Valutare l'attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Riepilogo

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

Abstract

Il polmone è un'interfaccia in cui cellule ospiti sono regolarmente esposti ai microbi e prodotti microbici. Macrofagi alveolari sono i fagociti di prima linea che incontrano i funghi per via inalatoria e altri microbi. Macrofagi e altre cellule immunitarie riconoscono motivi Aspergillus dai recettori di riconoscimento patogeno e avviare risposte infiammatorie a valle. Il ossidasi dei fagociti NADPH genera intermedi reattivi dell'ossigeno (ROI) ed è fondamentale per la difesa ospite. Anche se NADPH ossidasi è fondamentale per neutrofilo-mediato difesa ospite ^1-3, l'importanza della NADPH ossidasi nei macrofagi non è ben definito. L'obiettivo di questo studio è stato quello di delineare il ruolo specifico della NADPH ossidasi nei macrofagi nel mediare difesa dell'ospite contro A. fumigatus. Abbiamo trovato che NADPH ossidasi in macrofagi alveolari controlla la crescita di fagocitato A. fumigatus spore ^4. Qui, descriviamo un metodo per valutare la capacità di un topomacrofagi lveolar (AMS) per controllare la crescita delle spore di Aspergillus fagocitati (conidi). Macrofagi alveolari sono macchiati in vivo e dieci giorni più tardi isolati da topi da lavaggio broncoalveolare (BAL). I macrofagi sono placcati su vetrini, poi seminate con la proteina fluorescente verde (GFP) che esprimono A. spore fumigatus. A volte specificato, le cellule vengono fissate e il numero di macrofagi intatte con spore fagocitati è valutata mediante microscopia confocale.

Introduzione

Macrofagi alveolari sono i fagociti di prima linea che incontrano i microbi inalati. I macrofagi riconoscono motivi Aspergillus dai recettori di riconoscimento patogeni, ingerire e limitano la crescita delle spore per via inalatoria (conidi), e avviare le risposte infiammatorie. Il ossidasi dei fagociti NADPH converte l'ossigeno molecolare per anione superossido e valle intermedi reattivi dell'ossigeno (ROI). Malattia granulomatosa cronica (CGD) è una malattia ereditaria della NADPH ossidasi caratterizzata da infezioni batteriche e fungine gravi e le risposte infiammatorie eccessive.

Anche se NADPH ossidasi è fondamentale per neutrofilo-mediato difesa ospite ^1-3, l'importanza della NADPH ossidasi nei macrofagi non è ben definito. Precedenti studi hanno dimostrato che i macrofagi alveolari ingerire ed uccidere le spore di Aspergillus, considerando che i neutrofili principalmente di mira il palco ife ^5. Tuttavia, ci sono stati Resul contrastantits come il ruolo della NADPH ossidasi in macrofagi nel controllare la crescita di A. fumigatus spore ^{6, 7.}

L'obiettivo di questo metodo è stato quello di delineare il ruolo specifico della NADPH ossidasi nei macrofagi nel mediare difesa dell'ospite contro A. spore fumigatus. Abbiamo trovato che NADPH ossidasi in macrofagi alveolari controlla la crescita di fagocitato A. fumigatus spore ^4. Per modellare più strettamente la risposta dell'ospite ai funghi per via inalatoria, abbiamo usato macrofagi alveolari raccolte da lavaggio broncoalveolare da topi non stimolati subito dopo il sacrificio. L'uso di isolati macrofagi alveolari ci ha consentito di concentrarsi sulla loro attività antifungina in assenza di altre cellule immunitarie (ad esempio, neutrofili reclutati) che difendersi Aspergillus in vivo. In questo metodo, macrofagi alveolari sono state colorate in vivo prima della raccolta in modo da minimizzare la quantità di manipolazione post-raccolta.

Un altro vantaggio di questo protocollo è l'uso di un GFP che esprimono A. ceppo fumigatus. Questo fungo esprime GFP dalla fase conidi attraverso la fase di ife e non ha bisogno di ulteriori colorazione. Per ottenere immagini con maggiore dettaglio, abbiamo scelto microscopia confocale che permette la ricostruzione di strutture tridimensionali delle immagini ottenute. Ricostruzione tridimensionale dà la capacità di distinguere tra ife crescono intorno piuttosto che in o attraverso un macrofago. Conidi può anche essere precisamente distinto come intracellulare contro extracellulare.

Protocollo

Tutte le procedure eseguite su animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato cura degli animali ed uso al Roswell Park Cancer Institute e rispettate tutte le statali, federali e istituti nazionali di regolamentazione di salute.

1. In vivo macrofagi Labeling

Nota: PHK26 è un colorante lipofilo che sarà ripreso da fagociti sia in circolazione e nei tessuti quando somministrato per via endovenosa (iv). PKH26 è stato utilizzato per l'etichettatura in vivo per minimizzare la quantità di manipolazione post-raccolta del macrofago. PKH-26 ha il vantaggio di accumulare stabilmente nei macrofagi alveolari per periodi prolungati. Attendere 10 giorni dopo la somministrazione permette per la liquidazione di tutte le cellule marcate dalla circolazione lasciando solo alveolare macrofagi stabile etichettati con PKH26 ^{8, 9.} PKH26 è un fluorocromo rosso che ha eccitazione (551 nm) ed emissioni (567 nm) caratteristiche compatibilicon i sistemi di rodamina o di rilevazione ficoeritrina. Qualsiasi procedura di etichettatura può introdurre artefatti, inclusa la perdita di vitalità. Tuttavia, dato che utilizziamo lo stesso approccio per l'etichettatura dei macrofagi in diversi genotipi del mouse (ad esempio, WT vs NADPH ossidasi-carenti), gli effetti di questi manufatti sarebbero uniforme.

1. Diluire soluzione madre di PKH26 (1 x 10 ^-3 M in etanolo) 1:5 in diluente C fornito dal produttore.
2. Carico: 100 ml di diluito PKH26 in una siringa da 1/2 ml insulina (29 G x 1/2 ") per ogni mouse.
3. Somministrare a topi mediante iniezione ev (sia vena della coda o retro orbitale) almeno 10 giorni prima del raccolto.

2. Raccolta alveolari macrofagi di lavaggio broncoalveolare (BAL)

Il numero di topi da utilizzare per un esperimento può variare. Una resa tipica di un mouse non stimolato è nell'intervallo di 3-5 x 10 ⁵ macrofagi alveolari, ma questo numero può variare notevolmente basEd da fattori quali la dimensione del mouse, esperienza della persona che effettua il lavaggio, e il numero di instillazioni di liquido di lavaggio e il volume prelevato dai polmoni. In questo protocollo lavaggio polmonare viene eseguita con una cavità toracica chiuso con ripetuti lavaggi 1 ml contribuisce ad aumentare la quantità di cellule.

1. Euthanize topo somministrando una dose letale di anestetico avertin (12,5 mg) per via intraperitoneale (ip) utilizzando condizioni asettiche per conservare la soluzione sterile.
2. Spray topo accuratamente con etanolo al 70%.
3. Rimuovere pelle dall'estremità craniale animale esporre il torace (Figura 1A).
   1. Fare un piccolo taglio nella pelle appena sotto il diaframma.
   2. Inserire dito nel taglio e tirare pelle dall'estremità craniale dell'animale (Figura 1A).
   3. Premere leggermente sulla testa, estendendo la parte ventrale del collo (Figura 1A).
4. Tagliare un piccolo foro attraverso la gabbia toracicanel lato destro del torace per sgonfiare i polmoni e anche permettere la visualizzazione dei polmoni durante le seguenti fasi.
5. Individuare la trachea, e con attenzione sezionare il tessuto circostante.
   1. Rimuovere le ghiandole salivari, muscoli sterno-ioideo e laringe, ecc con pinze curve.
   2. Sollevare delicatamente con una pinza curve e tagliare con le forbici il tessuto sottile che copre la trachea (avventizia) rivelando la struttura cartilaginea anelli sottostante.
6. Inserire il catetere nella trachea.
   1. Utilizzando pinze curve, posizionare una sutura dietro (dorsale a) la trachea e tirare una lunghezza 10 cm attraverso l'apertura.
   2. Avvio sopra la cricoide (l'anello ispessito della cartilagine) guida con attenzione un catetere G 22 lungo la trachea fermandosi dove la trachea scompare dietro lo sterno.
   3. Fermamente legare sutura intorno trachea e il catetere per una perfetta aderenza. Rimuovere l'ago dal catetere.
7. Montare a 4 vie rubinetto.
   1. Riempireuno 6 ml siringa con DPBS, 1% FBS e attribuiscono al 4-way rubinetto come indicato nella figura 1B.
   2. Collegare un vuoto 6 ml siringa nella posizione indicata sul 4-way rubinetto (Figura 1B).
   3. Collegare la porta aperta sul 4-way rubinetto per catetere (Figura 1B). Fare attenzione a non rimuovere il catetere dalla trachea.
8. Raccogliere liquido di lavaggio dai polmoni.
   Nota: Gli investigatori possono scegliere di utilizzare minori volumi di liquido di lavaggio per ridurre al minimo la possibilità di danni al tessuto. È importante che lo stesso approccio venga applicato coerentemente in tutti i gruppi di topo.
   1. Girare la maniglia sul rubinetto in modo che la siringa vuota è chiuso e iniettare lentamente ~ 1 ml DPBS, 1% FBS per gonfiare i polmoni. Osservare l'inflazione polmone attraverso il taglio foro nella fase 2.4.
   2. Fare attenzione a NON gonfiare eccessivamente i polmoni.
   3. Girare la maniglia del rubinetto in modo che l'intero siringa è chiuso, e prelevare con cautela l'influenza id dai polmoni.
   4. Osservare i polmoni si sgonfiano attraverso il foro praticato nel punto 1.4. Il catetere può essere necessario spostare leggermente in avanti o indietro per ottenere un buon pareggio. Prendere precauzioni speciali per mantenere il catetere all'interno della trachea.
   5. Ripetere i punti 2.8.1-2.8.4 5-6x finché tutto il DPBS, 1% FBS è stata immessa e prelevata dai polmoni. Nota: il recupero del fluido polmonare non sarà 100% del fluido iniettato.
9. Siringa vuota con il liquido di lavaggio in una provetta da 50 ml. Mantenere le cellule a temperatura ambiente.
10. Agglomerare cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e versare il surnatante. Questo può essere salvata per l'analisi di citochine, se lo desideri.
11. Risospendere le cellule in 1-5 ml di RPMI 1640 con 10% di FBS e contare su un emocitometro. Nel topo non stimolato,> 95% di cellule raccolte da BAL sono ritenute macrofagi, che può essere confermata mediante citologia.

3. Coltura e raccolta funghi

"> L'Aspergillus fumigatus utilizzato in questo protocollo esprime GFP in tutte le fasi del suo ciclo di vita. Spore, germlings e ife di questo ceppo fungino sono state fornite dal Dott. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada.

1. Piatto conidi di un ceppo di Aspergillus fumigatus esprimere GFP su Sabouraud cuore cervello infusione (BHI) slant agar con cloramfenicolo (0,05 g / L) e Gentamicina (0,5 g / L).
2. Incubare al buio liberamente ricoperto per 7-10 giorni a temperatura ambiente.
3. Harvest conidi mediante lavaggio slant con 10 ml di 0,01% di Tween 20 in DPBS. Leggermente raschiare il fungo con il stripette per allentare. Sciacquare l'inclinazione più volte per aumentare il rendimento.
4. Passare sospensione conidi attraverso un colino cella 100 micron in una conica da 50 ml.
5. Pellet conidi per centrifugazione a 400 xg per 10 min.
6. Risospendere conidi in 50 ml DPBS e contare con un emocitometro.
7. Lavare due volte con DPBS e diluire a concentrazione desideratistrazione.

4. Fungina Challenge e Microscopia confocale

Per studiare il ruolo dei macrofagi NADPH ossidasi in difesa ospite, la capacità dei macrofagi alveolari isolati da topi di tre genotipi per controllare la crescita delle spore di Aspergillus fagocitati è stata valutata. I genotipi utilizzati in questo studio includono; 1) topi wild-type, 2) Ncf1 * / * Mn-topi con una mutazione naturale Ncf1 (Ncf1 codifica per p47 ^phox, una componente necessaria del fagociti ossidasi NADPH) lasciando loro NADPH ossidasi carente, e 3) Ncf1 * / * Mn + topi transgenici (MN denota il transgene ospitare tipo selvatico Ncf1 sotto il controllo del promotore di CD68 umano) dove l'attività NADPH ossidasi è stato ricostituito nella popolazione di monociti / macrofagi ^{10, 11.}

Microscopia confocale È più adatto per questo test per la presenzae la crescita di conidi non fagocitato sugli scivoli. Il microscopio confocale permetterà la visualizzazione di piani individuali all'interno l'asse Z, e consentire la differenziazione tra fungo cresce intorno piuttosto che all'interno dei macrofagi. Tutte le immagini confocale vengono acquisite con un obiettivo a immersione in olio 63X. Z-stack sono acquisiti con un fattore di zoom elettronico di 2.5. Lo spessore di un Z-stack è determinato utilizzando DAPI e immagini in campo chiaro per individuare la parte superiore e inferiore del campo. Z-stack variava da 14 a 24 micron, con singole sezioni ~ 1 micron di spessore. Per la quantificazione dei macrofagi, singole scansioni di zoom elettronico 1X sono stati eseguiti su 10 campi per genotipo. Macrofagi intatti sono stati identificati sulla base PKH26 e colorazione DAPI della membrana e nucleo rispettivamente. Conidi sono stati identificati in base all'immagine campo chiaro espressione FITC e.

1. Preparare vetrini sterili e piastre
   1. Sotto una cappa di sicurezza biologica, immergere 22 x 22 mm coprioggetto di vetro nel 70% ethanol per 5-10 min.
   2. Sciacquare coprioggetto in PBS sterile.
   3. Utilizzando pinze sterili, posizionare delicatamente un singolo vetrino sul fondo di ciascun pozzetto di una singolarmente confezionati 6-pozzetti sterile.
2. Seed ~ 1 x 10 ⁶ raccolto PKH26 etichettato macrofagi alveolari sospesi in 300 ml RPMI 1640, 10% FBS su ogni vetrino. Il numero esatto può variare a seconda del rendimento del raccolto.
3. Lasciare macrofagi di aderire incubando a 37 ° C con 5% di CO ₂ durante la notte.
4. La mattina seguente, aggiungere ~ 1 x 10 ^7-GFP che esprimono A. fumigatus conidi sospeso in 100 ml di pre-riscaldato (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
5. Piastra Rientro a 37 ° C incubatore con il 5% di CO _2.
6. Le cellule devono essere fissati per un minimo di 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. A 3, 7, e 14 hr cellule fix aggiungendo un volume uguale di 2% di formaldeide in ogni pozzetto (concentrazione finale 1% di formaldeide). Piastre posto per l'punti temporali presto a 4 ° C durante la notte. Per il punto finale di tempo (14 ore), fissare le cellule a temperatura ambiente per 2 ore.
7. Dopo la fissazione, rimuovere delicatamente coprioggetto con pinze e sciacquare in DPBS.
8. Rimuovere il liquido in eccesso ponendo il bordo del vetrino su un Kimwipe piegato.
9. Applicare 6 mezzo di montaggio microlitri fluorescenza con DAPI ad un vetrino da microscopio in vetro.
10. Posare un bordo del vetrino sul vetrino e rilasciare delicatamente con lato della cella giù nel mezzo di montaggio. Mezzo di montaggio si diffonderà e formare uno strato anche sotto il vetrino. Non c'è bisogno di premere sul vetrino.
11. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente e lasciare asciugare all'aria.
12. Conservare preparati vetrini in una scatola slitta (protetto dalla luce) a temperatura ambiente fino al momento di analizzare mediante microscopia confocale.

Risultati

Raccolta dei macrofagi alveolari da BAL da topi non stimolati si tradurrà in una popolazione pura> 95% in base citologia. Il 3 e 7 ore (Figura 2) punti temporali precedono la fase di ife di crescita fungina e consentono un confronto di efficienza fagocitaria dei conidi tra i genotipi. Il punto di tempo 14 hr è dove genotipi possono essere confrontati per quanto riguarda la capacità di inibire il passaggio di conidi fagocitato alla fase hyphal tessuto invasivo (Figura 3). Mac...

Discussione

Usando questo approccio ex vivo per analisi dell'attività antifungina di macrofagi insieme in vivo sfida fungina, abbiamo precedentemente dimostrato che NADPH ossidasi in macrofagi svolge un ruolo importante nella difesa contro A. fumigatus ^4. L'uso di isolati macrofagi alveolari ci permette di concentrarsi sulla loro attività antifungina in assenza di altre cellule immunitarie (ad esempio, neutrofili reclutati) che difendersi Aspergillus in vivo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope