تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

Summary

وهناك طريقة لتقييم قدرة معزولة الضامة السنخية الماوس للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة من قبل الرشاشيات المجهري متحد البؤر.

Abstract

الرئة هو واجهة حيث تتعرض الخلايا المضيفة بشكل روتيني للميكروبات والمنتجات الميكروبية. الضامة السنخية هي الخلايا البلعمية الخط الأول التي تواجه الفطريات والميكروبات الأخرى المستنشق. الضامة والخلايا المناعية الأخرى تعترف الزخارف الرشاشيات بواسطة مستقبلات الاعتراف الممرض والشروع في الاستجابات الالتهابية المصب. أوكسيديز NADPH بلعمية يولد سيطة الاكسجين التفاعلية (رويس) وهذا أمر مهم للدفاع المضيف. على الرغم من NADPH أوكسيديز هو أمر حاسم لبوساطة العدلات دفاع المضيف ^1-3، ليست محددة جيدا أهمية NADPH أوكسيديز في الضامة. وكان الهدف من هذه الدراسة لتحديد دور محدد من NADPH أوكسيديز في الضامة في التوسط الدفاع المضيف ضد A. فوميجاتوس. وجدنا أن أوكسيديز NADPH في الضامة السنخية تسيطر على نمو المبتلعة A. فوميجاتوس جراثيم ^4. هنا، نحن تصف طريقة لتقييم قدرة الفأرالضامة lveolar (AMS) للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة الرشاشيات (غبيرات). هي ملطخة الضامة السنخية في الجسم الحي وعزل بعد عشرة أيام من الفئران عن طريق غسل القصبات (BAL). ومطلي الضامة على coverslips الزجاج، ثم المصنف مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، معربا عن A. جراثيم فوميجاتوس. في أوقات محددة، يتم إصلاح الخلايا ويتم تقييم عدد الضامة سليمة مع الجراثيم المبتلعة بواسطة المجهر متحد البؤر.

Introduction

الضامة السنخية هي الخلايا البلعمية الخط الأول التي تواجه الميكروبات المستنشق. الضامة الاعتراف الزخارف الرشاشيات بواسطة مستقبلات الاعتراف الممرض، واستيعاب الحد من نمو الجراثيم استنشاقه (غبيرات)، والشروع في الاستجابات الالتهابية. أوكسيديز NADPH بلعمية يحول الأكسجين الجزيئي لأنيون الفائق والمصب سيطة الاكسجين التفاعلية (رويس). الداء الحبيبي المزمن (CGD) هو اضطراب وراثي من أوكسيديز NADPH تتميز الالتهابات البكتيرية والفطرية الشديدة والاستجابات الالتهابية المفرطة.

على الرغم من NADPH أوكسيديز هو أمر حاسم لبوساطة العدلات دفاع المضيف ^1-3، ليست محددة جيدا أهمية NADPH أوكسيديز في الضامة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الضامة السنخية استيعاب وقتل الجراثيم الرشاشيات، في حين تستهدف أساسا العدلات المرحلة خوطي ^5. ومع ذلك، فقد كان هناك تضارب بالنتيجهنهاية الخبر لدور أوكسيديز NADPH في البلاعم في السيطرة على نمو A. فوميجاتوس جراثيم ^{6، 7.}

وكان الهدف من هذا الأسلوب لتحديد دور محدد من NADPH أوكسيديز في الضامة في التوسط الدفاع المضيف ضد A. جراثيم فوميجاتوس. وجدنا أن أوكسيديز NADPH في الضامة السنخية تسيطر على نمو المبتلعة A. فوميجاتوس جراثيم ^4. لنمذجة الأكثر تطابقا استجابة المضيف لاستنشاق الفطريات، استخدمنا الضامة السنخية المقطوع من قبل غسل الشعبى من الفئران unstimulated التالية التضحية فورا. استخدام الضامة السنخية معزولة مكنتنا من التركيز على نشاطهم مضاد للفطريات في غياب الخلايا المناعية الأخرى (على سبيل المثال، العدلات المعينين) التي تدافع ضد الرشاشيات في الجسم الحي. في هذه الطريقة، كانت ملطخة الضامة السنخية في الجسم الحي قبل الحصاد وذلك لتقليل كمية من التلاعب في مرحلة ما بعد الحصاد.

ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو استخدام، معربا عن GFP A. فوميجاتوس السلالة. هذه الفطريات عن GFP من مرحلة غبيري خلال المرحلة خوطي وليس لديها الحاجة إلى مزيد من تلطيخ. للحصول على صور مع بمزيد من التفصيل، اخترنا المجهري متحد البؤر والتي تمكن إعادة بناء هياكل ثلاثية الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها. إعادة البناء ثلاثي الأبعاد يعطي القدرة على التفريق بين خيوط متنامية في جميع أنحاء بدلا من أو من خلال البلاعم. غبيرات يمكن أيضا أن تكون متميزة تماما كما داخل الخلايا مقابل خارج الخلية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام في معهد روزويل بارك للسرطان وامتثلت لجميع الدولة الاتحادية، والمعاهد الوطنية للصحة اللوائح.

1. في الجسم الحي بلعم صفها

ملاحظة: PHK26 هو صبغ محبة للدهون التي سيتم تناولها من قبل الخلايا البلعمية في كل من الدورة الدموية والأنسجة في عندما تدار عن طريق الوريد (رابعا). وقد استخدم PKH26 لوضع العلامات في الجسم الحي لتقليل كمية من التلاعب ما بعد الحصاد من البلاعم. PKH-26 في الاستفادة من تراكم ثابت في الضامة السنخية على مدى فترات طويلة. الانتظار بعد 10 أيام الإدارة يسمح لتطهير جميع الخلايا المسمى من التداول البلاعم السنخية ولم يتبق سوى المسمى ثابت مع PKH26 ^{8، 9.} PKH26 هو تألقي الحمراء التي لديها الإثارة (551 نانومتر) والانبعاثات (567 نانومتر) الخصائص المتوافقةمع أنظمة رودامين أو الكشف فيكوإيريترين. يمكن لأي إجراءات وضع العلامات إدخال قطعة أثرية، بما في ذلك فقدان قدرتها على البقاء. ومع ذلك، وبما أننا نستخدم نفس النهج لوضع العلامات الضامة في المورثات الماوس مختلفة (على سبيل المثال، WT-أوكسيديز NADPH مقابل ناقص)، وآثار هذه الأعمال الفنية أن تكون موحدة.

1. تمييع الحل الأسهم من PKH26 (1 × 10 ^-3 M في الإيثانول) في 01:05 مخفف C المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
2. تحميل 100 ميكرولتر من المخفف PKH26 إلى الأنسولين حقنة 1/2 مل (29 G × 1/2 ") لكل الماوس.
3. إدارة على الفئران عن طريق الحقن الرابع (إما الذيل الوريد أو الرجعية المدارية) 10 يوما على الأقل قبل الحصاد.

2. حصاد الضامة السنخية بواسطة القصبات الغسل (BAL)

يمكن أن تختلف في عدد من الفئران لاستخدامها في تجربة. A العائد نموذجية من الماوس unstimulated هو في حدود 3-5 × 10 ⁵ الضامة السنخية، ولكن هذا العدد يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا النحتإد على عوامل مثل حجم الفأر، خبرة الشخص أداء غسيل، وعدد instillations من السائل غسل وحجم سحبها من الرئتين. في هذا البروتوكول يتم تنفيذ غسيل الرئة مع تجويف الصدري المغلقة التي جنبا إلى جنب مع تكرار 1 مل lavages يساعد على زيادة الغلة الخلية.

1. الموت ببطء الماوس عن طريق إدارة جرعة قاتلة من مخدر AVERTIN (12.5 ملغ) الغشاء البريتونى (IP) باستخدام ظروف معقمة للحفاظ على محلول معقم.
2. رذاذ الماوس تماما مع الايثانول 70٪.
3. إزالة الجلد من نهاية الجمجمة من الحيوان تعريض الصدر (الشكل 1A).
   1. جعل قطع صغير في الجلد فقط تحت الحجاب الحاجز.
   2. إدراج إصبع في خفض وسحب الجلد بعيدا عن نهاية الجمجمة من (1A الشكل) الحيوان.
   3. دفع ما يصل قليلا على الرأس، وتمتد الجانب البطني من الرقبة (الشكل 1A).
4. قطع ثقب صغير من خلال القفص الصدريفي الجانب الأيمن من الصدر لامتصاص التضخم الرئتين وأيضا يسمح التصور من الرئتين خلال الخطوات التالية.
5. تحديد موقع القصبة الهوائية، وبعناية تشريح الأنسجة المحيطة بها بعيدا.
   1. إزالة الغدد اللعابية والعضلات العضلة القصية والحنجرة، وما إلى ذلك مع ملقط المنحني.
   2. رفع بعناية مع ملقط المنحني وقطع مع مقص النسيج الرقيق الذي يغطي القصبة الهوائية (البرانية) الكشف عن بنية الغضروف الحلقية الأساسية.
6. إدراج قسطرة في القصبة الهوائية.
   1. باستخدام ملقط المنحني، ووضع خياطة وراء (الظهرية ل) القصبة الهوائية وسحب بطول 10 سم من خلال فتح.
   2. بدءا فوق الحلقي (حلقة سميكة من غضروف) توجيه بعناية 22 G قسطرة أسفل القصبة الهوائية وقف حيث يختفي القصبة الهوائية وراء القص.
   3. بحزم التعادل خياطة حول القصبة الهوائية والقسطرة لنوبة دافئ. إزالة الإبرة من القسطرة.
7. تجميع 4 في اتجاه محبس.
   1. شغلواحد 6 مل المحاقن مع DPBS، 1٪ FBS ونعلق على 4 في اتجاه محبس كما هو مبين في الشكل 1B.
   2. إرفاق فارغة 6 مل حقنة في موقف مبين على 4 في اتجاه محبس (الشكل 1B).
   3. إرفاق منفذ مفتوح على 4 في اتجاه محبس لقسطرة (الشكل 1B). نكون حذرين حتى لا طرد القسطرة من القصبة الهوائية.
8. جمع السائل غسل من الرئتين.
   ملاحظة: المحققون قد تختار لاستخدام وحدات التخزين أقل من السوائل غسيل لتقليل احتمال حدوث تلف في الأنسجة. من المهم أن نفس النهج يتم تطبيقها باستمرار في جميع الفئات الماوس.
   1. تحويل مقبض على محبس حتى يتم إغلاق حقنة فارغة وحقن ببطء ~ 1 مل DPBS، 1٪ FBS لتضخيم الرئتين. مراقبة التضخم الرئة من خلال قطع حفرة في الخطوة 2.4.
   2. يجب الحرص على عدم overinflate الرئتين.
   3. تحويل مقبض على محبس بحيث يتم إغلاق حقنة كاملة، وسحب بعناية الانفلونزا معرف من الرئتين.
   4. مراقبة الرئتين فرغ من خلال قطع حفرة في الخطوة 1.4. قد تحتاج القسطرة أن تحرك حركة طفيفة في الظهر أو إيابا للحصول على قرعة جيدة. اتخاذ الاحتياطات الخاصة للحفاظ على القسطرة داخل القصبة الهوائية.
   5. كرر الخطوات من 2.8.1-2.8.4 5-6X حتى كل DPBS، 1٪ تم حقن FBS وسحبها من الرئتين. ملاحظة: سوف استرداد السوائل الرئة لا تكون 100٪ من سائل المحقون.
9. حقنة فارغة بسائل غسيل في أنبوب مخروطي 50 مل. إبقاء الخلايا في درجة حرارة الغرفة.
10. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتصب قبالة طاف. يمكن حفظ هذا لتحليل خلوى اذا شئت.
11. الخلايا resuspend في 1-5 مل 1640 RPMI مع FBS 10٪ والاعتماد على عدادة الكريات. في الماوس unstimulated، ومن المتوقع أن تكون الضامة، والتي يمكن التأكد من الخلايا> 95٪ من الخلايا تحصد BAL.

3. التثقيف وحصاد الفطر

"> وفوميجاتوس الرشاشيات المستخدمة في هذا البروتوكول عن GFP في جميع مراحل دورة حياتها: جراثيم، germlings وخيوط وقدمت هذه السلالة الفطرية الدكتور مارجو مور، جامعة سايمون فريزر، برنابي، BC، كندا.

1. لوحة غبيرات من سلالة الرشاشيات الدخناء معربا عن GFP في سابورو القلب ضخ الدماغ (بهي) أجار الميول مع كلورامفينيكول (0.05 ز / L) وجنتاميسين (0.5 جم / لتر).
2. احتضان في الظلام توج فضفاضة لمدة 7 إلى 10 أيام في درجة حرارة الغرفة.
3. الحصاد غبيرات عن طريق الغسيل الميل مع 10 مل من 0.01٪ توين 20 في DPBS. بخفة كشط الفطر مع stripette لتخفيف. شطف مائل عدة مرات لزيادة الغلة.
4. تمرير تعليق غبيري من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر إلى 50 مل المخروطية.
5. بيليه غبيرات بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
6. غبيرات resuspend في 50 مل DPBS والعد باستخدام عدادة الكريات.
7. يغسل مرتين مع DPBS وتمييع لتركيزات المطلوبالفلترة.

4. التحدي الفطرية ومتحد البؤر المجهري

للتحقيق في دور بلعم NADPH أوكسيديز في الدفاع المضيف، تم تقييم قدرة الضامة السنخية الفئران المعزولة من ثلاثة أنماط جينية للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة الرشاشيات. وتشمل الطرز الوراثية المستخدمة في هذه الدراسة؛ 1) من النوع البري الفئران، 2) Ncf1 * / * المنغنيز والفئران مع طفرة Ncf1 طبيعيا (Ncf1 بترميز ^لphox P47، مكون مطلوب من أوكسيديز NADPH بلعمية) تركهم NADPH أوكسيديز ناقصة، و3) Ncf1 * / * المنغنيز + الفئران المعدلة وراثيا (MN يدل على التحوير ايواء wildtype Ncf1 تحت سيطرة المروج CD68 الإنسان) حيث تم إعادة تشكيل NADPH أوكسيديز النشاط في عدد السكان الوحيدات / بلعم ^{10، 11.}

هو الانسب المجهري متحد البؤر لهذا الفحص نظرا لوجودونمو غبيرات غير المبتلعة على الشرائح. سوف المجهر متحد البؤر تسمح لرؤية الطائرات الفردية ضمن Z-المحور، وتمكين التفريق بين الفطريات المتنامية في جميع أنحاء بدلا من داخل البلاعم. يتم الحصول على جميع الصور متحد البؤر باستخدام عدسة 63X الغمر النفط. يتم الحصول على Z-مداخن مع عامل التكبير الإلكترونية من 2.5. يتم تحديد سمك Z-مكدس باستخدام دابي والصور مجال مشرق لتحديد أعلى وأسفل الحقل. تراوحت Z-مداخن 14-24 ميكرومتر مع شرائح الفردية ~ 1 ميكرون سميكة. لتقدير حجم الضامة، وأجريت عمليات الفحص واحدة من التكبير الإلكترونية 1X على 10 حقول في التركيب الوراثي. وحددت الضامة سليمة على أساس PKH26 وتلطيخ دابي من الغشاء والنواة على التوالي. وقد تم تحديد غبيرات على أساس التعبير FITC وصورة حقل مشرق.

1. إعداد coverslips العقيمة وألواح
   1. تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ونقع 22 × 22 مم coverslips الزجاج في 70٪ ethanoلتر لمدة 5-10 دقيقة.
   2. شطف coverslips في برنامج تلفزيوني العقيمة.
   3. باستخدام ملقط معقم، ووضع بلطف ساترة واحد في الجزء السفلي من كل بئر من العقيمة معبأة منفردة وحة 6 جيدا.
2. البذور ~ 1 × 10 ⁶ تحصد المسمى PKH26 الضامة السنخية علقت في 300 ميكرولتر RPMI 1640، 10٪ FBS على كل ساترة. قد تختلف العدد الدقيق اعتمادا على محصول الحصاد.
3. تسمح بلعم على الالتزام التي يحتضنها عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO ₂ بين عشية وضحاها.
4. في صباح اليوم التالي، إضافة ~ 1 × 10 ^7، معربا عن GFP A. فوميجاتوس غبيرات علقت في 100 ميكرولتر قبل حرارة (37 درجة مئوية) RPMI 1640، 10٪ FBS.
5. العودة إلى لوحة الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO _2.
6. ينبغي أن تكون ثابتة الخلايا مدة لا تقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في 3 و 7 و 14 ساعة خلايا الإصلاح عن طريق إضافة حجم مساو من 2٪ الفورمالديهايد إلى كل بئر (تركيز النهائي 1٪ الفورمالديهايد). مكان لوحات لنقاط زمنية مبكرة في 4 درجات مئوية خلال الليل. لنقطة مرة الأخيرة (14 ساعة)، وإصلاح الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
7. بعد التثبيت، وإزالة بلطف coverslips باستخدام ملقط وشطف في DPBS.
8. إزالة السوائل الزائدة عن طريق وضع حافة ساترة على Kimwipe مطوية.
9. 6 تطبيق ميكرولتر مضان المتوسطة المتزايدة مع دابي إلى شريحة المجهر والزجاج.
10. وضع حافة واحدة من ساترة على الشريحة وإسقاط بلطف مع الجانب الخلية أسفل إلى المتوسطة المتزايدة. وتصاعد المتوسطة تنتشر وتشكل حتى طبقة تحت ساترة. ليست هناك حاجة للضغط على ساترة.
11. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة وتسمح للهواء الجاف.
12. مخزن أعد الشرائح في مربع الشريحة (محمية من الضوء) في درجة حرارة الغرفة حتى جاهزة للتحليل بواسطة المجهر متحد البؤر.

النتائج

وجمع البلاعم السنخية بواسطة BAL من الفئران unstimulated يؤدي إلى السكان نقية> 95٪ على أساس علم الخلايا. 3 و 7 ساعة (الشكل 2) نقاط زمنية تسبق مرحلة خوطي من نمو الفطريات والسماح للمقارنة بين كفاءة أكلة من غبيرات بين الأنماط الجينية. نقطة الساعة 14 ساعة حيث يمكن مقارنة ...

Discussion

استخدام هذا النهج لالسابقين فيفو تحليل نشاط مضاد الضامة في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع الفطرية التحدي، أثبتنا سابقا أن أوكسيديز NADPH في الضامة تلعب دورا هاما في الدفاع ضد A. فوميجاتوس ^4. استخدام الضامة السنخية معزولة يتيح لنا التركيز على نشاطهم مضاد ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope