Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Resumo

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Resumo

O pulmão é uma interface em que as células hospedeiras são rotineiramente expostas a microorganismos e produtos microbianos. Macrófagos alveolares são células fagocíticas de primeira linha que encontram fungos inalados e outros micróbios. Os macrófagos e outras células do sistema imunológico reconhecem motivos Aspergillus por receptores de reconhecimento de patógenos e iniciar respostas inflamatórias a jusante. A NADPH oxidase de fagócitos gera intermediários reativas de oxigênio (ROIs) e é fundamental para a defesa do hospedeiro. Apesar de NADPH-oxidase é crítica para a defesa do hospedeiro mediada pelos neutrófilos ^1-3, a importância da NADPH-oxidase em macrófagos não está bem definido. O objetivo deste estudo foi delinear o papel específico da NADPH oxidase em macrófagos na mediação de defesa do hospedeiro contra A. fumigatus. Descobrimos que a NADPH oxidase de macrófagos alveolares controla o crescimento de A. fagocitado fumigatus esporos ^4. Aqui, descrevemos um método para avaliar a capacidade de um ratomacrófagos lveolar (AMS) para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados (conídios). Macrófagos alveolares são coradas in vivo e dez dias mais tarde isolado a partir de murganhos por lavagem broncoalveolar (BAL). Os macrófagos são semeadas em lamínulas de vidro, então semeado com a proteína verde fluorescente (GFP) expressando A. esporos fumigatus. Em momentos específicos, as células são fixadas e o número de macrófagos intactas com esporos fagocitados é avaliada por microscopia confocal.

Introdução

Macrófagos alveolares são as células fagocíticas de primeira linha que encontram micróbios inalados. Os macrófagos reconhecem motivos Aspergillus por receptores de reconhecimento de patógenos, ingerir e limitar o crescimento de esporos inalados (conídios), e iniciar as respostas inflamatórias. A NADPH oxidase de fagócitos converte oxigênio molecular ao ânion superóxido e intermediários reativas de oxigênio a jusante (ROIs). A doença granulomatosa crônica (CGD) é uma desordem hereditária do sistema NADPH oxidase caracterizada por infecções bacterianas e fúngicas graves e por respostas inflamatórias excessivas.

Apesar de NADPH-oxidase é crítica para a defesa do hospedeiro mediada pelos neutrófilos ^1-3, a importância da NADPH-oxidase em macrófagos não está bem definido. Estudos anteriores mostraram que os macrófagos alveolares ingerir e matar os esporos de Aspergillus, enquanto que os neutrófilos como alvo principalmente o estágio de hifas ^5. No entanto, tem havido resul conflitantests quanto ao papel da NADPH-oxidase em macrófagos para controlar o crescimento de A. fumigatus esporos ^{6, 7.}

O objetivo deste método foi delinear o papel específico da NADPH oxidase em macrófagos na mediação de defesa do hospedeiro contra A. esporos fumigatus. Descobrimos que a NADPH oxidase de macrófagos alveolares controla o crescimento de A. fagocitado fumigatus esporos ^4. Para modelar mais de perto a resposta do hospedeiro a fungos inalados, usamos macrófagos alveolares colhidas por lavagem broncoalveolar de camundongos não estimuladas imediatamente após o sacrifício. O uso de macrófagos alveolares isolados nos permitiu concentrar em sua atividade antifúngica, na ausência de outras células do sistema imunológico (por exemplo, neutrófilos recrutados) que defendem contra Aspergillus in vivo. Neste método, os macrófagos alveolares foram coradas in vivo antes da colheita de modo a minimizar a quantidade de manipulação de pós-colheita.

Outra vantagem do presente protocolo é a utilização de um expressando GFP-A. fumigatus tensão. Este fungo expressa GFP a partir da fase de conídios através da fase de hifas e não tem necessidade de uma maior coloração. Para obter imagens com maior detalhe, escolhemos microscopia confocal que permite a reconstrução de estruturas tridimensionais a partir de imagens obtidas. A reconstrução tridimensional dá a capacidade de diferenciar entre hifas em torno, em vez de em ou através de um macrófago. Os conídios também pode ser justamente distinguido como intracelular contra extracelular.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use em Roswell Park Cancer Institute e cumpriu todo o estado, federal, e os Institutos Nacionais de Saúde regulamentos.

1. In vivo macrófago Labeling

Nota: PHK26 é um corante lipofílico que serão absorvidos pelas células fagocíticas, tanto na circulação e nos tecidos quando administrados por via intravenosa (iv). PKH26 foi utilizado para a etiquetagem in vivo para minimizar a quantidade de manipulação pós-colheita do macrófago. PKH-26, tem a vantagem de estavelmente acumulação nos macrófagos alveolares ao longo de períodos prolongados. Esperar 10 dias após a administração permite a limpeza de todas as células marcadas de circulação, deixando apenas alveolar macrófagos estável rotulados com PKH26 ^{8, 9.} PKH26 é um fluorocromo vermelho que tem de excitação (551 nm) e emissão (567 nm) características compatíveiscom os sistemas de detecção de rodamina ou ficoeritrina. Qualquer procedimento rotulagem pode introduzir artefato, incluindo perda de viabilidade. No entanto, uma vez que usamos a mesma abordagem para a rotulagem de macrófagos em diferentes genótipos de mouse (por exemplo, WT vs NADPH oxidase com deficiência), os efeitos desses artefatos seria uniforme.

1. Diluir solução estoque de PKH26 (1 x 10 ^-3 M em etanol) 1:05 em diluente C fornecido pelo fabricante.
2. Carga de 100 ul de PKH26 diluída para uma seringa de 1/2 ml de insulina (29 L x 1/2 ") para cada rato.
3. Administrar aos ratos por injeção iv (ou veia da cauda ou retro orbital) pelo menos 10 dias antes da colheita.

2. Colheita de macrófagos alveolares de Lavagem Broncoalveolar (BAL)

O número de ratos para usar para uma experiência pode variar. Um rendimento típico de um ratinho não estimulado é na gama de 3-5 x 10 ⁵ macrófagos alveolares, no entanto, este número pode variar muito based em fatores como o tamanho do mouse, a experiência da pessoa que realiza a lavagem, eo número de injeções de fluido de lavagem eo volume retirado dos pulmões. Neste protocolo de lavagem pulmonar foi realizada com uma cavidade torácica fechada, que, juntamente com a repetidas lavagens de 1 ml ajuda a aumentar o rendimento das células.

1. Eutanásia rato por administração de uma dose letal de anestésico avertina (12,5 mg) por via intraperitoneal (ip) usando condições assépticas para manter a solução estéril.
2. Spray de rato cuidadosamente com etanol a 70%.
3. Remover a pele a partir da extremidade craniana animal expondo o tórax (Figura 1A).
   1. Faça um pequeno corte na pele logo abaixo do diafragma.
   2. Inserir o dedo dentro do corte e puxe a pele para longe da extremidade craniana do animal (Figura 1A).
   3. Empurre-se ligeiramente sobre a cabeça, estendendo-se o lado ventral do pescoço (Figura 1A).
4. Corte um pequeno buraco através da caixa torácicano lado direito do tórax para esvaziar os pulmões e também permitir a visualização dos pulmões durante as etapas seguintes.
5. Localize a traquéia e dissecar cuidadosamente o tecido circundante.
   1. Retire as glândulas salivares, músculos esterno hioideo e laringe, etc com uma pinça curva.
   2. Retire cuidadosamente com uma pinça curva e cortar com uma tesoura o tecido fino que cobre a traquéia (adventícia) revelando a estrutura da cartilagem rodeado subjacente.
6. Inserção do cateter na traqueia.
   1. Usando pinças curvas, colocar uma sutura de trás (dorsal) da traqueia e puxar uma 10 cm de comprimento através da abertura.
   2. Começando acima da cricóide (o anel engrossado da cartilagem) guiar cuidadosamente um cateter 22 G até a traquéia parar onde a traquéia desaparece por trás do esterno.
   3. Firmemente amarrar sutura em torno de traquéia e cateter para um ajuste confortável. Remova a agulha do cateter.
7. Monte 4-way torneira.
   1. Preencherum 6 ml seringa com DPBS, 1% de FBS e anexar a 4-way torneira, como indicado na Figura 1B.
   2. Anexar um vazio 6 ml de seringa na posição indicada na torneira de 4 vias (Figura 1B).
   3. Anexar porta aberta no 4-way torneira de cateter (Figura 1B). Tenha cuidado para não desalojar cateter de traquéia.
8. Recolha do fluido de lavagem dos pulmões.
   Nota: Os investigadores podem optar por utilizar menores volumes de fluido de lavagem para minimizar a possibilidade de danos para o tecido. É importante que a mesma abordagem pode ser aplicada de forma consistente em todos os grupos de ratos.
   1. Gire a alça da torneira para que a seringa vazia é fechado e injecte lentamente DPBS ~ 1 ml, 1% FBS para inflar os pulmões. Observe a inflação do pulmão através do buraco cortado no passo 2.4.
   2. Tenha cuidado para não overinflate os pulmões.
   3. Gire a alça da torneira para que a seringa cheia está fechado, e retire cuidadosamente a gripe ID a partir dos pulmões.
   4. Observe os pulmões esvaziar através do buraco cortado no passo 1.4. O cateter pode precisar ser movido ligeiramente para trás ou para frente para conseguir um bom empate. Tomar precauções especiais para manter o cateter no interior da traqueia.
   5. Repita os passos 2.8.1-2.8.4 5-6x, até todo o DPBS, 1% de FBS foi injectado e retirado dos pulmões. Nota: recuperação do líquido do pulmão não será 100% do líquido injetado.
9. Seringa vazia com lavado em um tubo cônico de 50 ml. Manter as células à temperatura ambiente.
10. Sedimentar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e deitar fora o sobrenadante. Isto pode ser guardado para análise de citocina, se desejado.
11. Ressuspender as células em 1-5 mL de meio RPMI 1640 com FBS a 10% e contagem num hemocitómetro. No rato não estimuladas,> 95% de células colhidas por BAL são esperados ser os macrófagos, o que pode ser confirmado por citologia.

3. Cultivo e colheita Fungo

"> O Aspergillus fumigatus utilizado neste protocolo expressa GFP ao longo de todas as fases do seu ciclo de vida:. Esporos, germlings e hifas fúngicas Esta estirpe foi fornecido pelo Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canadá.

1. Placa de conídios de uma estirpe de Aspergillus fumigatus expressando GFP em Sabouraud Brain Heart Infusion (BHI) ágar slants com cloranfenicol (0,05 g / L) e gentamicina (0,5 g / L).
2. Incubar no escuro vagamente tampado por 7 a 10 dias em temperatura ambiente.
3. Colheita conídios por inclinação lavagem com 10 ml de 0,01% de Tween 20 em DPBS. Levemente raspar o fungo com a stripette a afrouxar. Lavar a inclinação várias vezes para aumentar o rendimento.
4. Passar a suspensão de conídios por meio de um filtro de células de 100 um em uma cónico de 50 ml.
5. Pellet conídios por centrifugação a 400 xg durante 10 min.
6. Conídios Ressuspender em 50 ml DPBS e contar com um hemocitômetro.
7. Lavar duas vezes com DPBS e diluir a concentração desejadatração.

4. Fúngica Desafio e microscopia confocal

Para investigar o papel dos macrófagos da NADPH-oxidase na defesa do hospedeiro, a capacidade dos macrófagos alveolares isoladas a partir de ratinhos de três genótipos para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitose foi avaliada. Os genótipos utilizados neste estudo incluem; 1) ratinhos de tipo selvagem, 2) NCF1 * / * Mn-ratinhos com uma mutação de ocorrência natural NCF1 (NCF1 codifica para ^phox p47, um componente necessário do fagócito NADPH-oxidase), deixando-os de NADPH-oxidase deficiente, e 3) NCF1 * / * Mn + ratinhos transgénicos (MN indica o transgene abrigando NCF1 tipo selvagem sob o controlo do promotor de CD68 humano), onde a actividade da NADPH-oxidase foi reconstituído na população de monócitos / macrófagos ^{10, 11.}

A microscopia confocal é o mais adequado para este ensaio, devido à presençae crescimento de conídios não fagocitados nas lâminas. O microscópio confocal irá permitir a visualização de planos individuais dentro do eixo Z, e permitir a diferenciação entre o fungo cresce em torno, em vez de no interior de macrófagos. Todas as imagens confocal são adquiridos por meio de uma lente de imersão em óleo 63X. Z-stacks são adquiridos com um fator de zoom eletrônico de 2,5. A espessura de uma pilha de-Z é determinada utilizando DAPI e as imagens de campo brilhante para localizar a parte superior e inferior do campo. Z-stacks variou 14-24 mM com fatias individuais ~ 1 mm de espessura. Para a quantificação dos macrófagos, os exames individuais de zoom eletrônico 1X foram realizados em 10 campos por genótipo. Macrófagos intactas foram identificados com base na PKH26 e coloração DAPI da membrana e do núcleo, respectivamente. Os conídios foram identificados com base na imagem de campo claro expressão e FITC.

1. Prepare lamelas e placas estéreis
   1. Debaixo de uma cabine de segurança biológica, mergulhe 22 x 22 mm lamínulas de vidro em 70% etanol por 5-10 min.
   2. Lavar lamínulas em PBS estéril.
   3. Utilizando fórceps estéreis, colocar suavemente uma única lamela no fundo de cada poço de uma estéril embalado individualmente placa de 6 poços.
2. Semente de ~ 1 x 10 ⁶ colhidas PKH26 marcado macrófagos alveolares em suspensão em 300 ul de RPMI 1640, FBS a 10% para cada lamela. O número exacto pode variar, dependendo do rendimento da colheita.
3. Permitir macrófagos para aderir por incubação a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante a noite.
4. Na manhã seguinte, adicionar 1 x 10 ~ ^{7-expressando} GFP A. fumigatus conidia suspensa em 100 ul de pré-aquecido (37 ° C), meio RPMI 1640, 10% FBS.
5. Retornar placa a 37 ° C incubadora com 5% de CO _2.
6. As células devem ser fixados para um mínimo de 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. No 3, 7, e 14 hr fixar as células por adição de um volume igual de 2% de formaldeído a cada cavidade (concentração final de 1% de formaldeído). Coloque placas para aOs pontos de tempo iniciais, a 4 ° C durante a noite. Para o ponto de tempo final (14 horas), fixar as células à temperatura ambiente durante 2 horas.
7. Após a fixação, remover suavemente lamínulas usando uma pinça e enxaguar em DPBS.
8. Remover o excesso de líquido, colocando a extremidade da lamela em um Kimwipe dobrado.
9. Aplicar 6 mL de fluorescência meio de montagem com DAPI para uma lâmina de vidro.
10. Colocar uma extremidade da lamela sobre a lâmina e cair suavemente com o lado das células para baixo para o meio de montagem. Meio de montagem vai se espalhar e formar uma camada uniforme por baixo da lamela. Não há necessidade de pressionar na lamela.
11. Selar bordas da lamínula com clara unha polonês e deixar secar ao ar.
12. Loja preparados slides de uma caixa corrediça (protegido da luz) à temperatura ambiente até estar pronta para análise por microscopia confocal.

Resultados

A recolha dos macrófagos alveolares pelo LBA de ratinhos não estimulados irá resultar numa população pura de> 95% com base na citologia. A 3 e 7 horas (Figura 2) pontos de tempo preceder a fase de hifas de crescimento fúngico e permitir uma comparação da eficiência fagocítica de conídios entre genótipos. O ponto de tempo de 14 horas é onde genótipos pode ser comparado no que respeita à capacidade para inibir a passagem de conídios fagocitado para a fase de hifas tecido invasiva ...

Discussão

Utilizando esta abordagem de análise ex vivo da actividade antifúngica de macrófagos in vivo juntamente com o desafio de fungos, que anteriormente demonstrou que a NADPH oxidase nos macrófagos desempenha um papel importante na defesa contra A. fumigatus ^4. A utilização de macrófagos alveolares isolados nos permite focar a sua actividade anti-fúngica, na ausência de outras células do sistema imune (por exemplo, recrutamento de neutrófilos) que protegem contra o

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope