삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub&gt; F</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

요약

세포의 삼투 투수 계수 (P의 _F)를 측정하는 것은 아쿠아 포린의 규제 메커니즘 (AQPs)를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 제시된 구면 식물 세포 원형질체에서 P _F 형 결정은 원형질체 분리 욕조와 일정한 관류 동안 삼투 도전 결과로서 부피 변화의 초기 레이트의 수치 분석을 포함한다.

초록

AQP 규제 메커니즘을 공부하는 것은 세포 및 전체 공장 수준 모두에서 물 관계의 이해에 매우 중요합니다. 삼투 투수 계수 식물 원형질체에서 (P에 _F), 예컨대 개구리 난 모세포와 같은 다른 세포 구형도 원칙의 적용을위한 판단이 매우 간단하고 효율적인 방법이 여기에서 제시 하였다. 분석의 첫 번째 단계는 적절한 등장 성 용액 챔버로 효소 분해에 의해 관심의 식물 조직으로부터 원형질체의 분리이다. 두 번째 단계는 삼투 도전 세이로 구성 챔버의 바닥면에 고정화 된 원형질체는 저장성 용액하여 등장액으로 일정한 관류 시작하고 그 다음에 제출된다. 세포 부종 비디오 기록이다. 세 번째 단계에서, 이미지는 부피 변화를 수득 오프라인 처리되어 부피 변화의 시간 코스는 osmola의 변화의 시간 경과와 상관챔버 관류 매체의 RITY, P의 _F를 산출하기 위해, matlab에 ( 'PfFit')로 작성된 커브 피팅 절차를 사용하여.

서문

세포막에 걸쳐 물 흡수와 흐름은 셀룰러 및 전체 공장 수준 모두에서 식물의 존재에 대한 기본적인 요구 사항입니다. 세포 수준에서, 아쿠아 포린 (AQPs)는 세포막 ^1-3의 삼투 투수 계수 (P의 _F)의 조절에 중요한 역할을한다.

지금까지 여러 가지 방법으로 다른 식물 기관에서 원형질체의 내생 P _{f를 측정에} 사용되어왔다 (즉 뿌리, 엽육, endodermis 등., 쇼몽 등. ⁴ 검토). P _{f를 측정하는} 방법 중 하나는 삼투 도전 원형질체을 노출하고 그 부피 변화의 초기 속도를 모니터링 할 수있다 (예., 체적 변화의 초기 선형 단계의 기울기). 두 가지 방법은 이전에 용액의 순간 과거에이 방법에 기초하여 설명 모두 기초 하였다. 첫 번째는 immobiliz 구성마이크로 피펫으로 흡입 원형질체를 보내고 용액 흐름 ⁵ 및 ⁶ 마이크로 ^피펫을 사용하여 다른 하나의 용액으로부터 원형질체를 전송하는 두 번째 스위칭. 빠른 용액 교환 매우 시작에서 화상 획득을 허용 한 마이크로 피펫 흡입 및 마이크로 피펫 전사 방법은, 가능성 원형질체에 대한 물리적 스트레스를 수반, (부피 변화의 초기 선형 위상을 포착하기 위해) 및 특수 장비 및 전문가 미세 조작을 필요로한다.

여기서 설명한 방법은 더 미세 조작을 수반하지 않고 목욕 관류 순시 없을 때 P _(F)의 유도를 허용하는, 세포에 교란을 최소화한다.

효소 분해 한 후, 등장 성 용액에 잠긴 원형질체는, 전하의 상호 작용에 의해 coverslip에 유리 플렉시 글라스의 바닥 (일명 플라스틱 유리 또는 방풍) 챔버에 고정된다. 그리고, 일정 기간 동안 관류 목욕,등장 성 용액은 원형질체에 hypoosmotic 도전을 생성하는 저장성 용액에 의해 멀리 플러시됩니다. 원형질체의 팽윤 비디오 기록하고, 목욕 관류의 시간 과정 및 세포 종창의 시간 경과에 대한 정보를 조합하여, P의 _F는 화상 처리 및 커브 피팅 절차에 의해 결정된다.

이 방법의 장점은, 실험이 매우 효율적임을 아르는 단일 분석에서 동시에 몇 개의 셀을 모니터하는 것이 가능하고, 특별한 장비 나 특별한 기술이 미세 조작을 필요로하지 않는다는 것을, 즉. 이 방법에 대한 몇 가지 응용이 가능하다. 예를 들면, 엽육 같은 다른 조직 및 식물의 세포의 다양한 네이티브 P _(F)의 결정 및 아라비돕시스 잎 ⁰⁷ 옥수수 잎 엽육 또는 루트 피질 세포 ^8-10 또는 현탁 배양 세포 ^{(11, 12)에서} 시쓰 세포 번들. additi에서에, 이러한 난자 전지 ^(11)로서 구형 동물 세포의 P의 _F를 결정하는 것이 가능하다. P의 _F 기여도의 판정과, 또 다른 예는 원형질체 (예 네이즈의 유전자 또는 다른 유전자에 영향을 미칠 수있는 그들)에서의 유전자의 일시적 발현으로 AQP 활성의 시험을 포함한다; 이 PEG 변환 및 결정 SlTIP2하여 애기 장대 엽육 ​​원형질체의, 예, 토마토 AQP SlTIP2의 표현 ⁽¹³⁾ _f를 P를 2 관련. 마지막으로, (등 약물, 호르몬,) 다른 분자 / 물질 P의 _F에 미치는 영향의 검토도 AQP 차단제 HgCl ₂ ^(7)의 예를 들면, 검사 할 수있는 솔루션에 추가됩니다.

다음 프로토콜은 애기 장대 엽육 ​​세포와 그들의 P _(F)의 결정의 원형질체의 분리에 대해 설명합니다.

프로토콜

솔루션의 1 준비

1. 준비 등장 (600 mOsm) 및 저장성 10 밀리미터의 KCl, 1 mM의 _염화칼슘 등을 포함 (500 mOsm) 솔루션 8 M 2 - (N-모르 폴린) -ethanesulphonic 산 (MES), 산도 5.7의 적절한 양의 삼투압을 조절 D-소르비톨 : 등장과 저장성 용액 440 밀리미터 540 밀리미터. osmometer 사용 (목표 값의 3 % 이내) 용액의 삼투압을 확인한다.
2. 다음 효소를 포함하는 '효소 믹스'의 건조 재고 준비 : 0.55 g의 셀룰라아제, 0.1 g의 pectolyase, 0.33 g 폴리 비닐 피 롤리 돈 K 30, 0.33 g의 BSA (아래의 표 참조 1) 소용돌이에 의해 건조 분말을 혼합, 5.7 mg을 분취을하고 -20 ° C에 저장합니다.

애기 장대 엽육 원형질체의 2 절연

1. 약 6 방울과 페트리 접시 (10cm)를 준비 (약합니다. 30 μL 각) 등장 성 용액을.
2. 껍질 배축 (하단) 애기 장대 잎의 표피, C다음 솔루션을 만지고 아래로 노출 된 배축면 삭제 등장 솔루션에 사각형을 배치, 약 4 × 4mm ^2의 제곱으로 벗겨 잎 유타.
3. , 165 μL에 1.5 ㎖의 튜브에 등장액 (/ w w 3.3 %)의 효소 믹스 14.4 mg을 녹이고 용해까지 분간 정도 피펫 팅하여 부드럽게 섞어 같은 배양에서의 효소 용액의 몇몇 유사한 방울을 배치 요리.
4. , 28 ° C로 설정 수욕에서 접시를 떠, 파라 필름의 한 라운드로 뚜껑을 밀봉 접시를 닫고 20 분 동안 품어 방울 효소 용액에 잎 조각을 전송합니다.
5. 접시에 등장 솔루션보다 몇 방울 (각 효소 용액 드롭 당 2 방울)를 추가합니다. 새로운 등장 솔루션 강하 각 잎 조각을 전송 한 후, 순차적으로, 두 번째 드롭에 (멀리 효소 솔루션을 씻어). , 집게를 사용하여 가장자리로 조각을 들어 올려는 원형질체를 분리합니다 (티백 등) 두 번째 드롭에 흔들.1.5 ML 튜브로 (잘립니다 100 μL 피펫 팁 사용) 원형질체와 방울을 수집합니다.

(3) 저장성 도전 분석 : 애기 장대 엽육 세포 붓기

1. 저장성 용액으로 등장 성 용액 및 다른 열 하나의 열을 작성하여 관류 시스템 (그림 1A)를 준비합니다. 아래쪽 입구 매니 폴드 (도 1b)에 튜브 끝까지 채워 용액 일부 유량 (제 저장성 후 등장 성), 밸브를 개방하자. 더 갇혀있는 기포가 없는지 확인하고 밸브를 닫습니다.
2. (, 또한도 1c의 챔버의 개략도를도 1b 참조) 내에서 슬라이드 플렉시 글라스 챔버 용 바닥을 만들기 위해, 실리콘 그리스 (표 1)를 이용하여, 커버 슬립을 봉쇄. 원형질체, 코트 "끈"(그리스 링 내에서 커버 슬립의 위쪽을 향 노출 된 표면을) 챔버 바닥을 만들려면 그또는 폴리-L-라이신 (물 중 0.1 % 표 1) 양의 차지 베어링 프로타민 설페이트 (표 1 물을 1 %)와. 2 분 린스 - 3 - 1 대기, 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 통해이 '접착제'를 확산 4 회 등장 성 용액으로하고, 나머지 솔루션을 멀리 흔들.
3. 등장 성 용액으로 챔버까지 채 웁니다. 이어서, 잘려 피펫 팁을 사용하여, 챔버 함유 용액 원형질체의 방울을 추가하고 3 기다려 - 원형질체가 정착하기위한 4 분. 투명 커버 (그림 1D, 1E)와 챔버 (아래에 공기 방울을 트래핑 방지) 솔루션 표면을 만져을 커버.
4. (빠른 속도를 거꾸로 현미경 테이블에 (! 부드럽게) 슬라이드를 놓고 관류 시스템 (튜브!에 공기 방울을 차단할) 펌프에 연결 / 분 1 ML에서 일정 관류의 등장 솔루션 흐름을 켭니다 4 ml / 분)까지 이용 될 수있다.
5. 기록을 위해부피 변화는 반전 20X 현미경 대물 렌즈와 PC 컴퓨터에 연결된 CCD 비디오 카메라와 함께 사용된다. 선택한 부동의 원형질체의 60 초 비디오 동영상을 기록 할 수 ImageJ에 소프트웨어의 'CMU 1394 카메라 드라이버'플러그인 (이 두 소프트웨어 조각의 다운로드 주소를 특정 재료의 표 참조)을 사용하여 (아마도 바닥에 붙어있는) 한 이미지 / 초 (1 Hz에서)의 속도로. 등장 성 용액의 15 초 워시 기록 (이 기준을 구성한다)를 시작, 45 초간 저장성 용액으로 전환 (재관류의 개시부터 총 60 초를 완​​료). TIF 형식으로 동영상을 저장합니다. 참고 : 최대 규모의 경계 (그림 2A)에서 모양과 잘 집중 셀 형상 구형 : 다음 기준을 충족 가능한 한 많은 세포로보기 필드를 선택합니다.

ImageJ에 사용 셀 볼륨 변경의 4 분석

참고 :를 분석하기 위해팽윤 셀의 이미지의 시리즈는 '이미지 탐색기'를 열고 (자이 Draye가 작성) ImageJ에 소프트웨어 ¹⁴ '원형질체 분석기'플러그인을 사용합니다. 첫 시점에서 선택 원형질체부터 '원형질체 분석기'플러그인 자동 원형질체 엣지 (윤곽)을 감지하고 (플러그인 아래 PfFit 분석 프로그램과 함께 사용할 수있는) 실험 기간 동안 자신의 지역 시간 코스를 계산할 .

1. ImageJ에를 시작합니다. 그들이 전개로 영화를 열려면 드롭 다운 메뉴에 연속적으로 다음, ImageJ에 패널에 '파일을'클릭 '가져 오기'다음 '이미지 탐색기'. 선택한 동영상을 강조 표시하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 한 다음 '원형질체 분석기'를 클릭 왼쪽. 실험 기간 동안 크게 움직이지 남아 원형질체를 식별하기 위해 (원형질체 이미지 하단의 슬라이더를 사용하여) 동영상을 검색 - 이러한 분석됩니다. 위로 첫번째 IMA에GE는 마우스를 사용하여, 다음 등장 생 매개 변수 '의 표에'OK '를 클릭 선택 원형질체 (그림 2B) 주위에 (ImageJ에 그리기 도구에서 선택) 원을 그립니다.
2. 원형질체 검출 알고리즘을 실행하려면, 드롭 다운 메뉴에서 다음, 원형질체 이미지 상단 패널 '프로세스'를 '지역'을 클릭합니다. 영화 전반에 걸쳐 선택한 원형질체 (그림 2C)의 주위에 녹색 동그라미를 검사합니다. 엑셀 파일의 '결과'를 저장합니다. ImageJ에를 종료합니다. 참고 : 빨간 점이 나타납니다 경우 (나쁜 윤곽에 맞게 표시하기 - 일반적으로 인해 가난한 이미지 대비로)를 다른 매개 변수로 다시 실행.
3. 각 셀에 속하는 라인 분리하는 (- 두 개 이상의 셀이 동시에 분석 된 경우 - 분석은 프레임 단위로 수행되므로, 좌우 될 것이다), 엑셀, 셀 번호 열 ( '오브젝트'에 의해 저장된 데이터를 정렬 ).
4. dete하려면, P _(F)의 실제 값을 획득하기위한 화소 간 μm의 변환율을 rmine 동일 20X 현미경 대물 렌즈를 통해 마이크로 미터 눈금자 이미지 스냅. 통치자의 이미지를 따라 (ImageJ에 그리기 도구에서 선택)은 줄을 드래그하여 ImageJ에 메인 패널의 맨 아래에있는 자 길이 화소 수에 상응를 참조하십시오. ² μM로 엑셀 파일의 임의의 화소 영역 값을 변환한다. 텍스트 파일로 (각 셀 별도로) (두 개의 숫자 열 만) 지역 시간 코스를 저장합니다. 참고 :이 볼륨 맞는 'PfFit'프로그램에 입력됩니다.

5 ImageJ에와 matlab에 프로그램 P _{f를 맞추기를} 사용하여 실험 상공 회의소에서 삼투압 변화의 속도를 모델링

1. 등장 성 용액 ( '표시 염료'를 생산하는) 100 ㎖에 2 mg을 크실렌 cyanol (표 1, 아래)를 추가합니다.
2. 표시 염료과 비 염색 시간과 (3.1)를 관류 시스템을 준비합니다ypotonic 솔루션입니다.
3. 커버 슬립 (전 원형질체와 같이)로 커버하고 현미경 스테이지에 배치하고 부드럽게 표시 염료와 챔버를 작성하여 플렉시 글라스 챔버의 바닥에 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 밀봉합니다.
4. 관류 시스템과 펌프에 실을 연결하고 리터의 ml / 분에서 일정한 관류에 대한 표시 염료 흐름을 켭니다.
5. 1 Hz에서의 속도로 60 초 동영상을 기록합니다. 표시 염료의 15 초에 녹음을 시작, 45 초 동안 저장성 용액으로 전환합니다. 촬영을 중지합니다. 표시 염료 (최소 30 초)을 세척, 새로운 영화를 시작합니다. 6 회 모든 동영상을 저장 - 5를 반복
6. 변화 투과율의 평균 시간을 구하는 과정 지표 염료 투과율의 비디오 이미지를 분석하는 소프트웨어를 ImageJ에 사용한다.
   1. ImageJ에 시작, '파일', 다음 '열기'를 클릭하고, 동영상을 검색해보세요. 각 영화의 경우, 10 픽셀 폭 넓은 수직 그릴영화의 ¹ 차 이미지의 아무 곳이나 사각형입니다. 다음 드롭 다운 메뉴에서 '잘라 내기'를 클릭, ImageJ에 메인 패널에 '이미지'를 클릭합니다.
   2. '몽타주 만들기'를 '스택'와 (열 60 행 일) : 그들은 전개로 다시 '이미지'를 클릭, 한 행에 (60 초 동영상) 60 프레임을 정렬하려면, 다음 드롭 다운 메뉴에서 연속적으로 클릭합니다. 어디서나 이미지의 전체 행을 따라 한 픽셀 높은 수평 사각형을 그리고 ImageJ에 메인 패널에서 '분석'을 클릭 한 다음 드롭 다운 메뉴에서 '플롯 프로필'을 클릭합니다. NOTE : (도시 생략) 나타난다 창 A '몽타주 플롯'및 투과율 데이터의 목록은 메뉴에서 개방 될 수있다. 영화의 각각의 이미지가 자사의 10 픽셀 폭 넓은 사각형 결과적으로 "타임베이스"에서 발생하는 열 투과율 값을 기준으로이 목록에 표시됩니다 (이미지 일련 번호)는 10 배 이상이다.
   3. 투과율 DAT의 목록을 복사Excel 파일에 (영화 당 하나의 목록). 표시 염료 홍조의 여러 영화에서 얻은 투과율 시간 코스 평균값. 0.1 이미지 일련 번호를 곱하여 실시간베이스를 생성합니다. 텍스트 파일에 평균화 시간 코스 (두 열)을 저장한다. NOTE : 평균화하기 전에, 필요한 경우, 임의의 요철을 거부, 개별 시간 과정을 플롯. 동영상이 표시 염료의 정상 상태 투과율의 적어도 5 초 최종 포함되어 있는지 확인합니다.
7. 삼투압 시간 코스의 다양한 매개 변수를 계산하기 위해 matlab에 피팅 프로그램 P _{f를 맞춤} ( '표시 맞추기'패널, 그림 3)를 시작합니다. NOTE : 욕 용액의 공지 된 초기 및 최종 농도에 기초하여, 상기 용액의 변화 삼투압 농도의 타임 코스를 가정하면, (인디케이터 염료 투과율부터 차례로 계산) 농도의 시간 경과로부터 계산된다 같은 역학을 따른다염료 농도. P _F 맞춤 무료로 사용할 수있는 프로그램입니다. P _f를 맞춤 프로그램을 사용자에게 익숙하게하는 데 도움이 보충 파일로 정돈를 통해 액세스에 대한 자세한 설명과 정의와 P _f를 맞춤 사용 설명서 ':'PfFit_Installer_web.exe은 '에서 다운로드 할 수 있습니다.
8. '표시 맞추기'패널에서 표시 염료 투과율 ( '표시 데이터 파일'도 3A)의 평균 시간 코스의 데이터를 가져 수동으로 현재 실험 매개 변수와 매개 변수 '폭'과 '의 초기 추측을 삽입 t_half 표시 염료 농도의 시간 과정의 플롯 (실제 데이터와 맞는 그림 4A)를 볼 실행 ''표시 염료 농도 (그림 3B의 시간 과정을 설명. 클릭 ', 그리고 모델 (계산) 목욕 삼투압 (그림 4B) 참고 :. AG데이터 OOD 착용감이 필수적이다 (추천 :도 3에 도시 된 숫자로 시작).

6 matlab에 피팅 프로그램 P _{f를 맞추기를} 사용하여 P _{f를 결정}

주 : 사실과 완벽 osmometer ¹¹ 같은 원형질체의 동작에 관한 기본적인 가정 사항에 더하여, P _(F)의 판정이 P의 _f는 P _(F)의이 역학 시간을 기초 것을 시간에 따라 변경 될 수 있다는 가정에 달려 세포 부피 변화의 과정과 그 세 파라미터를 설명하는 데 충분하다 : P _좋 (P _(F)의 초기치), 경사 _PF (P _(F)의 선형의 변화율)과 지연 (욕의 개시로부터 기간 세포 부피 변화의 시작까지 삼투압 변화). 다른 모델은 null 값 ^(11)을 포함하여 다른 이들 매개 변수의 조합 및 해당 값을 포함하여, 테스트 할 수 있습니다. P _{맞추기 수득 이러한 파라미터의 최적의 조합을 검색 f를 - 계산에 의해 - 셀 부피 변화 ^(11), 계산의 실험 시간 코스의 가장 충실하게 재현, 차례로, 셀 형상 영역의 임포트 시리즈에서 (참고 또한 보충 'P f를 맞춤 사용 설명서').}

1. '볼륨 맞추기'패널 (그림 5)로 전환합니다. 임포트 영역 데이터 파일 (분석 원형질체,도 5a의 '영역'의 시간 경과와 함께 텍스트 파일)을 선택한다. 매개 변수 소스로 '마지막 표시 피팅'을 선택합니다 (그림 5B, 대안은 'P _f를 맞춤 사용 설명서'를 참조). 참고 :이 매개 변수 (그림 5D)는 다음 절차를 피팅 된 볼륨에 대한 욕 농도의 삼투압 변화를 다시 생성하는 데 사용됩니다.
2. '볼륨 맞추기'패널 (그림 5C)에서 초기화 (에 대한 초기 추측) P의 _{F 매개} 변수를 입력 : P의 _F, 경사 _PF 및 지연 (추천 : 모델 '클래스'를 선택했다 각각 1, 1, 30,)로 시작 (추천 : II와 마르크로 시작 세 가지 매개 변수에 대한 '검사')가 장착된다. 다음 중간 그림 (그림 5E)를 안구하고 필요한 경우 지연 매개 변수와 레코드의 길이를 조절, '실행'을 클릭합니다.
3. 맞는 품질을 평가하고 적합 오류를 기록하는 결과 그래프 (그림 6)를 검사합니다. 약간의 각을 접어 초기화 매개 변수를 변경하고 '- 'Run를 다시. 참고 : 프로그램이 걸리면 때 낙심하지 마십시오 - 그냥 프로그램을 다시 시작!
4. 맞는 오류의 가장 낮은 값을 목표로, 초기화 매개 변수의 서로 다른 조합을 시작으로이 절차를 여러 번 반복합니다.
5. 화면에서 직접 맞는 결과 목록을 복사 또는 t에서 찾을그는 '_FIT_Vol_Results.txt'파일을 생성 PfFit.

결과

다른 AQPs의 활성을 P의 _F를 결정하고, 비교하기 위하여, 애기 장대 잎의 엽육 원형질체가 사용된다. 이 원형질체 낮은 기저 (배경)의 P _{F 레벨} ^7을 갖는 것으로하고, 재현성 P _{f를 측정} 가능하도록 기능적 발현 시스템이 될 수있다.

육주 애기 공장에서 성숙한 잎에서 원형질체는 고립 된 세 유전자는 애기 장대에서 AQP 유전자를 구축 (AtPIP2 1)과<...

토론

여기서 설명하는 다른 세포에 구면도 원칙적으로 적용 절연 식물 원형질체의 P _f를, 예를 들면., 개구리 난 모세포 ^(11)를 측정하기위한 간단하고 매우 효율적인 절차이다. 이 방법은 세포에 침투 챌린지에 응답하여 상기 P _{F의 측정에} 기초한다. 이러한 접근 방식에 기초하여 상기 다른 방법과는 대조적으로, 그러나, 삼투압의 해법의 변화, 즉, 기저 세포 부피가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK