة من التركيز الاسموزي تغيير من الحل من دوام تركيز (محسوبة، بدوره، من النفاذية المؤشر صبغ)، على افتراض أنه يتبع نفس ديناميات مثلتركيز الصبغة. P _و صالح هو برنامج متاح للاستخدام مجانا. و"PfFit_Installer_web.exe" يمكن تحميلها من: P _و دليل صالح العضو "مع شرح مفصل والتعاريف يمكن الوصول إليها عبر جوف] كملف إضافي، مما يساعد على تعريف المستخدم مع البرنامج صالح P _و.
8. في لوحة "المؤشر صالح"، استيراد البيانات من الدورة الوقت نفسه من النفاذية المؤشر صبغ ('ملف البيانات المؤشر، الشكل 3A) وتضاف يدويا المعلمات التجربة الحالية والتخمينات الأولية من "العرض" المعلمات و" t_half "واصفا مدار الساعة من تركيز المؤشر صبغ (الشكل 3B. انقر 'تشغيل' لعرض قطع من الدورات الوقت للتركيز المؤشر صبغ (بيانات حقيقية وتناسب، الشكل 4A)، وعلى غرار (محسوبة) حمام الأسمولية (الشكل 4B) ملاحظة: AGالعود يصلح للبيانات ضروري (توصية: بدء مع القيم هو مبين في الشكل 3).

6. تحديد _و P باستخدام برنامج ماتلاب تركيب P _و صالح

ملاحظة: بالإضافة إلى الافتراضات الأساسية فيما يتعلق سلوك البروتوبلازم بمثابة مقياس التناضح الحقيقي والمثالي ^11، وتحديد P _و يعتمد على افتراض أن P _و قد تتغير مع مرور الوقت، أن هذا ديناميات P _و ترتكز الوقت مسار تغيير حجم الخلية وأن المعلمات الثلاث يكفي لوصف ذلك: P _فاي (القيمة الأولية P _و)، المنحدر _{الجبهة الوطنية} (معدل التغير الخطي للP _و) وتأخير (في الفترة من بداية حمام تغيير الأسمولية حتى بداية تغيير حجم الخلية). يمكن اختبار نماذج مختلفة، بما في ذلك مجموعات مختلفة من هذه الثوابت والقيم، بما في ذلك القيم الخالية ^(11). P و صالح بالبحث عن أفضل مزيج من هذه المعلمات تسفر - عن طريق حساب - استنساخ معظم المؤمنين من الدورة الوقت التجريبي للتغيير حجم الخلية ^11، وتحسب، بدوره، من سلسلة المستوردة من المناطق خلية كفاف (انظر أيضا التكميلي "P _و دليل صالح العضو ').

1. التبديل إلى "حجم صالح" لوحة (الشكل 5). اختيار لاستيراد ملف بيانات المناطق (ملف نصي مع مدار الساعة من "المناطق" من protoplasts تحليلها، الشكل 5A). اختر 'مؤشر نشاط تركيب "كمصدر المعلمة (الشكل 5B، انظر" P _و دليل صالح العضو' عن بدائل). ملاحظة: هذه المعلمات (الشكل 5D) تستخدم بعد ذلك لتجديد التغيير osmoticum في الحمام لأحجام المناسب الإجراء.
2. في لوحة "حجم صالح" (الشكل 5C)، تهيئة (ملء التخمينات الأولية ل) ف _و المعلمات: P _و، المنحدر _{الجبهة الوطنية} وتأخير (توصية: يبدأ 1، 1، و 30، على التوالي)، اختارت نموذج 'الفئة' (توصية: يبدأ الثاني وعلامة 'الشيكات' لجميع المعلمات الثلاث لتركيبها). انقر 'تشغيل'، ثم مقلة العين الرقم المؤقت (الشكل 5E) وضبط المعلمة تأخير وطول السجل، إذا لزم الأمر.
3. دراسة الرسم البياني النتائج (الشكل 6) لتقييم جودة مناسبة وتسجيل الخطأ مناسبا. تغيير المعلمات تهيئة بضعة أضعاف لكل منهما، وإعادة'Run. ملاحظة: لا تثبط عند البرنامج يحصل عالقا - مجرد إعادة تشغيل البرنامج!
4. تكرار هذا الإجراء عدة مرات، بدءا من مجموعات مختلفة من معلمات التهيئة، وتهدف لأدنى قيمة الخطأ مناسبا.
5. نسخ قائمة بنتائج تناسب مباشرة من الشاشة، أو العثور عليها في رانه PfFit المولدة الملف '_FIT_Vol_Results.txt.

النتائج

من أجل تحديد P _و ومقارنة نشاط AQPs مختلفة، وتستخدم protoplasts ورقة من أوراق نبات الأرابيدوبسيس. تم العثور على هذه protoplasts لديك منخفضة القاعدية (الخلفية) مستويات P _و ⁷ ويمكن أن تكون بمثابة نظام وظيفي في التعبير لتمكين قياسات P _و استنساخه.

Discussion

الموصوفة هنا هو إجراء بسيط وفعال جدا لقياس _و P من protoplasts النباتية المعزولة، المعمول بها في المبدأ أيضا على خلايا كروية أخرى، على سبيل المثال، البويضات الضفدع ^11. وتستند هذه الطريقة على قياس P _و ردا على التحدي الاسموزي إلى الخلية. على النقيض من الط?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK