تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

جزء كبير من التنمية في مرحلة ما بعد الجنينية في ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يحدث ضمن مجموعة من الهياكل التي تشبه الكيس تسمى أقراص تخيلي. هذه الأقراص تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها داخل ذبابة الكبار. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم الأمثل لاستعادة هذه الأقراص وإعدادهم للتحليل مع الأجسام المضادة للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين. هو الانسب هذا الإجراء لأنسجة رقيقة مثل أقراص تخيلي، ولكن يمكن تعديلها بسهولة للاستخدام مع الأنسجة سمكا مثل اليرقات الدماغ والكبار المبيض. سوف بروتوكول مكتوبة والفيديو المصاحبة توجيه القارئ / المشاهد من خلال تشريح يرقات الطور الثالث، تثبيت الأنسجة، والعلاج من أقراص تخيلي مع الأجسام المضادة. بروتوكول يمكن استخدامها لتشريح أقراص تخيلي من الأصغر سنا يرقات الطور الأول والثاني كذلك. وميزة هذا البروتوكول هو أنه قصير نسبيا ولها أن تكونأون الأمثل للحفاظ جودة عالية من الأنسجة تشريح. ميزة أخرى هي أن الإجراء التثبيت أن يعمل يعمل بشكل جيد مع العدد الهائل من الأجسام المضادة التي تعترف البروتينات ذبابة الفاكهة. في تجربتنا، وهناك عدد قليل جدا من الأجسام المضادة الحساسة التي لا تعمل بشكل جيد مع هذا الإجراء. في هذه الحالات، فإن العلاج يبدو أن لاستخدام كوكتيل تثبيت البديل مع الاستمرار في اتباع المبادئ التوجيهية التي وضعناها عليها للخطوات تشريح وحضانات الأجسام المضادة.

Introduction

لأكثر من قرن من الزمان ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، فقد كان نظام رئيس الوزراء لدراسة تطوير والسلوك وعلم وظائف الأعضاء. ويمكن تقسيم تطور في الطيران إلى مرحلتين رئيسيتين: الجنينية وبعد الجنينية مع الكثير من أخذ مكان الأخير ضمن أحادي الطبقة الظهارة تسمى أقراص تخيلي ^1-3. ونشرت رسومات من أقراص تخيلي لأول مرة في عام 1864 بحلول أغسطس ايزمان كجزء من له دراسة واسعة النطاق على التنمية الحشرات ^1. هذه الأقراص تبدأ تنميتها خلال مرحلة التطور الجنيني، ونمط خلال مراحل اليرقات، البقاء على قيد الحياة تحلل النسج الهائل من المراحل المبكرة العذراء، وفي نهاية المطاف تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها ضمن الكبار يطير ^1-14. خلال نمو اليرقات كل أسطوانة يجعل عدة قرارات حاسمة بشأن مصير والشكل والحجم. ضمن الأعمار اليرقية الأولى والثانية، وكلف الأقراص مع اعتماد مصير الابتدائي، تأسيس العهدهينج حدود المقصورة، واعتماد الشكل الصحيح وتوليد العدد المطلوب من الخلايا ^15-16. خلال الطور اليرقي الثالث وأوائل مرحلة ما قبل العذراء، ما زالت أقراص تخيلي لتقسيم ومنقوشة كما تعتمد خلايا مصائرهم الطرفية ^16.

خلال التاريخ المبكر للذبابة الفاكهة البيولوجيا التطورية، وتمت دراسة أقراص تخيلي تقريبا حصرا في سياق التطور الطبيعي وفي حالات محدودة حيث كانت الخسارة أو الربح من وظيفة متحولة قابلة للحياة. استخدام الأشعة السينية للحث على إعادة التركيب الإنقسامية يسمح للطفرات مميتة ليتم تحليلها في استنساخ خلايا داخل أنسجة اليرقات والكبار. تم تحسين هذه الطريقة من خلال إدخال الأساليب المعدلة وراثيا لتحليل الخسارة وكسب-وظيفة الطفرات في كل أنسجة اليرقات والكبار. عدد الأجسام المضادة، للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين لوصف المشهد الجزيئي من النوع البري والأنسجة متحولة هو أيضا CONSTتزايد antly. جعلت استخدام هذه الواسمات الجزيئية لتحليل الخسارة وكسب-وظيفة استنساخ خلية متحولة من الممكن على نحو متزايد لاكتساب فهم في الوقت الحقيقي كيف تنحرف خلايا متحولة من أبناء عمومة النوع البري من خلال التنمية. لاتخاذ صحيح الاستفادة من هذه الأدوات والكواشف فمن الأهمية بمكان أن يكون الإعداد عالية الجودة من أقراص تخيلي التي يمكن مشاهدتها وتصويرها وتحليلها. الهدف من هذا المخطوط هو توفير بروتوكول الأمثل لعزل وإعداد مجمع القرص العين antennal (الشكل 1A). فإنه يمكن أيضا أن تستخدم بنجاح لعزل طائفة واسعة من أقراص إضافية بما في ذلك تلك التي تؤدي إلى الأجنحة، halteres والساقين T1-T3 والأعضاء التناسلية (الشكل 1B-E). هذا الإجراء، مع تعديلات طفيفة، وقد استخدمت لعزل أقراص تخيلي من ذبابة الفاكهة ما يقرب من ثمانين عاما.

كما هو موضح أعلاه، حيث يتم التعبير عن معظم الجينات خلال موltiple مراحل التنمية وفي العديد من الأنسجة، وغالبا ما يكون من المستحيل لدراسة الآثار التي المسوخ فارغة لها على العين بأكملها كما يموت الحيوان جيدا قبل مرحلة اليرقات الطور الثالث. حققت أربع طرق دراسة الأنسجة الأكثر تقدما مثل شبكية العين بشكل ملحوظ أكثر لين العريكة. الأول هو طريقة Flippase (FLP) / Flippase إعادة التركيب الهدف (FRT) لتوليد الحيوانات المستنسخة خلية متحولة ضمن نوع الأنسجة البرية خلاف ^17-19. في هذه الحالة يتم التعرف على الأنسجة متحولة بسبب عدم وجود علامة بصرية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ويمكن مقارنة المحيطة البرية نوع الأنسجة التي GFP هو الحاضر (الشكل 2D). والثاني هو الأسلوب "FLP التدريجي" الذي يتم التعبير التحوير في مجموعة من الخلايا ^20. في هذه الحالة يتم تحديد استنساخ الخلية وجود GFP وبالمقارنة مع الأنسجة المحيطة النوع البري الذي يفتقر مراسل GFP (الشكل2E). والثالث هو تحليل الفسيفساء مع علامة الخلية كظوم (MARCM) تقنية، الذي يجمع بين عناصر من استنساخ متحولة FLP / FRT وأنظمة التعبير عن FLP من ^21. مع هذا الأسلوب التحوير يمكن التعبير ضمن مجموعة من الخلايا التي هي في نفس الوقت متحولة لموضع الجيني الفردي. مثل الحيوانات المستنسخة، FLP بها، ويتم تحديد استنساخ MARCM بحضور GFP وبالمقارنة مع الأنسجة المحيطة النوع البري الذي يفتقر إلى علامة GFP (الشكل 2F). وأخيرا، فإن الجينات ويبني رني يمكن التعبير داخل أنسجة تخيلي تحت سيطرة بنيات محددة المروج-GAL4. هذه الطرق الأربعة قد زادت من الاهتمام في دراسة أقراص تخيلي منذ استنساخ متحولة أو الإفراط في التعبير أو أنماط يمكن مقارنتها مباشرة إلى الأنسجة المجاورة نوع البرية. وقد تم تطوير الطريقة الموضحة في هذا الإجراء حتى أن الباحثين الذين يدرسون تطور آخر الجنينية من أنسجة البالغين في ذبابة الفاكهة،لا سيما تلك المتأتية من القرص العين antennal، سوف تكون قادرة على الحصول على الأنسجة جودة عالية للتحليل. على الرغم من جعلت الباحثين الأفراد تعديلات طفيفة، ظلت جوهر هذا الإجراء (الذي وصفنا هنا) دون تغيير إلى حد كبير. منذ الحصول على الأنسجة جودة عالية أمر بالغ الأهمية لدراسة أقراص تخيلي نأمل أن هذا البروتوكول المكتوبة والفيديو المرافق بمثابة مورد التدريس قيمة.

Protocol

1. إعداد يرقات

1. ملء طبق بيتري 35 ملم مع عازلة تشريح.
2. وضع اليرقات في طبق بتري والسماح لهم تسبح حولها لبضع دقائق (الخطوة التنظيف الذاتي).
3. نقل اليرقات إلى مجموعة من العازلة تشريح على طبق تشريح القائمة على السيليكون. يجب أن تكون على حافة واحدة من لوحة هذا التجمع. تتكون لوحة تشريح حل السيليكون التي تم سكب وتصلب داخل طبق بتري الزجاج.
4. باستخدام الماصة باستور، ضع مجموعة أكبر من العازلة تشريح في منتصف لوحة التشريح.
5. باستخدام # 5 ملقط، نقل يرقة واحدة تنظيفها من تجمع صغير إلى مجموعة أكبر من العازلة تشريح.

2. الخشنة تشريح اليرقات

1. في حين اليرقة لا تزال ضمن مجموعة كبيرة من العازلة تشريح قفل اليرقة مع ملقط. زوج واحد من ملقط ينبغي أن تستخدم للاستيلاء على السنانير الفم بينما يتم استخدام زوج آخر من ملقط لعقد أنيمالله لا يزال (والاستيلاء على يرقة بلطف في 1/3 طول الجسم).
2. ثابتا زوج من ملقط تحتوي على بشرة بالقرب من السنانير الفم حين سحب بسرعة بقية الجسم بعيدا مع الزوج الثاني من الملقط.
3. عندما تبدأ اليرقة بتمزيق ستشعر بيان طفيف في التوتر. الافراج عن يرقة من ملقط والسماح ل "الشجاعة" لليرقة لسفك بها. وهذا يسمح للأقراص تخيلي أن تبقى في التشكل وضعها الطبيعي ويمنعهم من التعرض للتشوه.
4. مع زوج واحد من ملقط فهم السنانير الفم مرة أخرى لعقد الواجهة الأمامية لليرقة في مكان. استخدام زوج آخر من ملقط إزالة 2/3 أقل من اليرقات بما في ذلك الشجاعة الداخلية. ملاحظة: ستكون معقدة تحتوي على السنانير الفم، وأقراص العين antennal، نصفي الدماغ، والعقدة البطنية، والغدد اللعابية، وبعض الأقراص الساق، ويبقى بشرة المغطي.
5. مع زوج من ملقط إزالة بلطف بشرة المغطي، والغدد اللعابية، وأقراص الساق والأنسجة الأخرى. ملاحظة: الأنسجة إلا أنه ينبغي أن يظل هو السنانير الفم، وأقراص العين antennal، نصفي الدماغ، والعقدة البطنية (الشكل 3).
6. كرر الخطوات من 2.1-2.5 مع يرقات إضافية لمدة 15-20 دقيقة. ملاحظة: أقراص تخيلي التي تبقى في المخزن تشريح لفترات أطول من الوقت تميل إلى أن تتحلل وستظهر في نهاية المطاف أنها أقل من عينات مثالية لتصويرها. وهكذا، وبعد مدة أقصاها 20 دقيقة يجب نقل جميع أنسجة تشريح لتثبيتي PLP (انظر أدناه).

3. تثبيت وتلون الأنسجة مع الأجسام المضادة

1. باستخدام pipetman P-200، ونقل الأنسجة تشريح لكوب الساعات التي تحتوي على امتصاص العرق البارد ليسين-بريودات (حزب العمال التقدمي) مثبت. الحد من حجم نقل عازلة تشريح إلى 50 ميكرولتر للحد من التخفيف من حزب العمال التقدمي. تأكد من قطع رأس بشفرة الحلاقة بحيث افتتاح غيض هو كبير بما يكفي لاستيعاب الأنسجة تشريح. باستخدام زوج من ملقط أوإبرة التنغستن تضمن تشريح الأنسجة وغرقت تماما من أجل التثبيت السليم للتحدث. احتضان الأنسجة تشريح في تثبيتي PLP البارد لمدة 45 دقيقة. هذه الحضانة يمكن أن تتم في RT دون الانفعالات.
2. باستخدام pipetman P-200، ونقل الأنسجة تشريح لغسل عازلة (RT) باستخدام طرف الأصفر خفض آخر لمدة 45 دقيقة. حجم الحد من حزب العمال التقدمي نقل إلى 50 ميكرولتر للحد من التخفيف من غسل العازلة. ملاحظة: جميع أنسجة تشريح يجب مغمورة تماما.
3. نقل مجموعات من 20-30 تشريح الأنسجة إلى 1.5 مل microfuge أنبوب. ملاحظة: إذا تم الجمع بين أعداد أكبر من المجمعات القرص العين antennal داخل أنبوب، هناك إمكانية أن الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب لن يتعرض بشكل صحيح إلى الأجسام المضادة. لأفضل النتائج يجب أن لا يزيد عن 20-30 المجمعات القرص العين antennal الحالي ضمن أنبوب واحد. سوف تشريح الأنسجة تستقر في قاع microfuge أنبوب. الخطوات لذلك، في لاحقة شحد ذاته pipetman لإزالة واستبدال غسل العازلة، حل حظر، والأجسام المضادة.
4. إزالة غسل العازلة واستبدالها مع 100 ميكرولتر من عرقلة الحل: 10٪ مصل الماعز العادي في غسل العازلة. في احتضان RT مع دوران طيف على أحد كبار المدورة الجدول لمدة 10 دقيقة.
5. الحل إزالة الحجب واستبدالها مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية التي تم مخففة بشكل مناسب في 10٪ مصل الماعز العادي. في احتضان RT مع دوران طيف لمدة 16 ساعة.
6. إزالة الأجسام المضادة الأولية واستبدالها مع 750 ميكرولتر من غسل العازلة. وضع أنابيب على nutator والسماح لnutate في RT لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية يمكن حفظ (مخزن في 4 درجات مئوية) وإعادة استخدامها في وقت لاحق. يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة عدة مرات مساعدة في الحد غير محددة وملزمة.
7. سماح رؤساء لتستقر في قاع الأنبوب، ثم إزالة غسل العازلة وإضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية التي تم المخفف مناسب في 10٪ مصل طبيعي. في احتضان RT مع دوران طيف ل2̵1، 4 ساعة.
8. إزالة حلول الأجسام المضادة الثانوية من الأنسجة واستبدالها مع 500 ميكرولتر من غسل العازلة. تسمح الأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب.
9. استخدام P-200 وتلميح قطع الأصفر، ونقل جميع أنسجة تشريح لمجموعة من غسل العازلة التي تم وضعها على طبق تشريح. في حين الشروع في الخطوة التالية من تشريح ما يرام، فإن احتضان الأنسجة في غسل العازلة. هذا يساعد على إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة.

4. تشريح الجميلة في العين Antennal القرص مجمعات وتصاعد على الشرائح

1. استخدام زوج واحد من ملقط لقفل بشرة بواسطة السنانير الفم مع الجانب البطني من مجمع أسفل. مع الزوج الثاني من ملقط إزالة فصوص الدماغ اثنين عن طريق إغلاق ملقط الثانية في الفضاء بين أقراص المخ والعين (الشكل 3، السهم الأحمر) وبسرعة سحب الدماغ بعيدا عن السنانير الفم.
2. مع الاستمرار في التمسك السنانير الفم، قرصة قبالةالأنسجة أقرب وقت ممكن للاتصال بين قسم antennal من القرص العين antennal والسنانير الفم (الشكل 3، السهم الأزرق). ملاحظة: يجب أن تكون المجمعات القرص العين antennal خالية من جميع الأنسجة (الشكل 1A). تستمر حتى تم تشريح جميع الأنسجة المرجوة المرجوة التي يمكن وضعها على الشرائح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل الجناح، haltere والساق وأقراص تخيلي التناسلية (الشكل 1B-E).
3. إضافة اثنين من قطع صغيرة من المناديل الورقية (حجم coverslips) حوالي 3 في. بصرف النظر على طبق تشريح. وضع شريحة زجاجية على الطبق - يجب أن قطعتين من المناديل الورقية تكون تحت نهايات الشريحة. هذا سيمنع الشريحة من الالتصاق إلى قاعدة سيليكون للطبق تشريح.
4. استخدام P-20 مع تلميح غير المصقول، إضافة 9 ميكرولتر من وكيل لمكافحة تبييض لمنتصف شريحة المجهر والزجاج. هذا يمنع تبييض الأنسجة عند عرضها مع الفلورسنتالضوء.
5. باستخدام نفس الطرف غير المصقول، وجمع كل أسطوانة العين antennal وإضافتها إلى قطرة مكافحة تبييض كاشف. تقليل كمية من غسل العازلة التي يتم ترحيلها. في محاولة للحد من كمية من غسل العازلة إلى 10 ميكروليتر أو أقل.
6. استخدام زوج من ملقط لفصل وانتشرت الأقراص العين antennal داخل قطرة مكافحة تبييض كاشف. تسمح أقراص لاحتضان في مكافحة تبييض كاشف لعدة دقائق. ملاحظة: سوف تتحول الأقراص واضح الأنسجة تمتص كاشف مكافحة التبييض.
7. باستخدام فرشاة الرسام غرامة خفض بلطف ساترة على العينة. هذا يمنع تشكيل فقاعات الهواء.
8. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لعرض أقراص تخيلي العين antennal أو غيرها باستخدام الضوء أو المجهري الفلورسنت.

النتائج

طريقة الموضح أعلاه موثوق تنتج مواد ذات جودة عالية للتحليل مع تحقيقات في الموقع، للصحفيين النسخي، والفخاخ البروتين والأجسام المضادة. في الشكل 1 نعرض العين الهوائي، والأعضاء التناسلية، الجناح، haltere والساق الأقراص التي يتم استردادها بشكل روتيني مع هذا ا?...

Discussion

على الرغم من أن هذا الإجراء قد ركزت بشكل كبير على العزلة ومعالجة لاحقة الأقراص العين antennal، فمن قابلة للتستخدم لعزل وتحليل الجناح، haltere والساق وأقراص التناسلية (الشكل 4). والتعديل الوحيد المطلوب من بروتوكول لعزل هذه الأقراص (على العكس من القرص العين antennal) هو ط?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples