Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Zusammenfassung

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizienten (P _f) der Zellen können helfen zu verstehen, die Regulationsmechanismen der Aquaporine (AQPs). P _f die Bestimmung der sphärischen Pflanzenzellprotoplasten Protoplasten umfasst hier dargestellten Isolierung und numerische Analyse der anfänglichen Rate der Volumenänderung als Folge eines osmotischen Herausforderung bei konstanter Badperfusion.

Zusammenfassung

Studium AQP Regulationsmechanismen ist entscheidend für das Verständnis der Wasser Beziehungen sowohl auf der zellulären und der gesamten Anlage Ebenen. Dargestellt ist hier die einfache und sehr effiziente Methode zur Bestimmung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizienten (P _f) in Pflanzenprotoplasten, grundsätzlich auch auf andere sphärische Zellen wie Frosch-Oozyten. Der erste Schritt des Assays ist die Isolierung von Protoplasten aus dem Pflanzengewebe von Interesse durch enzymatischen Verdau in eine Kammer mit einer geeigneten isotonischen Lösung. Der zweite Schritt besteht aus einem osmotischen Herausforderung Assay: Protoplasten am Boden der Kammer immobilisiert sind, um eine konstante Ausgangs Perfusion durch einen hypotonischen Lösung vorlegt, mit einer isotonischen Lösung und gefolgt. Die Zellschwellung ist Video aufgezeichnet. Im dritten Schritt werden die Bilder offline verarbeitet, um Volumenänderungen zu erhalten, und der Zeitverlauf der Volumenänderungen mit dem Zeitverlauf der Änderung in osmola korreliertheit der Kammer Perfusionsmedium mit einem Kurvenanpassungsverfahren in Matlab (die 'PfFit') geschrieben, um P _f ergeben.

Einleitung

Wasseraufnahme und Fluss durch Zellmembranen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Pflanzen Existenz sowohl auf zellulärer und die ganze Pflanze Ebenen. Auf zellulärer Ebene, Aquaporine (AQPs) spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizient (P _f) der Zellmembran ^1-3.

Bisher wurden mehrere Verfahren zur Messung der endogenen P _f Protoplasten aus verschiedenen Pflanzenorganen verwendet worden (dh Wurzeln, Mesophyll endodermis usw. Durch Chaumont et al. ⁴ Bewertung). Einer der Ansätze zur P _f zu messen, um die Protoplasten zu einer osmotischen Herausforderung freizulegen und um die anfängliche Rate der Volumenänderung zu überwachen (dh., Die Steigung der linearen Phasen Anfang der Volumenänderung). Zwei verschiedene Verfahren wurden bisher für die dieser Ansatz beschrieben, die beide auf einer momentanen Austausch von Lösungen. Die erste besteht aus immobilizing Protoplasten mit einem Sog Mikropipette und Umschalten der Lösungsstrom ⁵ und dem zweiten der Übertragung der Protoplasten von einer Lösung zur anderen mit einer Mikropipette ^6. Diese Mikropipette Saug-und Mikropipette Übertragung Methoden, die Bildaufnahme ganz am Anfang der schnellen Lösung Austausch zu ermöglichen (die frühe Phase der linearen Volumenänderung zu erfassen), wahrscheinlich beinhalten eine körperliche Belastung zu Protoplasten und erfordern spezielle Ausrüstung und Experten der Mikromanipulation.

Das hier beschriebene Verfahren minimiert die Störung der Zellen, schließt keine Mikromanipulation und ermöglicht die Ableitung von P _f, wenn die Badperfusion nicht augenblicklich.

Nach der enzymatischen Verdauung, die Protoplasten in einer isotonischen Lösung eingetaucht ist, sind auf dem Deckglas Boden einer Plexiglas (aka Lucite oder Plexiglas) Kammer, die durch Ladungs-Wechselwirkung immobilisiert. Dann wird während einer konstanten Badperfusion,die isotonische Lösung entfernt von einer hypotonischen Lösung Erzeugung eines hypoosmotischen Herausforderung für die Protoplasten gespült. Die Quellung des Protoplasten ist Video aufgezeichnet und dann durch Kombinieren der Informationen über den Zeitverlauf der Badperfusion und der Zeitverlauf der Zellschwellung, die P _f wird durch die Bildverarbeitung und Kurvenanpassungsverfahren bestimmt.

Die Vorteile dieses Verfahrens sind, dass das Experiment ist sehr effizient, das heißt es ist möglich, einige Zellen gleichzeitig in einem einzigen Assay zu überwachen, und dass es keine spezielle Ausrüstung oder insbesondere Mikromanipulationsfähigkeiten erfordern. Mehrere Anwendungen für diese Methode sind möglich. B. Bestimmung der nativen P _f eine Vielzahl von Zellen aus verschiedenen Geweben und Pflanzen, wie Mesophyll und Bündelscheidenzellen aus Arabidopsis Blatt ^7, Maisblatt Mesophyllzellen oder Wurzelcortexzellen ^8-10 oder Suspensionskulturzellen ^11,12. In Additiauf, ist es möglich, P _f des sphärischen Tierzellen wie Eizellen Zellen ¹¹ zu bestimmen. Ein weiteres Beispiel ist der Prüfung AQP-Aktivität durch transiente Expression ihrer Gens in den Protoplasten (oder andere Gene, die sie beeinflussen können, zB Gene von Kinasen) und Bestimmung von deren Beitrag zur P _f; beispielsweise die Expression von Tomaten AQP SlTIP2, 2 in Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten durch PEG-Transformation und die Entschlossenheit der SlTIP2, 2 bezogenen P _f ^13. Schließlich Prüfung der Wirkung auf P _f verschiedener Moleküle / Substanzen (Medikamente, Hormone, etc.) zugegeben, um die Lösungen können ebenfalls untersucht werden, zum Beispiel der AQP Blocker HgCl ₂ ^7.

Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung von Protoplasten von Arabidopsis Mesophyllzellen und die Bestimmung ihrer P _f.

Protokoll

1. Herstellung der Lösungen

1. Vorbereitung isotonischen (600 mOsm) und hypotonische (500 mOsm)-Lösungen, enthaltend 10 mM KCl, 1 mM CaCl _2, und 8 M 2 (N-Morpholin) -ethanesulphonic (MES), pH 5,7, und stellen die Osmolarität mit den entsprechenden Mengen an D-Sorbit: 540 mm für die isotonische und 440 mm für die hypotonischen Lösung. Überprüfen Sie, ob die Osmolarität der Lösung (im Umkreis von 3% des Zielwertes) mit einem Osmometer.
2. Bereiten Sie ein trockenes Lager der "enzymatischen Mix", die die folgenden Enzyme: 0,55 g Cellulase, 0,1 g Pectolyase, 0,33 g Polyvinylpyrrolidon K 30, 0,33 g BSA (siehe Tabelle 1 unten), mischen Sie die trockenen Pulver durch Wirbel, machen 5,7 mg Aliquots und Lagerung bei -20 ° C.

2. Isolierung von Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten

1. Bereiten Sie eine Petrischale (10 cm) mit etwa 6 Tropfen (ca.. Jeweils 30 ul) isotonischer Lösung.
2. Schälen Sie die abaxial (unteren) Arabidopsis Blattoberhaut, cut die geschälte Blatt in Quadrate von etwa 4 x 4 mm ^2, dann legen Sie die Quadrate auf der isotonischen Lösung fällt mit der freigelegten abaxial Seite nach unten, berühren Sie die Lösung.
3. Auflösen 5,7 mg des Enzym-Mix in 165 ul isotonische Lösung (3,3% w / w) in einem 1,5-ml-Röhrchen, vorsichtig mischen für eine Minute oder so, bis sie gelöst, und platzieren Sie mehrere ähnliche Tropfen der Enzymlösung in der gleichen Petri Gericht.
4. Übertragen Sie die Blattstücke auf die enzymatische Lösung Tropfen, schließen Sie das Gericht Abdichtung der Deckel mit einer Runde der Parafilm und Inkubation für 20 min, schwimmend das Gericht in einem Wasserbad auf 28 ° C eingestellt.
5. Fügen Sie noch einige Tropfen der isotonischen Lösung in die Schale (2 Tropfen pro jeder Enzymlösung Drop). Übertragen jedes Blattstück mit einem neuen isotonischen Lösung tropfen, dann sequentiell auf einen zweiten Tropfen (um die Enzymlösung abzuwaschen). Heben Sie das Stück am Rand mit einer Pinzette, schütteln Sie sie in der zweiten Tropfen (wie ein Teebeutel), um die Protoplasten freizugeben.Sammeln Sie die Tropfen mit der Protoplasten (unter Verwendung eines abgeschnitten aus 100 ul Pipettenspitze) in ein 1,5-ml-Tube.

3. Die Herausforderung Hypotone Assay: Arabidopsis Mesophyll Zellschwellung

1. Vorbereitung Perfusionssystem (1A) durch Füllen einer Säule mit dem isotonischen Lösung und einer anderen Spalte mit der hypotonischen Lösung. Das Ventil zu öffnen, lassen einige Lösungsstrom (der ersten hypotonischen, wird die isotonische), um das Rohr ganz nach unten in die Einlassverteiler (1B) zu füllen. Sicherzustellen, dass keine Luftbläschen, und schließen Sie das Ventil.
2. Siegel ein Deckglas mit Silikonfett (Tabelle 1), um einen Boden für die Kammer innerhalb des Plexiglas Schiebe machen (Abbildung 1B, siehe auch die Schaltpläne der Kammer in 1C). Um den Kammerboden (die nach oben weisenden freigelegten Oberfläche des Deckglases in der Fettring) machen "sticky" für Protoplasten, beschichtenmit positiver Ladung tragenden Protaminsulfat (1% in Wasser; Tabelle 1) oder Poly-L-Lysin (0,1% in Wasser; Tabelle 1). Verbreiten Sie diesen "Leim" über das Deckglas mit einer Pipettenspitze, warten mit 1 - 2 min, spülen Sie 3 - 4 mal mit der isotonischen Lösung und schütteln sich die verbleibende Lösung.
3. Füllen Sie die Kammer mit der isotonischen Lösung. Dann fügen Sie einen Tropfen von Protoplasten haltige Lösung in die Kammer, mit einer Pipettenspitze abgeschnitten ist, und warten Sie 3 - 4 min für die Protoplasten zu begleichen. Decken Sie die Kammer mit einer transparenten Abdeckung (1D, 1E) Berühren der Oberfläche der Lösung (Vermeidung von Luftblasen unter).
4. Legen Sie den Schieber (vorsichtig!) Auf einem inversen Mikroskop Tisch, verbinden Sie es mit der Durchblutung System und die Pumpe (Schutz vor Luftblasen im Schlauch!) Und schalten Sie den isotonischen Lösung für konstante Durchflussdurchblutung bei 1 ml / min (schneller Raten kann verwendet werden, bis zu 4 ml / min).
5. Für die AufnahmeVolumenänderungen wird ein invertiertes Mikroskop, mit einem 20x-Objektiv und ein CCD-Videokamera mit einem PC-Computer verbunden ist. Verwenden Sie die 'CMU 1394 Camera Driver "-Plugin des ImageJ-Software (siehe Tabelle mit den spezifischen Materialien für die Download-Adressen dieser beiden Software-Stücke), um einen 60 Sekunden-Video-Film von ausgewählten unbeweglich Protoplasten aufzeichnen (vermutlich jener, die mit dem Boden fest) bei einer Rate von 1 Bild / s (1 Hz). Start der Aufzeichnung mit einer 15 sec Waschen der isotonischen Lösung (dies bildet den Ausgangswert), um die hypotonischen Lösung für 45 sec Schalter (auf insgesamt 60 Sekunden vom Beginn der Perfusion zu vervollständigen). Speichern Sie den Film im TIF-Format. HINWEIS: Wählen Sie ein Feld mit Blick auf so viele Zellen wie möglich, die folgende Kriterien erfüllen: kugelförmig und mit einem gut fokussierten Zellkontur an ihren größten Umfang (Abbildung 2a).

4. Analyse der Zellvolumenänderung mit ImageJ

Hinweis: Um die AnalyseSerie von Bildern von einem Quellzelle, verwenden Sie den "Image Explorer" und "Protoplasten Analyzer 'plugins in der ImageJ-Software (von Xavier Draye geschrieben) ^14. Ausgehend von den gewählten Protoplasten an ihrem ersten Zeitpunkt wird die "Protoplasten Analyzer 'Plugin erkennt automatisch die Protoplasten Kanten (Konturen) und berechnen den Zeitverlauf ihrer Flächen während des Versuchs (die Plugins sind mit dem PfFit Analyseprogramm, unten) .

1. Starten Sie ImageJ. Um den Film zu öffnen, klicken Sie auf "Datei" auf der ImageJ-Panel, dann nacheinander auf den Dropdown-Menüs, wie sie sich entfalten: "Import" und dann "Image Explorer. Markieren Sie den ausgewählten Film, dann mit der rechten Maustaste darauf klicken, dann links klicken auf "Protoplasten Analyzer". Stöbern Sie in den Film (mit einem Schieberegler an der Protoplasten Bild unten), um Protoplasten, die während des Experiments weitgehend unbeweglich bleiben identifizieren - diese werden analysiert werden. Zurück auf der ersten image, mit der Maus, ziehen Kreise (aus den ImageJ Zeichenwerkzeuge aufgenommen) um die ausgewählten Protoplasten (2B), dann klicken Sie in der Tabelle der "Nachweis Parameter ', die erschien' OK '.
2. Um die Protoplastenerkennungsalgorithmus zu starten, klicken Sie auf 'Local' auf der Protoplasten Bild oben Panel, dann "Prozess" im Dropdown-Menü. Untersuchen Sie die grüne Kreise um die ausgewählten Protoplasten (Abbildung 2C) während des Films. Speichern Sie das 'Ergebnis' in einer Excel-Datei. Beenden Sie ImageJ. HINWEIS: Im Falle erscheint ein roter Punkt (eine schlechte Passform Kontur zeigen - in der Regel aufgrund einer schlechten Bildkontrast), erneut mit anderen Parametern.
3. Um die zu jeder Zelle gehörenden Linien zu trennen (- wenn zwei oder mehr Zellen wurden gleichzeitig analysiert - was wird miteinander verflochten werden, da die Analyse Frame für Frame), in Excel, sortieren Sie die gespeicherten Daten von der Zellzahl-Säule ("Objekt" ).
4. Nach Determine die Pixel-zu-um-Umrechnungsfaktor für den Erhalt der Realwert der P _f, Snap ein Bild von einem Mikrometer Herrscher über die gleiche 20X Mikroskop-Objektiv. Ziehen Sie eine Linie (aus den Zeichenwerkzeugen ImageJ abgeholt) entlang der Bild Lineal und lesen Sie die Pixelzahl entspricht der Herrscher Länge an der Unterseite des ImageJ Hauptfeld. Konvertieren Sie die beliebige Pixelbereich Werte in der Excel-Datei in um ^2. Speichern Sie die Bereiche Zeitverlauf (für jede Zelle separat) als Textdatei (zwei Spalten mit Zahlen). ANMERKUNG: Dies wird als Eingang zu dem Volumen schlüssige 'PfFit "Programm sein.

5. Modellierung der Währungs Osmolarität Wechsel in der Versuchskammer mit ImageJ und der MATLAB-Programm P _f Fit

1. Add 2 mg Xylencyanol (Tabelle 1, unten), um 100 ml der isotonischen Lösung (die "Indikatorfarbstoff 'zu erzeugen).
2. Bereiten Sie die Perfusion System (wie in 3.1) mit der Indikatorfarbstoff und der nicht gefärbt hypotonic Lösung.
3. Siegel ein Deckglas mit Silikonfett auf den Boden der Kammer Plexiglas, dann vorsichtig die Kammer mit der Indikatorfarbstoff zu füllen, bedecken Sie es mit einem Deckglas (wie bei den Protoplasten vor) und legen Sie es auf den Mikroskoptisch.
4. Schließen Sie die Kammer mit dem Perfusionssystem und der Pumpe, und schalten Sie den Indikatorfarbstoff Fluss für eine konstante Durchblutung bei l ml / min.
5. Nehmen Sie einen 60 Sekunden-Film mit einer Rate von 1 Hz. Starten Sie die Aufnahme mit 15 Sekunden der Indikatorfarbstoff, wechseln Sie in die hypotone Lösung für 45 Sekunden. Dreharbeiten zu stoppen. Bündig mit der Indikatorfarbstoff (mindestens 30 Sekunden), und starten Sie einen neuen Film. Wiederholen etwa 5 - 6 mal, und speichern Sie alle Filme
6. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Videobilder von der Indikatorfarbstoff Lässigkeit zu analysieren, um einen gemittelten Zeitverlauf der Veränderung Lässigkeit zu erhalten.
   1. Starten Sie ImageJ, klicken Sie auf "Datei", dann auf "Öffnen", und suchen Sie nach dem Film. Für jeden Film, ziehe eine 10 Pixel breite vertikaleRechteck überall auf dem ^1. Bild des Films. Klicken Sie auf "Bild" auf der ImageJ Hauptfeld, und klicken Sie auf 'Crop' im Dropdown-Menü.
   2. Um die 60 Bilder (von der 60 Sekunden-Film) in einer Reihe ausgerichtet, klicken Sie erneut auf 'Bild', dann klicken Sie nacheinander in den Dropdown-Menüs, wie sie sich entfalten: "Stacks" und "Make Montage" (Spalten 60, Reihe 1). Zeichnen Sie ein 1 Pixel hohe horizontale Rechteck überall entlang der ganzen Reihe von Bildern und klicken Sie auf "Analysieren" in der ImageJ Hauptfeld, dann klicken Sie auf "Grundstück Profil" im Dropdown-Menü. HINWEIS: Ein 'Plot der Montage "-Fenster erscheint (nicht gezeigt), und eine Liste der Transmissionsdaten von seinem Menü geöffnet werden. Jedes Bild des Films wird in dieser Liste von 10 Transmissionswerte mit Ursprung in seinem 10 Pixel breiten Rechteck und damit die "Zeitbasis" vertreten (das Bild fortlaufende Nummer) ist 10-mal länger.
   3. Kopieren Sie die Listen der Durchlässigkeit datein (eine Liste pro Film) in eine Excel-Datei. Der Mittelwert der Transmissionszeitkurse von den mehreren Filmen des Indikatorfarbstoffs Wallungen erhalten. Generieren Sie eine Echtzeit-Basis durch Multiplikation der Bild laufende Nummer 0.1. Speichern Sie die gemittelten Zeitverlauf (zwei Spalten) in eine Textdatei. HINWEIS: Vor dem Mittelwertbildung, wenn gewünscht, zu plotten die einzelnen Zeitkurse, um Unregelmäßigkeiten zu verwerfen. Stellen Sie sicher, dass der Film mindestens 5 sec Finale der Steady-State-Durchlässigkeit des Indikatorfarbstoffs.
7. Starten Sie das Programm Matlab pass P _f Fit (Panel "Anzeiger Fit ', Bild 3), um die verschiedenen Parameter der Osmolarität Zeitverlauf zu berechnen. HINWEIS: basierend auf den bekannten anfänglichen und endgültigen Konzentrationen der Lösung in dem Bad wird der zeitliche Verlauf der Veränderung des osmotischen Konzentration der Lösung von den Konzentrationsverlauf berechnet (berechnet, die wiederum von der Indikatorfarbstoff Lässigkeit), vorausgesetzt, es folgt die gleiche Dynamik wie dieFarbstoffkonzentration. P _f Fit ist ein Programm zur kostenlosen Nutzung zur Verfügung. Die "PfFit_Installer_web.exe" kann heruntergeladen werden von: P _f Fit Benutzerhandbuch "mit ausführlichen Erklärungen und Definitionen ist über Zeus als zusätzliche Datei, die den Benutzer mit der P _f Fit-Programm vertraut zu machen hilft zugänglich.
8. In dem Panel "-Anzeige Fit", importieren Sie die Daten der mittleren Zeitverlauf der Indikatorfarbstoff Lässigkeit ("Indikator-Datendatei", 3A) und legen Sie manuell die aktuellen Experimentparameter und die anfänglichen Vermutungen der Parameter 'Breite' und ' t_half 'den Zeitverlauf der Konzentration der Indikatorfarbstoff (3B beschreibt. Klicken Sie auf "Ausführen", um die Grundstücke der Zeitverläufe der Konzentration der Indikatorfarbstoff (Echtdaten und fit, 4A) und von der modellierten (berechnet) Bad Osmolarität (4B). HINWEIS: agOOD Anpassung an die Daten ist von wesentlicher Bedeutung (eine Empfehlung: Beginnen Sie mit den in Abbildung 3 dargestellten Werte).

6. Die Bestimmung der P _f mit der Matlab Fitting-Programm P _f Fit

HINWEIS: Zusätzlich zu den grundlegenden Annahmen in Bezug auf das Verhalten von einem Protoplasten als eine wahre und vollkommene Osmometers ^11, die Bestimmung der P _f beruht auf der Annahme, dass P _f sich mit der Zeit ändern, dass diese Dynamik der P _f liegt unter der Zeit Verlauf der Zellvolumenänderung und dass drei Parameter aus, um es zu beschreiben: P _fi (den Anfangswert des P _f), Slope _Pf (die Geschwindigkeit der Längenänderung von P _f) und Delay (die Zeit vom Beginn des Bades Osmolarität Änderung bis zum Beginn der Zellvolumenänderung). Verschiedene Modelle können getestet werden, darunter verschiedene Kombinationen dieser Parameter und deren Werte, einschließlich Nullwerte ^11. P _{f Fit nach dem besten Kombination dieser Parameter zu ergeben - durch Berechnung - die originalgetreue Reproduktion des Versuchszeitverlauf der Zellvolumenänderung ^11, berechnet, die wiederum aus der importierten Reihe von Zell-Konturbereiche (siehe auch die Zusatz 'P f Fit Benutzerhandbuch).}

1. Wechseln Sie auf die "Volume Fit"-Panel (Abbildung 5). Wählen Sie für den Import die Bereiche Datendatei (die Textdatei mit dem zeitlichen Verlauf der "Gebiete" der untersuchten Protoplasten, 5A). Wählen Sie "Letzte Anzeigefitting 'als Parameter Quelle (5B, siehe' P _f Fit Benutzerhandbuch" für Alternativen). ANMERKUNG: Diese Parameter (5D) werden dann dem Osmotikum Veränderung des Bades für die Datenträger Anpassungsvorgang zu regenerieren.
2. In der "Volume Fit"-Panel (5C), zu initialisieren (füllen Sie die Anfangsschätzungen für) die _{P-f-Parameter:} P _{f, Pf} und Slope Delay (eine Empfehlung: Beginnen Sie mit 1, 1, bzw. 30), wählte das Modell 'Klasse' (Empfehlung: Beginnen Sie mit II und Mark "Kontrolle" für alle drei Parameter eingebaut werden). Klicken Sie auf "Ausführen", dann Augapfel den Zwischenwert (5E) und stellen Sie die Delay-Parameter und die Länge des Datensatzes, wenn nötig.
3. Untersuchen Sie die Ergebnisse Grafik (Abbildung 6), um die Passform zu bewerten Qualität und notieren Sie die Passform Fehler. Ändern Sie die Initialisierung Parameter ein paar falten jedem, und wieder'Run '. HINWEIS: Seien Sie nicht entmutigt werden, wenn das Programm stecken bleibt - das Programm neu starten gerade!
4. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, beginnend mit verschiedenen Kombinationen von Initialisierung Parameter, mit dem Ziel für den niedrigsten Wert des Passfehler.
5. Kopieren Sie die Liste der Passform ergibt sich direkt aus dem Bildschirm, oder finden sie in ter PfFit generierte '_FIT_Vol_Results.txt' Datei.

Ergebnisse

Um die P _f die Aktivität verschiedener AQPs bestimmen und zu vergleichen, werden Mesophyll-Protoplasten aus Arabidopsis Blatt verwendet. Diese Protoplasten wurden gefunden, um niedrigen Grund (Hintergrund) P _f Stufen ⁷ und kann als Funktions-Expressionssystem dienen, um reproduzierbare Messungen P _f zu ermöglichen.

Protoplasten aus einer reifen Blatt von einem 6 Wochen alten Arabidopsis-Pflanze wurden isoliert und drei Gen-Konstrukte mit AQP Gene...

Diskussion

Beschrieben wird hier ein einfaches und sehr effizientes Verfahren zur Messung der P _f der isolierten pflanzlichen Protoplasten, grundsätzlich auch auf andere sphärische Zellen, zB., Froschoozyten ^11. Diese Methode basiert auf der Messung der P _f in Reaktion auf eine osmotische Herausforderung an die Zelle. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die auf diesem Ansatz ist jedoch die Änderung von Lösungen, dh der Osmolarität, nicht plötzlich, sondern allmählich, währen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK