La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

Resumen

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

Resumen

El pulmón es una interfaz donde células huésped están expuestos rutinariamente a los microbios y productos microbianos. Los macrófagos alveolares son las células fagocíticas de primera línea que se encuentran los hongos y otros microbios inhalados. Los macrófagos y otras células inmunes reconocen motivos de Aspergillus por receptores de reconocimiento de patógenos e iniciar respuestas inflamatorias aguas abajo. La oxidasa NADPH fagocítica genera intermediarios reactivos del oxígeno (ROI) y es fundamental para la defensa del huésped. Aunque la NADPH oxidasa es crítico para la defensa del huésped mediada por neutrófilos ^{1 - 3,} la importancia de la NADPH oxidasa en macrófagos no está bien definido. El objetivo de este estudio fue definir el papel específico de la NADPH oxidasa en macrófagos en la mediación de la defensa del huésped contra A. fumigatus. Se encontró que la NADPH oxidasa en macrófagos alveolares controla el crecimiento de fagocitado A. fumigatus esporas ^4. Aquí se describe un método para evaluar la capacidad de un ratónmacrófagos lveolar (AMS) para controlar el crecimiento de las esporas de Aspergillus fagocitados (conidios). Los macrófagos alveolares se tiñeron in vivo y diez días después aisladas de ratones por lavado broncoalveolar (BAL). Los macrófagos se cultivaron sobre cubreobjetos de vidrio, y luego sembraron con la proteína verde fluorescente (GFP) que expresan A. esporas fumigatus. En momentos determinados, las células se fijan y el número de macrófagos intactas con esporas fagocitados se evaluaron por microscopía confocal.

Introducción

Los macrófagos alveolares son las células fagocíticas de primera línea que se encuentran con microbios inhalados. Los macrófagos reconocen motivos Aspergillus por los receptores de reconocimiento de patógenos, ingieren y limitan el crecimiento de las esporas inhaladas (conidios), e inician la respuesta inflamatoria. La NADPH oxidasa de los fagocitos convierte oxígeno molecular para el anión superóxido y intermediarios reactivos del oxígeno aguas abajo (Rois). La enfermedad granulomatosa crónica (CGD) es un trastorno hereditario de la NADPH oxidasa se caracteriza por infecciones bacterianas y fúngicas graves y por las respuestas inflamatorias excesivas.

Aunque la NADPH oxidasa es crítico para la defensa del huésped mediada por neutrófilos ^{1 - 3,} la importancia de la NADPH oxidasa en macrófagos no está bien definido. Estudios anteriores han demostrado que los macrófagos alveolares ingerir y destruir las esporas de Aspergillus, mientras que los neutrófilos se dirigen principalmente a la etapa de las hifas ^5. Sin embargo, ha habido Resul en conflictoTS como para el papel de la NADPH oxidasa en macrófagos en el control del crecimiento de A. fumigatus esporas ^{6, 7.}

El objetivo de este método era para delinear el papel específico de la NADPH oxidasa en los macrófagos en la mediación de la defensa del huésped frente a A. esporas fumigatus. Se encontró que la NADPH oxidasa en macrófagos alveolares controla el crecimiento de fagocitado A. fumigatus esporas ^4. Para modelar más de cerca la respuesta del huésped a los hongos inhalados, utilizamos los macrófagos alveolares cosechadas por lavado broncoalveolar de los ratones estimulados inmediatamente después del sacrificio. El uso de los macrófagos alveolares aislados nos ha permitido centrarse en su actividad antifúngica en ausencia de otras células del sistema inmune (por ejemplo, neutrófilos reclutados) que defienden contra Aspergillus in vivo. En este método, los macrófagos alveolares se tiñeron in vivo antes de la cosecha a fin de minimizar la cantidad de manipulación posterior a la cosecha.

Otra ventaja de este protocolo es el uso de un GFP-expresando A. cepa fumigatus. Este hongo expresa GFP desde la etapa de conidios por la etapa de hifas y no tiene necesidad de una mayor tinción. Para obtener imágenes con mayor detalle, se optó por la microscopía confocal, que permite la reconstrucción de las estructuras tridimensionales a partir de las imágenes obtenidas. Reconstrucción tridimensional da la capacidad de diferenciar entre las hifas en crecimiento alrededor en lugar de en o a través de un macrófago. Las conidias también puede ser precisamente distingue como intracelular frente extracelular.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo en el Instituto del Cáncer Roswell Park y cumplan con todo el estado, federal, y los Institutos Nacionales de la normativa de salud.

1. In vivo de macrófagos Etiquetado

Nota: PHK26 es un colorante lipófilo que se tomará por las células fagocíticas, tanto en la circulación y en los tejidos cuando se administra por vía intravenosa (iv). PKH26 se utilizó para el etiquetado in vivo para minimizar la cantidad de manipulación posterior a la cosecha de los macrófagos. PKH-26 tiene la ventaja de acumular de manera estable en los macrófagos alveolares durante periodos prolongados. Esperar 10 días después de la administración permite la limpieza de todas las células de la etiqueta de la circulación dejando sólo macrófagos alveolares de forma estable marcada con PKH26 ^{8, 9.} PKH26 es un fluorocromo rojo que tiene de excitación (551 nm) y emisión (567 nm) características compatiblescon los sistemas de detección de rodamina o ficoeritrina. Cualquier procedimiento de etiquetado puede introducir artefactos, incluyendo la pérdida de viabilidad. Sin embargo, puesto que utilizamos el mismo enfoque para el etiquetado de los macrófagos en diferentes genotipos de ratón (por ejemplo, WT frente a la NADPH-oxidasa deficiente), los efectos de estos artefactos serían uniforme.

1. Diluir la solución madre de PKH26 (1 x 10 ^-3 M en etanol) 1:05 en diluyente C proporcionada por el fabricante.
2. De carga 100 l de PKH26 diluida en una jeringa de 1/2 ml de insulina (29 g x 1/2 ") para cada ratón.
3. Administrar a los ratones por inyección iv (vena de la cola o bien retro-orbital) al menos 10 días antes de la cosecha.

2. Recolección de los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar (BAL)

El número de ratones a utilizar para un experimento puede variar. Un rendimiento típico de un ratón no estimulada está en el intervalo de 3-5 x 10 ⁵ macrófagos alveolares, sin embargo este número puede variar en gran medida based de factores tales como el tamaño del ratón, la experiencia de la persona que realiza el lavado, y el número de instilaciones de líquido de lavado y el volumen retirado de los pulmones. En este protocolo de lavado pulmonar se realiza con una cavidad torácica cerrada que junto con repetidos lavados de 1 ml ayuda a aumentar el rendimiento de células.

1. La eutanasia del ratón mediante la administración de una dosis letal de anestésico Avertin (12,5 mg) por vía intraperitoneal (IP) usando condiciones asépticas para mantener la solución estéril.
2. Pulverizar ratón a fondo con etanol al 70%.
3. Retire la piel desde el extremo craneal de animales exponiendo el tórax (Figura 1A).
   1. Hacer un pequeño corte en la piel justo debajo del diafragma.
   2. Inserte el dedo en el corte y tire de la piel lejos del extremo craneal del animal (Figura 1A).
   3. Empuje ligeramente hacia arriba en la cabeza, que se extiende la parte ventral del cuello (fig. 1A).
4. Corte un pequeño agujero a través de la caja torácicaen el lado derecho del tórax para desinflar los pulmones y también permitir la visualización de los pulmones durante los siguientes pasos.
5. Busque la tráquea, y cuidadosamente diseccionar el tejido circundante.
   1. Retire las glándulas salivales, los músculos esternohioideo y laringe, etc con pinzas curvas.
   2. Levante con cuidado con unas pinzas curvas y cortar con tijeras el tejido delgado que cubre la tráquea (adventicia) que revela la estructura del cartílago anillado subyacente.
6. Inserte catéter en la tráquea.
   1. Con unas pinzas curvas, colocar una sutura detrás (dorsal a) la tráquea y tirar de una longitud de 10 cm a través de la abertura.
   2. Comenzando por encima del cricoides (el anillo engrosado del cartílago) guiar cuidadosamente el catéter 22 G por la tráquea parando donde la tráquea se desaparece detrás del esternón.
   3. Firmemente atar sutura alrededor de la tráquea y el catéter para un ajuste perfecto. Retire la aguja del catéter.
7. Ensamble de 4 vías llave de paso.
   1. Llenaruno 6 ml de jeringa con DPBS, 1% de FBS y se unen a 4 vías llave de paso tal como se indica en la Figura 1B.
   2. Adjuntar un vacío 6 ml jeringa en la posición indicada en la 4 vías llave de paso (Figura 1B).
   3. Conecte el puerto abierto en el 4 vías llave de paso para catéter (Figura 1B). Tenga cuidado de no desconectar el catéter de la tráquea.
8. Recoger el líquido del lavado de los pulmones.
   Nota: Los investigadores pueden optar por usar menores volúmenes de líquido de lavado para reducir al mínimo la posibilidad de daños en el tejido. Es importante que el mismo enfoque puede aplicarse de manera coherente en todos los grupos de ratones.
   1. Gire la manija de la llave de paso por lo que la jeringa vacía se cierra y se inyecte lentamente ~ 1 ml de DPBS, 1% de SFB para inflar los pulmones. Observar la inflación de pulmón a través del agujero en el paso 2.4.
   2. Tenga cuidado de no inflar demasiado los pulmones.
   3. Gire la manija de la llave de paso para que la jeringa llena se cierra, y retirar con cuidado la gripe Identificación de los pulmones.
   4. Observar los pulmones se desinflan a través del agujero cortado en el paso 1.4. El catéter puede necesitar ser movido ligeramente hacia atrás o hacia delante para conseguir un buen sorteo. Tomar la precaución especial para mantener el catéter dentro de la tráquea.
   5. Repetir los pasos 2.8.1-2.8.4 5-6x hasta que todo el DPBS, 1% de FBS ha sido inyectado y retirado de los pulmones. Nota: la recuperación del líquido pulmonar no será del 100% del fluido inyectado.
9. Vaciar la jeringa con el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 ml. Mantener las células a temperatura ambiente.
10. Precipitar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y se vierte el sobrenadante. Esto puede ser guardado para el análisis de citoquinas si se desea.
11. Resuspender las células en 1-5 ml de RPMI 1640 con 10% de FBS y contar en un hemocitómetro. En el ratón sin estimular,> 95% de las células recogidas por BAL se espera que sean los macrófagos, que pueden ser confirmados mediante citología.

3. El cultivo y cosecha Hongo

"> El Aspergillus fumigatus utilizada en este protocolo expresa GFP en todas las etapas de su ciclo de vida:. Esporas, hifas y esporofitos Esta cepa fúngica fue proporcionada por el Dr. Margo Moore, de la Universidad Simon Fraser, Burnaby, BC, Canadá.

1. Placa de conidios de una cepa de Aspergillus fumigatus que expresan GFP en Sabouraud infusión de cerebro corazón (BHI) agar tubos inclinados con cloranfenicol (0,05 g / L) y gentamicina (0,5 g / L).
2. Incubar en la oscuridad taparon sin apretar durante 7 a 10 días a temperatura ambiente.
3. Cosecha conidios por inclinación lavado con 10 ml de 0,01% de Tween 20 en DPBS. Ligeramente raspar el hongo con el STRIPETTE para aflojar. Enjuague la inclinación varias veces para aumentar el rendimiento.
4. Pase suspensión de conidios a través de un filtro de células de 100 micras en una cónica 50 ml.
5. Pellet conidios por centrifugación a 400 xg durante 10 min.
6. Conidios Resuspender en 50 ml de DPBS y contar utilizando un hemocitómetro.
7. Lavar dos veces con DPBS y diluir a concentraciones deseadastración.

4. Fungal Challenge y microscopía confocal

Para investigar el papel de la NADPH oxidasa de los macrófagos en la defensa del huésped, se evaluó la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratones de tres genotipos para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados. Los genotipos utilizados en este estudio incluyen; 1) ratones de tipo salvaje, 2) NCF1 * / * Mn-ratones con una mutación NCF1 de origen natural (NCF1 codifica para p47 ^phox, un componente necesario de la NADPH oxidasa de los fagocitos) dejándolos deficiente de NADPH oxidasa, y 3) NCF1 * / * Mn + ratones transgénicos (MN indica la transgén albergar NCF1 de tipo salvaje bajo el control del promotor de CD68 humano), donde la actividad de la NADPH oxidasa se ​​ha reconstituido en la población de monocitos / macrófagos ^{10, 11.}

La microscopía confocal es el más adecuado para este ensayo debido a la presenciay el crecimiento de los conidios no fagocitado en las diapositivas. El microscopio confocal permitirá la visualización de los planos individuales dentro del eje Z, y permitir la diferenciación entre hongo que crece alrededor en lugar de en el interior de los macrófagos. Todas las imágenes de confocal se adquieren utilizando una lente de inmersión en aceite de 63X. Z-pilas se adquieren con un factor de zoom electrónico de 2,5. El espesor de una pila Z se determina utilizando DAPI y las imágenes de campo claro para localizar la parte superior y la parte inferior del campo. Z-pilas variaron de 14 a 24 micras con rodajas individuales ~ 1 m de espesor. Para la cuantificación de los macrófagos, las exploraciones individuales de zoom electrónico 1X se realizaron en 10 campos por genotipo. Se identificaron macrófagos intacta en virtud de PKH26 y tinción DAPI de la membrana y el núcleo, respectivamente. Los conidios fueron identificados sobre la base de la expresión FITC y la imagen de campo brillante.

1. Preparar cubreobjetos y placas estériles
   1. En virtud de una cabina de seguridad biológica, remoje 22 x 22 mm cubreobjetos de vidrio en el 70% etanol durante 5-10 min.
   2. Enjuague cubreobjetos en PBS estéril.
   3. Usando una pinza estéril, coloque suavemente un único portaobjetos en la parte inferior de cada pocillo de una placa de 6 pocillos estériles envasados ​​individualmente.
2. Semilla ~ 1 x 10 ⁶ cosechado PKH26 etiquetado macrófagos alveolares en suspensión en 300 l de RPMI 1640, 10% de FBS a cada cubreobjetos. El número exacto puede variar dependiendo del rendimiento de la cosecha.
3. Permitir que los macrófagos se adhiera mediante la incubación a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante la noche.
4. A la mañana siguiente, añadir aproximadamente 1 x 10 ⁷ GFP-expresando A. fumigatus conidias suspendió en 100 l pre-calentado (37 ° C) de RPMI 1640, 10% de FBS.
5. Placa de Regreso a 37 ° C incubadora con 5% de CO _2.
6. Las células deben ser fijados por un mínimo de 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. A los 3, 7, y 14 hr células de arreglo mediante la adición de un volumen igual de 2% de formaldehído a cada pocillo (concentración final 1% de formaldehído). Coloque las placas para elmomentos de la hora temprana a 4 ° C durante la noche. Para el punto de tiempo final (14 horas), fijar las células a temperatura ambiente durante 2 horas.
7. Después de la fijación, retire suavemente cubreobjetos con unas pinzas y enjuague en DPBS.
8. Eliminar el exceso de líquido colocando el borde del cubreobjetos sobre un Kimwipe doblado.
9. Aplicar medio de montaje 6 l de fluorescencia con DAPI a un portaobjetos de microscopio de vidrio.
10. Coloque un borde del cubreobjetos sobre el portaobjetos y colocar suavemente con las células hacia abajo en el medio de montaje. Medio de montaje se extienda y formar una capa uniforme debajo del cubreobjetos. No hay necesidad de presionar sobre el cubreobjetos.
11. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y dejar secar al aire.
12. Tienda prepara diapositivas en una caja de diapositivas (protegido de la luz) a temperatura ambiente hasta que se vaya a analizar por microscopía confocal.

Resultados

Recogida de los macrófagos alveolares por BAL de ratones no estimulados se traducirá en una población> 95% de pureza basado en citología. El 3 y 7 horas (Figura 2) puntos de tiempo preceden a la etapa de hifas de crecimiento de hongos y permiten una comparación de la eficiencia fagocítica de los conidios entre los genotipos. El punto de tiempo de 14 horas es donde genotipos se pueden comparar con respecto a la capacidad para inhibir la transición de conidios fagocitado a la etapa de hifa...

Discusión

El uso de este enfoque para el análisis ex vivo de la actividad antifúngica de los macrófagos junto con in vivo de exposición fúngica, Hemos demostrado anteriormente que la NADPH oxidasa en macrófagos desempeña un papel importante en la defensa contra A. fumigatus ^4. El uso de los macrófagos alveolares aislados nos permite centrarse en su actividad antifúngica en ausencia de otras células inmunes (por ejemplo, los neutrófilos reclutados) que defienden contra ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope