Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Resumo

Medir o coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P _f) de células pode ajudar a compreender os mecanismos de regulação de aquaporinas (AQPs). P _f determinação em protoplastos de células de plantas esféricas aqui apresentados protoplastos envolve o isolamento e análise numérica da sua velocidade inicial da alteração de volume, como um resultado de um desafio osmótica constante durante a perfusão de banho.

Resumo

Estudar mecanismos de regulação AQP é crucial para a compreensão das relações de água, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Apresentada aqui é um método simples e muito eficiente para a determinação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P _f) em protoplastos de plantas, em princípio aplicável também a outras células, tais como esféricas oócitos de rã. A primeira etapa do ensaio é o isolamento de protoplastos a partir do tecido de planta de interesse por digestão enzimática para uma câmara com uma solução isotónica adequada. A segunda etapa consiste em um ensaio de desafio osmótica: protoplastos imobilizados no fundo da câmara é submetido a uma perfusão constante de partida com uma solução isotónica e seguido de uma solução hipotónica. O inchaço da célula é de vídeo gravado. Na terceira etapa, as imagens são processadas desligada para proporcionar mudanças de volume, e o curso de tempo das alterações de volume está correlacionada com a evolução no tempo da mudança de osmolarança do meio de perfusão da câmara, usando um procedimento de ajuste de curva escrito em Matlab (a 'PfFit'), para se obter P _f.

Introdução

A absorção de água eo fluxo através das membranas celulares é um requisito fundamental para a existência de plantas, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Ao nível celular, aquaporinas (AQPs) desempenham um papel fundamental na regulação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P _f) da membrana celular ^1-3.

Até à data, vários métodos têm sido utilizados para medir a endógena P _f de protoplastos de diferentes órgãos da planta (ou seja, raízes, mesofilo, endoderme, etc., Revisado por Chaumont et al. ^4). Uma das abordagens para medir P _f é expor os protoplastos a um desafio osmótica e para controlar a velocidade inicial da sua alteração de volume (isto é., O declive da fase linear inicial da alteração de volume). Dois métodos diferentes foram previamente descritos com base nesta abordagem, tanto com base em uma troca instantânea de soluções. O primeiro consiste em immobilizing o protoplasto com uma micropipeta de sucção e interrupção do fluxo de solução a ⁵ e a segunda transferência de protoplasto de uma solução para outro, utilizando uma micropipeta ^6. Estes métodos transferência de sucção micropipeta e micropipeta, que permitem a aquisição de imagens logo no início da troca rápida solução (para capturar a fase linear precoce de alteração de volume), provavelmente envolverá um esforço físico para protoplastos e requerem equipamentos especializados e micromanipulação especialista.

O método aqui descrito minimiza a perturbação das células, e não envolve a micromanipulação permite derivação de P _f quando o banho de perfusão não é instantânea.

Após a digestão enzimática, os protoplastos, submersas numa solução isotónica, são imobilizados no fundo lamela de vidro de Plexiglass (aka Lucite ou perspex) por câmara de interacção de cargas. Em seguida, durante um banho de perfusão constante,a solução isotônica é nivelado afastado por uma solução hipotônica gerando um desafio hipoosmótico aos protoplastos. O inchamento do protoplasto é vídeo gravado e, em seguida, através da combinação da informação sobre a evolução no tempo do banho de perfusão e o curso de tempo da expansão celular, a P _f é determinada por procedimentos de processamento de imagem e de ajuste de curva.

As vantagens deste método é que a experiência é muito eficiente, ou seja, é possível acompanhar algumas células simultaneamente em um único ensaio, e que não requer equipamento especial ou habilidades específicas de micromanipulação. Várias aplicações para este método são possíveis. Por exemplo, a determinação da P _f nativo de uma variedade de células de diferentes tecidos e plantas, tais como mesófilo e agrupar as células da bainha de folhas de Arabidopsis ^7, milho mesofilo ou células do córtex da raiz ^{de 8-10} ou de suspensão de células cultivadas ^11,12. Em additina, é possível determinar P _f de células de animais, tais como células esféricas ¹¹ oócitos. Outro exemplo envolve a análise da actividade AQP pela expressão transitória de seu gene nos protoplastos (ou quaisquer outros genes que possam afetá-los, por exemplo, genes de quinases) e determinação de sua contribuição para a P _f; por exemplo, a expressão de tomate AQP SlTIP2; 2 em Arabidopsis mesofilo protoplastos por transformação PEG e determinação do SlTIP2; 2 relacionada com a P _f ^13. Finalmente, o exame do efeito sobre o _f P de diferentes substâncias (moléculas / medicamentos, hormonas, etc) adicionado às soluções podem também ser examinadas, por exemplo, o bloqueador de AQP HgCl ₂ ^7.

O protocolo seguinte descreve o isolamento de protoplastos de células e determinação da sua P _f Arabidopsis mesófilo.

Protocolo

1 Preparação das Soluções

1. Prepare isotónica (600 mOsm) e hipotónico (500 mOsm) soluções contendo 10 mM de KCl, 1 mM de _CaCl2, e 8 H 2 (N-morfolino) Ácido -etanossulfónico (MES), pH 5,7 e ajustar a osmolaridade com as quantidades apropriadas de D-sorbitol: 540 mm para o isotônico e 440 mm para a solução hipotônica. Verificar a osmolaridade da solução (dentro de 3% do valor alvo), utilizando um osmómetro.
2. Prepara-se uma pasta seca de 'mistura enzimática "contendo as enzimas seguintes: 0,55 g de celulase, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polivinilpirrolidona K 30, 0,33 g de BSA (ver Tabela 1 abaixo), a mistura de pó seco por vórtice, fazer alíquotas de 5,7 mg e armazenar a -20 ° C.

2 Isolamento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo

1. Prepara-se uma placa de Petri (10 cm) com cerca de 6 gotas (aproximadamente. 30 ul cada) de solução isotónica.
2. Descasque as abaxial epiderme (inferior) de folhas de Arabidopsis, cut a folha desenrolada em quadrados de cerca de 4 x 4 mm ^2, em seguida, coloque os quadrados sobre a solução isotônica cai com o lado abaxial exposta para baixo, tocando a solução.
3. Dissolve-se 5,7 mg da mistura de enzima em 165 ul solução isotónica (3,3% w / w) em um tubo de 1,5 mL, misturar suavemente por pipetagem de um minuto ou então até se dissolver, e colocar várias gotas semelhantes da solução enzimática na mesma Petri prato.
4. Transferir os pedaços de folhas para a solução enzimática gotas, fechar o prato de vedação com a tampa rodada de um parafilme e incubar durante 20 min, o prato flutuante em um banho de água regulado para 28 ° C.
5. Adicionar algumas gotas de mais a solução isotónica com o prato (2 gotas por cada gota solução de enzima). Transferir cada pedaço de folha de uma nova gota solução isotónica e, em seguida, sequencialmente, a um segundo ponto (para lavar a solução enzimática de distância). Levante a peça pelas bordas usando uma pinça, agite-o na segunda queda (como um saquinho de chá) para liberar os protoplastos.Recolher as gotas com os protoplastos (usando uma pipeta de ponta de 100 ul cortado) para um tubo de 1,5 ml.

3. O hipotônico Desafio Ensaio: Inchaço celular Arabidopsis mesofilo

1. Prepare o sistema de perfusão (Figura 1A), enchendo uma coluna com a solução isotónica e outra coluna com a solução hipotónica. Abra a válvula, deixe algum fluxo de solução (primeiro a hipotônica, em seguida, o isotônico) para encher o tubo todo o caminho para o colector de admissão (Figura 1B). Verifique se não há bolhas de ar, e em seguida, fechar a válvula.
2. Selar uma lamela, utilizando massa de silicone (Tabela 1), para fazer uma parte inferior para a câmara no interior da corrediça de plexiglass (Figura 1B, ver também o esquema da câmara na Figura 1C). Para fazer com que a parte inferior da câmara (a superfície voltada para cima da lamela exposto dentro do anel de gordura) "pegajoso" para protoplastos, revesti-la-com carga positiva-rolamento de sulfato de protamina (1% em água; Tabela 1) ou poli-L-lisina (0,1% em água, Tabela 1). Espalhe esta "cola" sobre a lamela utilizando uma ponteira, esperar por 1-2 min, lavar 3-4 vezes com a solução isotônica e sacudir para longe a solução restante.
3. Encher a câmara com a solução isotónica. Em seguida, adicione uma gota de protoplastos contendo solução para a câmara, usando uma ponteira cortado e esperar 3-4 minutos para os protoplastos para resolver. Cubra a câmara com uma tampa transparente (Figuras 1D, 1E) tocar a superfície da solução (evitar bolhas de interceptação abaixo).
4. Coloque o slide (suavemente!) Em uma mesa de microscópio invertido, conectá-lo ao sistema de perfusão ea bomba (proteção contra bolhas de ar na tubulação!) E ligar o fluxo de solução isotônica para perfusão constante de 1 mL / min (taxas mais rápidas pode ser utilizado, até 4 ml / min).
5. Para a gravaçãoas mudanças de volume, um microscópio invertido é usado, com um objectivo de 20X e com uma câmara de vídeo CCD ligada a um computador PC. Use o plugin 'CMU 1394 Camera Driver' do software ImageJ (veja a tabela de materiais específicos para os endereços de download destes dois pedaços de software) para gravar um filme de vídeo de 60 segundos de protoplastos imóveis selecionados (presumivelmente, aqueles que estão presos ao fundo) a uma taxa de uma imagem / segundo (1 Hz). Iniciar a gravação com uma lavagem de 15 seg de a solução isotónica (isto constitui a linha de base), para comutar a uma solução hipotónica para 45 segundos (para completar um total de 60 segundos a partir do início da perfusão). Salve o filme em formato TIF. NOTA: Escolha um campo de visão com o maior número de células possível, cumprindo os seguintes critérios: esféricas e com um contorno de células bem focada em seu maior perímetro (Figura 2A).

4. análise do volume celular mudar usando ImageJ

NOTA: Para analisar asérie de imagens de uma célula inchaço, use o campo 'Imagem Explorer' e 'plugins protoplastos Analyzer' no software ImageJ (escrito por Xavier Draye) ^14. Começando com os protoplastos escolhidos em seu primeiro ponto de tempo, o plug-in 'protoplastos Analyzer' irá detectar automaticamente as bordas protoplastos (contornos) e calcular a evolução temporal de suas áreas durante o experimento (os plugins estão disponíveis com o programa de análise de PfFit, abaixo) .

1. Comece ImageJ. Para abrir o filme, clique em "Arquivo" no painel de ImageJ, então, consecutivamente nos menus suspensos enquanto eles se desenrolam: 'Importar' então 'Imagem Explorer'. Realce o filme escolhido, em seguida, clique com o botão direito sobre ele, então clique em "protoplastos Analyzer '. Percorra o filme (usando um controle deslizante na parte inferior da imagem de protoplastos) para identificar protoplastos que permanecem em grande parte imóveis durante o experimento - estes serão analisados. De volta à primeira image, usando o mouse, desenhe círculos (escolhidos a partir das ferramentas de desenho ImageJ) em torno dos protoplastos selecionados (Figura 2B) e clique em 'OK' na tabela de "Parâmetros de detecção" que apareceram.
2. Para iniciar o algoritmo de detecção de protoplastos, clique em 'Local' na imagem do painel superior protoplastos, em seguida, "processo" no menu suspenso. Examine os círculos verdes em torno das protoplastos selecionados (Figura 2C) durante todo o filme. Salve o 'resultado' em um arquivo do Excel. Saia do ImageJ. NOTA: No caso de um ponto vermelho aparece (para indicar um mau contorno apto - geralmente devido a um pobre contraste da imagem), execute novamente com parâmetros diferentes.
3. Para separar as linhas pertencentes a cada célula (que - se duas ou mais células foram analisadas simultaneamente - serão interligados, porque a análise é feita quadro a quadro), em Excel, classificar os dados salvos pela coluna número de células ('objeto' ).
4. Para Determine o fator de conversão pixel-a-mm para obter o valor real de P _f, tirar uma imagem de uma régua micrométrica via o mesmo objetivo 20X microscópio. Arraste uma linha (escolhidos entre as ferramentas de desenho ImageJ) a imagem régua ao longo e ler o número de pixels equivalente ao comprimento da régua na parte inferior do painel principal do ImageJ. Converta os valores de área de pixel arbitrários no arquivo Excel em mM ^2. Salve o curso áreas hora (para cada célula separadamente) como um arquivo de texto (duas colunas de números únicos). NOTA: Esta será uma entrada para o programa 'PfFit' de ajuste de volume.

5 Modelagem da Taxa de osmolaridade Mudança na Câmara Experimental Usando ImageJ eo _f Fit Matlab Programa P

1. Adicionar 2 mg de xilenocianol (Tabela 1, abaixo) a 100 ml de solução isotónica (para produzir o 'Indicador Dye').
2. Prepare o sistema de perfusão (como em 3.1) com o Indicador Dye eo h não tingidosolução ypotonic.
3. Selar a lamela utilizando graxa de silicone para o fundo da câmara de acrílico, em seguida, preencher com cuidado a câmara com o Indicador Dye, cobri-lo com uma lamela (como acontece com os protoplastos antes) e colocá-lo no palco microscópio.
4. Ligue a câmara para o sistema de perfusão e a bomba, e ligar o corante indicador de fluxo para uma perfusão constante em l ml / min.
5. Gravar um filme de 60 segundos, à taxa de 1 Hz. Inicie a gravação com 15 segundos de Indicador Dye, mudar para a solução hipotônica para 45 seg. Parar de filmar. Lave com o Indicador Dye (pelo menos durante 30 segundos), em seguida, começar um novo filme. Repita cerca de 5-6 vezes e salvar todos os filmes
6. Use o software ImageJ para analisar as imagens de vídeo da transmitância Indicador Dye para obter um curso da mudança transmitância tempo em média.
   1. Comece ImageJ, clique em "Arquivo" e, em seguida, "Open", e navegar para o filme. Para cada filme, desenhar a 10 pixels de largura verticaisretângulo em qualquer lugar na ¹ ª imagem do filme. Clique em 'Imagem' no painel principal do ImageJ, clique em 'Cortar' no menu suspenso.
   2. Para alinhar os 60 quadros (do filme de 60 segundos) em uma linha, clique novamente 'Imagem', em seguida, clique consecutivamente nos menus suspensos enquanto eles se desenrolam: 'Pilhas' e 'Fazer Montagem "(colunas 60, linhas 1). Desenhe um 1 pixel alta retângulo horizontal em qualquer lugar ao longo de toda a linha de imagens e clique em "Analisar" no painel principal do ImageJ, em seguida, clique em "perfil enredo" no menu suspenso. NOTA: A 'Lote de Montagem de' janela aparecerá (não mostrado), e uma lista de dados de transmitância pode ser aberta a partir do seu menu. Cada imagem do filme é representado nesta lista de 10 valores de transmitância originadas na sua 10 pixels de largura retângulo e, conseqüentemente, a "base de tempo" (o número seqüencial de imagem) é 10 vezes mais.
   3. Copie as listas da dat transmitânciaum (uma lista por vídeo) para um arquivo Excel. Calcular a média dos cursos de tempo de transmitância obtidas a partir dos vários filmes dos resplendores Indicador Dye. Gerar uma base de tempo real através da multiplicação do número sequencial de imagem por 0,1. Salve o curso de tempo média (duas colunas) para um arquivo de texto. NOTA: Antes de média, se desejar, traçar os períodos individuais, para rejeitar quaisquer irregularidades. Certifique-se de que o filme inclui, pelo menos, 5 segundos finais de transmitância em estado estacionário do corante indicador.
7. Inicie o programa de encaixe P _f Fit Matlab (painel de 'Indicador Fit ", Figura 3) para calcular os vários parâmetros do curso de tempo da osmolaridade. NOTA: com base nas concentrações iniciais e finais conhecidos da solução no banho, o curso do tempo da concentração osmótica mudança da solução é calculada a partir do curso de tempo de concentração (calculado, por sua vez, a partir do indicador de transmitância tintura), supondo que ele segue a mesma dinâmica como aconcentração de corante. P _f Fit é um programa disponível para uso gratuito. O 'PfFit_Installer_web.exe' pode ser baixado a partir de: P _f Guia Fit Usuário 'com explicações e definições é acessível através de Jove como um arquivo suplementar, que ajuda a familiarizar o usuário com a P _f programa Fit.
8. No painel 'Indicador Fit', importe os dados do curso o tempo médio do transmitância Indicador Dye ("arquivo de dados Indicador ', Figura 3A) e inserir manualmente os parâmetros da experiência atuais e as estimativas iniciais dos parâmetros" width "e" t_half 'descreve a evolução temporal da concentração Indicador Dye (Figura 3B. Clique em "Executar" para ver as parcelas dos cursos de tempo da concentração Indicador Dye (dados reais e em forma, Figura 4A), e do calculado banho modelado () osmolaridade (Figura 4B). NOTA: agood ajuste aos dados é essencial (uma recomendação: comece com os valores mostrados na Figura 3).

6 Determinar o _f P usando o Matlab programa de adaptação P _f Fit

NOTA: Além dos pressupostos básicos com relação ao comportamento de um protoplasto como um verdadeiro e perfeito osm�etro ^11, a determinação do P _f repousa na presunção de que P _f pode mudar com o tempo, que essa dinâmica de P _f subjacente ao tempo Claro que a variação de volume da célula e que três parâmetros são suficientes para descrever: _fi P (o valor inicial de P _f), Pista _Pf (a taxa de variação linear de P _f) e de retardo (o período desde o início do banho mudança osmolaridade até o início da alteração do volume da célula). Diferentes modelos podem ser testados, incluindo diferentes combinações desses parâmetros e seus valores, incluindo valores nulos ^11. P _{f Fit procura a melhor combinação destes parâmetros para se obter - pelo cálculo - a reprodução mais fiel do curso da variação de volume da célula ^11, o tempo calculado experimental, por sua vez, a partir da série de áreas de células importado-contorno (ver também o Suplementar 'P f Guia Fit Usuário ").}

1. Mude para o 'Volume Fit' painel (Figura 5). Escolha para a importação do arquivo de dados de áreas (o arquivo de texto com o curso do tempo das "áreas" dos protoplastos analisados, Figura 5A). Escolha 'Last Indicador de montagem' como fonte de parâmetros (Figura 5B, ver o 'P _f Guia Fit Usuário' de alternativas). NOTA: Estes parâmetros (Figura 5D) são então usadas para regenerar a mudança osmótico no banho para os volumes correspondentes ao procedimento.
2. No painel 'Volume Fit' (Figura 5C), inicializar (preencher as estimativas iniciais para os parâmetros _F) P: P _f, Slope _Pf e Delay (uma recomendação: começar com 1, 1, e 30, respectivamente), escolheu a modelo 'Class' (uma recomendação: começar com II e marca 'cheques' para todos os três parâmetros a serem instaladas). Clique em "Executar" e, em seguida globo ocular a figura provisória (Figura 5E) e ajuste o parâmetro Delay eo comprimento do registro, se necessário.
3. Examine o gráfico resultados (Figura 6) para avaliar a qualidade em forma e gravar o erro em forma. Altere os parâmetros de inicialização alguns Dobre cada, e re-'Run '. NOTA: Não desanime quando o programa fica preso - basta reiniciar o programa!
4. Repita esse procedimento várias vezes, começando com diferentes combinações de parâmetros de inicialização, visando o menor valor do erro em forma.
5. Copie a lista dos resultados de ajuste diretamente a partir da tela, ou encontrá-los em tele PfFit gerado pelo arquivo '_FIT_Vol_Results.txt'.

Resultados

A fim de determinar o P _f e comparar a actividade de diferentes AQPs, mesófilo protoplastos de folha de Arabidopsis são utilizados. Estes protoplastos foram encontrados a ter baixos basal (fundo) P _f níveis ⁷ e pode servir como um sistema de expressão funcional para permitir medições P _f reprodutíveis.

Os protoplastos a partir de uma folha madura a partir de uma planta Arabidopsis seis semanas de idade foram isolados e três construções de...

Discussão

Aqui descrito é um procedimento simples e muito eficiente para medir a P _f isoladas de protoplastos de plantas, em princípio, aplicável também a outras células esféricas, por exemplo., Os oócitos de rã ^11. Este método baseia-se na medição da P _f em resposta a um desafio osmótico para a célula. Em contraste com os outros métodos com base nesta abordagem, no entanto, a alteração das soluções, ou seja, da osmolaridade, não é instantânea, mas gradual, d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK