Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Résumé

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Résumé

Une partie importante du développement post-embryonnaire chez la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a lieu au sein d'un ensemble de structures de sac-comme les appelés disques imaginaux. Ces disques donnent lieu à un pourcentage élevé de structures adultes qui se trouvent à l'intérieur de la mouche adulte. Nous décrivons ici un protocole qui a été optimisé pour récupérer ces disques et de les préparer pour l'analyse avec des anticorps, des journalistes de la transcription et les pièges de protéines. Cette procédure est plus adapté pour les tissus légers tels que les disques imaginaux, mais peut être facilement modifié pour une utilisation avec des tissus plus épais tels que le cerveau adulte et larvaire ovaire. Le protocole écrit et la vidéo qui accompagne va guider le lecteur / spectateur à travers la dissection de troisième stade larvaire, fixation de tissu, et le traitement des disques imaginaux avec des anticorps. Le protocole peut être utilisé pour disséquer les disques imaginaux de jeunes larves de premier et deuxième stade aussi. L'avantage de ce protocole est qu'il est relativement court et il a êtrefr optimisé pour la préservation de haute qualité du tissu disséqué. Un autre avantage est que la procédure de fixation qui est utilisé fonctionne bien avec la très grande majorité des anticorps qui reconnaissent des protéines de Drosophila. Dans notre expérience, il ya un très petit nombre d'anticorps sensibles qui ne fonctionnent pas bien avec cette procédure. Dans ces situations, le remède semble être d'utiliser une fixation cocktail autre tout en continuant à suivre les lignes directrices que nous avons définies pour les étapes de dissection et les incubations d'anticorps.

Introduction

Depuis plus d'un siècle, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été un principal système pour étudier le développement, le comportement et la physiologie. Développement de la mouche peut être divisé en deux grandes étapes: embryonnaires et post-embryonnaires avec beaucoup de celle-ci ayant lieu au sein de l'épithélium monocouche appelés disques imaginaux ^1-3. Dessins de disques imaginaux ont d'abord été publiés en 1864 par Août Weismann dans le cadre de son vaste monographie sur le développement des insectes ^1. Ces disques commencent leur développement au cours de l'embryogenèse, sont motifs pendant les stades larvaires, survivre à la histolyse massive des pupes début, et finalement donner lieu à un pourcentage élevé de structures adultes que l'on trouve au sein de la mouche adulte ^1-14. Au cours du développement larvaire chaque disque fait plusieurs décisions importantes concernant le destin, la forme et la taille. Dans les premier et deuxième stades larvaires, les disques sont chargés de l'adoption d'un sort primaire, establishing limites du compartiment, l'adoption de la forme correcte et générer le nombre requis de cellules ^15-16. Au cours du troisième stade larvaire et au début du stade pré-pupe, les disques imaginaux continuent à se diviser et sont modelées comme des cellules adoptent leurs destins terminaux ^16.

Au cours de l'histoire des débuts de la biologie du développement chez la drosophile, les disques imaginaux ont été étudiés presque exclusivement dans le contexte du développement normal et dans les cas limités où une perte ou un mutant gain de fonction était viable. L'utilisation des rayons X pour induire une recombinaison mitotique permis de mutations létales à analyser dans des clones de cellules dans les tissus de larves et d'adultes. Cette méthode a été améliorée par l'introduction de méthodes transgéniques pour analyser la perte et gain de fonction des mutations dans deux tissus larvaires et adultes. Le nombre d'anticorps, les journalistes de la transcription et les pièges de protéines pour décrire le paysage moléculaire de type sauvage et mutantes tissus est également constde plus en plus antly. L'utilisation de ces marqueurs moléculaires pour analyser la perte et gain de fonction des clones de cellules mutantes a fait de plus en plus possible d'acquérir une compréhension en temps réel de la façon dont les cellules mutantes s'écartent de leurs cousins ​​de type sauvage au cours du développement. Pour bien prendre avantage de ces outils et des réactifs, il est essentiel d'avoir des préparations de disques imaginaux qui peut être consulté, photographiés et analysés haute qualité. Le but de ce manuscrit est de fournir un protocole optimisé pour l'isolement et la préparation du complexe de disque eye-antennaire (Figure 1A). Il peut également être utilisé avec succès pour isoler une grande variété de disques supplémentaires, y compris celles qui donnent lieu à des ailes, des haltères, des jambes T1-T3 et les organes génitaux (figure 1B-E). Ce procédé, avec des modifications mineures, a été utilisée pour isoler les disques imaginaux de la drosophile pendant près de 80 années.

Comme décrit ci-dessus, étant donné que la plupart des gènes sont exprimés au cours de multiple stades de développement et dans une multitude de tissus, il est souvent impossible d'étudier les effets que les mutants nuls ont sur l'ensemble de l'œil que l'animal meurt bien avant le stade larvaire troisième stade larvaire. Quatre méthodes ont fait l'étude des tissus plus avancés tels que la rétine beaucoup plus docile. Le premier est le procédé flippase (FLP) / flippase recombinaison cible (FRT) de générer des clones de cellules mutantes dans un tissu de type sauvage ^17-19 autrement. Dans ce cas, le tissu mutant est identifié par l'absence d'un repère visuel tel que la protéine fluorescente verte (GFP) et peut être comparé au tissu environnant de type sauvage dans lequel la GFP est présente (figure 2D). La seconde est la méthode "flp-out" dans laquelle un transgène est exprimé dans une population de cellules ^20. Dans ce cas, les clones de cellules sont identifiés par la présence de GFP et par rapport au tissu environnant de type sauvage qui n'a pas le rapporteur GFP (Figure2E). Le troisième est l'analyse Mosaïque avec une technique répressible marqueur cellulaire (marcm), qui combine des éléments du clone mutant FLP / FRT et systèmes d'expression flp-out ^21. Avec cette méthode, un transgène peut être exprimé dans une population de cellules qui sont à la fois pour un mutant locus génétique particulier. Comme les clones de flp-out, marcm clones sont identifiés par la présence de GFP et comparés au tissu de type sauvage environnante qui n'a pas le marqueur GFP (Figure 2F). Et enfin, les gènes et les constructions ARNi peuvent être exprimés dans les tissus imaginaux sous le contrôle des constructions spécifiques promoteur GAL4. Ces quatre méthodes ont accru l'intérêt dans l'étude des disques imaginaux depuis clones mutants ou des motifs ou sur-expression peuvent être directement comparés aux tissus adjacents de type sauvage. La méthode décrite dans cette procédure a été mise au point afin que les chercheurs qui étudient le développement post-embryonnaire des tissus adultes chez la drosophile,notamment ceux issus de disque eye-antennaire, pourront obtenir des tissus de haute qualité pour l'analyse. Bien que les chercheurs individuels ont apporté de légères modifications, le noyau de cette procédure (que nous décrivons ici) est resté largement inchangé. Depuis l'obtention de tissus de haute qualité est essentiel à l'étude des disques imaginaux nous espérons que ce protocole écrit et la vidéo qui accompagne va servir de ressource pédagogique précieuse.

Protocole

1 Préparation de larves

1. Remplissez une boîte de 35 mm de Pétri avec un tampon de dissection.
2. Placez les larves en boîte de Petri et leur permettre de nager pendant quelques minutes (étape d'auto-nettoyage).
3. Transférer les larves à un pool de mémoire tampon de dissection sur une plaque de dissection à base de silicone. Cette piscine doit être à un bord de la plaque. La plaque de dissection se compose d'une solution de silicone qui a été coulé et durci dans une boîte de Pétri en verre.
4. L'utilisation d'un pasteur-pipette, placer un plus grand bassin de tampon de dissection au milieu de la plaque de dissection.
5. Utilisation # 5 pinces, transférer une seule larve nettoyé depuis la petite piscine de la plus grande piscine de tampon de dissection.

2 gros Dissection de larves

1. Alors que la larve est toujours dans la grande piscine de tampon de dissection serrer la larve avec la pince. Une paire de pinces doit être utilisé pour saisir les crochets de la bouche tandis que l'autre paire de pinces est utilisé pour maintenir la animal encore (saisir la larve doucement à un tiers la longueur du corps).
2. Hold Steady la paire de pinces contenant la cuticule près de la bouche des crochets tout en tirant rapidement le reste du corps à l'écart avec la deuxième paire de pinces.
3. Lorsque la larve commence à se déchirer, vous vous sentirez un léger dégagement de la tension. Relâchez la larve de la pince et de permettre les "entrailles" de la larve à déborder. Cela permet aux disques imaginaux de rester dans leur conformation normale et les empêche de se déformer.
4. Avec une paire de pinces saisir les crochets buccaux à nouveau pour tenir l'extrémité avant de la larve en place. Utilisation de l'autre paire de pinces enlever la partie inférieure de 3.2 larves dont le cran interne. Remarque: un complexe contenant les crochets de la bouche, les disques de l'oeil-antennaire, hémisphères du cerveau, ganglion ventral, les glandes salivaires, des disques de la jambe, et la cuticule recouvrant resteront.
5. Avec une paire de pinces retirez délicatement la cuticule recouvrant, les glandes salivaires, les disques de la jambe etd'autres tissus. Remarque: seul tissu qui devraient rester sont les crochets de la bouche, des disques d'oeil-antennaire, hémisphères du cerveau, et ganglion ventral (Figure 3).
6. Répétez les étapes 2.1-2.5 avec des larves supplémentaire pour 15-20 min. Remarque: les disques imaginaux qui restent dans le tampon de dissection pour des périodes plus longues ont tendance à se dégrader et, finalement, apparaissent comme moins de spécimens parfaits pour être photographiés. Ainsi, après un maximum de 20 minutes tous les tissus disséqués devraient être transférés au fixateur de PLP (voir ci-dessous).

3. fixation et coloration des tissus avec des anticorps

1. L'utilisation d'un Pipetman P-200, transférer les tissus disséqués à un verre de montre contenant froid Paraformaldéhyde-lysine-Periodate (PLP) fixateur. volume de limite de tampon de dissection transféré à 50 pi de minimiser la dilution de PLP. Veillez à couper la pointe d'une lame de rasoir de sorte que l'ouverture de la pointe est assez grand pour accueillir les tissus disséqués. En utilisant une paire de pinces ouune aiguille de tungstène veiller à ce que les tissus disséqués sont complètement immergés dans l'ordre pour la fixation correcte de se produire. Incuber les tissus disséqués dans fixateur de PLP froid pendant 45 min. Cette incubation peut avoir lieu à température ambiante sans agitation.
2. L'utilisation d'un Pipetman P-200, transférer les tissus disséqués pour le tampon de lavage (RT) en utilisant une autre astuce jaune coupé pendant 45 min. Limiter le volume de transfert de PLP à 50 ul de réduire au minimum la dilution de la solution de lavage. Remarque: tous les tissus disséqués doivent être complètement immergés.
3. Transfert 20-30 ensembles de tissus disséqués à 1,5 ml tube de centrifugeuse. Remarque: si un plus grand nombre de complexes de disque eye-antennaire sont combinés à l'intérieur du tube, il est possible que le tissu au niveau du fond du tube n'est pas correctement exposée aux anticorps. Pour des résultats optimaux pas plus de 20-30 complexes de disque eye-antennaire doivent être présents dans un seul tube. Le tissu disséqué se déposent au fond du tube de centrifugeuse. Étapes conséquent, dans la suite uSE Pipetman pour retirer et remplacer le tampon de lavage, la solution de blocage, et des anticorps.
4. Retirer le tampon de lavage et le remplacer par 100 ul de solution de blocage: 10% de sérum de chèvre normal dans du tampon de lavage. Incuber à température ambiante avec une légère rotation sur une partie supérieure de la coiffe de table pendant 10 minutes.
5. Retirer la solution de blocage et le remplacer avec 100 ul d'anticorps primaires qui ont été dilués de manière appropriée dans 10% de sérum de chèvre normal. Incuber à température ambiante avec une légère rotation pendant 16 heures.
6. Retirer les anticorps primaires et les remplacer par 750 ul de tampon de lavage. Placer les tubes dans un nutator et permettre à nutation à température ambiante pendant 10 min. Remarque: L'anticorps primaire peut être sauvé (conserver à 4 ° C) et réutilisé plus tard. Réutilisation des anticorps à plusieurs reprises peut aider à réduire la liaison non spécifique.
7. Permettre aux têtes de se déposer au fond du tube, puis retirer le tampon de lavage et ajoute 100 ul d'anticorps secondaire qui ont été dilués de manière appropriée dans 10% de sérum normal. Incuber à température ambiante avec une légère rotation pour 2̵1; 4 h.
8. Retirer solutions d'anticorps secondaires à partir de tissu et le remplacer par 500 ul de tampon de lavage. Laisser tissu à reposer au fond du tube.
9. L'utilisation d'un P-200 et une pointe jaune de coupe, de transférer tous les tissus disséqués à un pool de tampon de lavage qui a été placé sur le plat de dissection. Tout en procédant à la prochaine étape de dissection fine, le tissu sera incuber dans le tampon de lavage. Cela aide à éliminer les anticorps secondaires excédentaires.

4. dissection fine de Eye-antennaire disque Complexes et montage sur Diapositives

1. Utilisez une paire de pinces pour serrer la cuticule par les crochets buccaux avec la face ventrale du complexe vers le bas. Avec une deuxième paire de pinces enlever les deux lobes du cerveau par la fermeture des pinces dans le deuxième espace entre les disques de l'oeil et le cerveau (figure 3, la flèche rouge) et en tirant rapidement le cerveau à l'écart des crochets de la bouche.
2. Tout en continuant à garder les crochets buccaux, pincezle tissu le plus proche possible de la connexion entre la section du disque antennaire eye-antennaire et les crochets de la bouche (figure 3, flèche bleue). Note: les complexes de disque eye-antennaire devraient être libres de tous les tissus (figure 1A). Continuez jusqu'à ce que tous les tissus désiré désiré qui peut être placé sur des lames a été disséqué. Ce protocole peut être adapté pour isoler aile, haltère, la jambe et les disques imaginaux génitales (figure 1B-E).
3. Ajouter deux petits morceaux de papier de soie (taille des lamelles) environ 3. Part sur le plat de dissection. Placez une lame de verre sur le plat - les deux morceaux de papier de soie doivent être sous les extrémités de la lame. Cela permettra d'éviter le tiroir de coller à la base de silicone de la coupelle de dissection.
4. Utilisation d'un P-20 avec une extrémité non coupée, 9 ul d'ajouter un agent anti-blanchiment au milieu de la lame de microscope en verre. Cela empêche le blanchiment des tissus lorsqu'on la visionne à fluorescentlumière.
5. En utilisant la même pointe uncut, rassembler tous les disques de l'oeil-antennaire et les ajouter à la goutte de réactif anti-blanchiment. Minimiser la quantité de tampon de lavage qui est reporté. Essayer de limiter la quantité de tampon de lavage à 10 ul ou moins.
6. Utilisez une paire de pinces pour séparer et étaler les disques de l'oeil-antennaire dans la goutte de réactif anti-blanchiment. Laisser les disques à incuber dans un réactif anti-blanchiment pendant plusieurs minutes. Remarque: les disques se tournent clairement que le tissu absorbe le réactif anti-blanchiment.
7. L'aide d'un pinceau fin abaissez doucement une lamelle sur l'échantillon. Ceci permet d'éviter la formation de bulles d'air.
8. Magasin glisse à -20 ° C jusqu'au moment de voir les disques imaginaux yeux des antennes ou autres en utilisant la lumière ou la microscopie à fluorescence.

Résultats

La méthode décrite ci-dessus de manière fiable produit du matériel de haute qualité pour l'analyse des sondes in situ, les journalistes de la transcription, les pièges de protéines et d'anticorps. Dans la figure 1, nous affichons œil-antenne, génitales, ailes, haltère et jambes disques qui sont systématiquement récupérés avec cette méthode. Ces disques ont été traités avec un fluorophore de la phalloïdine-conjugué, qui se lie à l'actine F et décrit par conséqu...

Discussion

Bien que cette procédure ait surtout porté sur l'isolement et le traitement ultérieur des disques eye-antennaire, il est susceptible d'être utilisé pour isoler et analyser l'aile, haltère, la jambe et les disques génitales (figure 4). La seule modification nécessaire du protocole pour isoler ces disques (par opposition au disque eye-antennaire) est la méthode de dissection grossière (de l'article 2 du protocole). La première branche (T1) thoracique paire se trouve à la partie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples