Вскрытие и Иммуноокрашивание имагинальные диски из<em&gt; Дрозофилы</em

Резюме

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Аннотация

Значительная часть пост-эмбрионального развития дрозофилы, дрозофилы, происходит в рамках набора SAC-как структуры, называемые имагинальные диски. Эти диски порождают высокий процент взрослых структур, которые находятся в пределах взрослого лету. Здесь мы опишем протокол, который был оптимизирован для восстановления этих дисков и подготовить их для анализа с антителами, транскрипционных репортеров и белковых ловушек. Эта процедура лучше всего подходит для тонких тканей, таких как имагинальных дисках, но может быть легко модифицирована для использования с более толстыми тканей, таких как личиночной мозга и взрослых яичника. Письменное протокол и сопровождающие видео поможет читателя / зрителя через рассечения третьей возрастной стадии личинок, фиксации ткани и лечения имагинальных дисках с антителами. Протокол может быть использован, чтобы рассекать имагинальные диски от младшего личинок первой и второй возрастной стадии а. Преимущество этого протокола является то, что она является относительно коротким, и он имеет бытьан оптимизирован для сохранения высокого качества из рассеченной ткани. Еще одним преимуществом является то, что процедура фиксации, который используется хорошо работает с подавляющим числом антител, которые распознают Drosophila белки. По нашему опыту, есть очень небольшое количество чувствительных антител, которые не очень хорошо работают с этой процедурой. В таких ситуациях, появится средство, чтобы быть использовать альтернативный коктейль фиксации, продолжая следовать указаниям, которые мы, предъявляемым к шагов рассечение и инкубации антител.

Введение

Для более века плодовой мушки, дрозофилы, был главным система для изучения развития, поведение и физиологию. Развитие в лету можно разделить на две большие стадии: эмбриональных и пост-эмбриональных с большей частью последнего, происходящих в монослоя эпителия называемых имагинальные диски ^1-3. Чертежи имагинальных дисках были впервые опубликованы в 1864 году Августом Вейсмана в рамках своего широкого монографии о развитии насекомых ^1. Эти диски начинают свое развитие во время эмбриогенеза, по образцу в течение личиночной стадии, пережить массовое гистолиза ранних куколки, и в конечном итоге привести к высоким процентом взрослых структур, которые находятся в пределах взрослой мухи ^1-14. Во время развития личинок каждый диск делает несколько важных решений относительно судьбы, формы и размера. В первом и втором личиночных возрастов, диски поручено принятия первичный судьбу, establisповесят границы отсека, приняв правильную форму и генерации необходимого количества клеток ^15-16. Во время третьего личиночного возраста и ранней стадии предварительного куколки, имагинальные диски продолжают делиться и с рисунком, как клетки принять свои терминальные судьбы ^16.

В ранней истории Drosophila биологии развития, имагинальные диски были изучены почти исключительно в контексте нормального развития и в ограниченных случаях, когда утрата или усиления из-функции мутант жизнеспособным. Использование рентгеновских лучей, чтобы побудить митотический рекомбинации позволило летальных мутаций, которые будут проанализированы в клеточных клонов в рамках взрослой и личиночной тканей. Этот метод был усовершенствован путем введения трансгенных методов для анализа потерь и получить-из-функции мутации в обеих личинок и взрослых тканей. Количество антитела, транскрипционных репортеров и белка ловушки для описания молекулярной ландшафт дикого типа и мутантных тканей также строительстваantly растет. Используя эти молекулярные маркеры для анализа потерь и получить-из-функции мутант клонов клеток сделало более целесообразным, чтобы получить в режиме реального времени понимание того, как мутантные клетки отклоняются от своих диких родственников типа в процессе разработки. Чтобы правильно воспользоваться этими инструментами и реагентов важно иметь качественные препараты имагинальных дисках, которые можно просматривать, сфотографировали и проанализированы. Цель этой рукописи является обеспечение оптимизированный протокол для выделения и подготовки глаз-усиков диска комплекса (Рисунок 1А). Она также может быть успешно использован для выделения широкий спектр дополнительных дисков, включая те, которые приводят к возникновению крылья, жужжальцам, T1-T3 ног и половых органов (Рисунок 1В-E). Эта процедура, с незначительными изменениями, был использован для изоляции имагинальные диски из Drosophila в течение почти восьмидесяти лет.

Как описано выше, так как большинство гены экспрессируются во муltiple стадиях развития и в множестве тканей, часто невозможно, чтобы изучить эффекты, что нулевые мутанты имеют на всей глазом как животное умирает задолго до третьего возраста личиночной стадии. Четыре метода сделали изучение более развитых тканей, таких как сетчатка значительно более сговорчивым. Первым из них является метод Flippase (ФЛП) / Flippase рекомбинация Целевая (FRT) генерировать мутантных клонов клеток в противном случае дикого типа ткани ^17-19. В данном случае мутантный ткань идентифицированы по отсутствию визуального маркера, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его можно сравнить с окружающей ткани дикого типа, в которых присутствует GFP (2D) Рис. Второй метод "ар-аут", в котором трансген экспрессируется в популяции клеток ^20. В этом случае клеточные клоны идентифицируются наличием GFP и по сравнению с окружающим дикого типа ткани, которая испытывает недостаток в GFP репортер (Рисунок2E). Третий является анализ Мозаика с репрессируемый сотовый Маркер (MARCM) техники, которая сочетает в себе элементы мутантного клона ФЛП / FRT и ФЛП-из выражений систем ^21. С помощью этого метода трансген может быть выражена в популяции клеток, которые одновременно мутанта для индивидуального генетического локуса. Как ФЛП-из клонов, MARCM клоны идентифицируются наличием GFP и по сравнению с окружающим дикого типа ткани, которая испытывает недостаток в GFP маркер (Рисунок 2F). И, наконец, гены и РНК-интерференции конструкции могут быть выражены в имагинальных тканей под контролем конкретных промоутер-GAL4 конструкций. Эти четыре метода увеличили интерес к изучению имагинальные диски с мутантные или Сверхэкспрессия клоны или узоры можно напрямую сравнивать с соседней дикого типа ткани. Метод, описанный в этой процедуре была разработана таким образом, что исследователи, изучающие постэмбрионального развития взрослых тканях у дрозофилы,особенно те, которые получены из глаз-усиков диска, смогут получить качественное ткани для анализа. Хотя отдельные исследователи сделали небольшие изменения, в основе этой процедуры (которые мы опишем здесь) остается практически неизменным. После получения высокого качества ткани имеет решающее значение для изучения имагинальных дисков мы надеемся, что это написано протокол и сопровождающие видео будет служить в качестве ценного учебного ресурса.

протокол

1 Подготовка личинок

1. Заполните 35 мм чашки Петри с рассечение буфера.
2. Поместите личинок в чашку Петри и дать им возможность плавать вокруг в течение нескольких минут (самоочищающиеся шаг).
3. Трансфер личинок в пул рассечение буфера на основе силикона вскрытии пластины. Этот пул должна быть на одном краю пластины. Рассечение пластина состоит из силиконового раствора, который был наливают и закаленной в стеклянную чашку Петри.
4. Использование Пастера-пипетки, разместить большее объединение рассечение буфера в середине вскрытии пластины.
5. Использование # 5 щипцы, передачи одного очищенный личинку из небольшого бассейна на более широкий круг рассечение буфера.

2 Грубый Рассечение личинок

1. В то время как личинка все еще находится в большой луже рассечение буфера обхватить личинку с пинцетом. Одна пара щипцов следует использовать, чтобы захватить рот крючки в то время как другая пара щипцов используется для хранения Анималь-прежнему (захватить личинку осторожно в 1/3 длины тела).
2. Держите стабилизировать пару щипцов, содержащих кутикулу вблизи устья крючков в то время как быстро потянув остальную часть тела прочь с второй парой щипцов.
3. Когда личинка начинает рвать на части вы почувствуете легкое освобождение напряженности. Отпустите личинку от щипцов и позволяют "внутренности" личинки выливаться. Это позволяет имагинальных дисков, чтобы оставаться в своей нормальной конформации и предотвращает их от деформации.
4. С одной парой щипцов понять рот крючки снова, чтобы удерживать передний конец личинки на месте. Использование другой парой щипцов удалить ниже 2/3 личинок в том числе внутренних кишки. Примечание: комплекс, содержащий рот крючки, глаз-усиков диски, полушарий мозга, вентральной ганглиозных, слюнных желез, некоторые диски ног, и перекрывающие кутикула останется.
5. С парой щипцов осторожно удалите облегающего кутикулу, слюнных желез, диски ног идругой ткани. Примечание: только ткани, которая должна остаться в рот крючки, глазные-усиков диски, полусферы мозга и вентральный нервный узел (рисунок 3).
6. Повторите шаги 2.1-2.5 с дополнительной личинок в течение 15-20 мин. Примечание: имагинальные диски, которые остаются в рассечение буфера в течение более длительных периодов времени, как правило, ухудшает и в конечном счете будет выглядеть как далеко не идеальных образцов, которые будут фотографировать. Таким образом, после того, как максимум 20 мин все рассеченные ткани должны быть переданы в PLP фиксатора (смотри ниже).

3 Фиксация и окрашивание ткани с антителами

1. Использование Pipetman P-200, передать расчлененные тканей к часовым стеклом, содержащего холодную Параформальдегид-лизин-Периодатное (ПЛП) фиксатором. Ограничение объем переданного буфера рассечение до 50 мкл для минимизации разбавление PLP. Обязательно обрежьте кончик лезвием бритвы так, чтобы отверстие наконечника достаточно большой, чтобы разместить отсеченных тканей. Использование пару щипцов иливольфрамовой иглы убедитесь, что расчлененный ткани полностью погружены для того, чтобы собственно фиксация происходит. Инкубируйте рассеченные ткани в холодной PLP фиксатором в течение 45 мин. Это инкубирование может происходить при комнатной температуре без перемешивания.
2. Использование Pipetman P-200, передать расчлененные ткани мыть буфер (RT) с помощью другого сократить желтый наконечник в течение 45 мин. Ограничение объем передаваемой PLP до 50 мкл для минимизации разбавление промывочного буфера. Примечание: все расчлененные ткани должны быть полностью погружены.
3. Трансфер 20-30 комплектов расчлененный ткани до 1,5 мл пробирке. Примечание: если большее число глазных-усиков комплексов диска объединены внутри трубки, существует возможность того, что ткани в нижней части трубки не будут подвергаться образом с антителами. Для получения оптимальных результатов не более 20-30 глаз-усиков комплексы дисковые не должны присутствовать в одной пробирке. Рассеченные ткани будет оседать на дне пробирке. Поэтому в последующие этапы UС.Е. Pipetman удалить и заменить промывочного буфера, блокирующий решение, и антитела.
4. Удалить промывочного буфера и заменить 100 мкл блокирующего раствора: 10% нормальной козьей сывороткой в ​​промывочного буфера. Выдержите при комнатной температуре с легким вращением на столе ротатора в течение 10 мин.
5. Удалить блокирующий решение и заменить 100 мкл первичных антител, которые соответствующим образом разведенных в 10% нормальной козьей сывороткой. Инкубируют при комнатной температуре при осторожном вращении в течение 16 часов.
6. Удалить первичных антител и заменить 750 мкл промывочного буфера. Поместите трубки на nutator и позволяют nutate при комнатной температуре в течение 10 мин. Примечание: первичное антитело может быть сохранен (хранить при 4 ° С) и повторно позже. Повторное использование антител одного раза может помочь в снижении неспецифического связывания.
7. Разрешить головки оседают на дне пробирки, а затем удалить промывочного буфера и добавить 100 мкл вторичных антител, которые соответствующим образом разбавленного в 10% нормальной сывороткой. Выдержите при комнатной температуре с легким вращением для 2̵1; 4 ч.
8. Удалить решений вторичное антитело из ткани и замены с 500 мкл промывочного буфера. Разрешить ткани оседают на дне пробирки.
9. Использование P-200 и вырезать желтый наконечник, передать все расчлененные тканей в луже промывочного буфера, который был размещен на вскрытии блюдо. В то время как приступить к следующему шагу изобразительного вскрытия, ткань будет инкубировать в промывочного буфера. Это помогает удалить избыток вторичного антитела.

4 Изысканные Рассечение Eye-усиков Disc комплексов и Монтаж на слайдах

1. Используйте одну пару щипцов обхватить кутикулу устами крючков с вентральной стороне комплекса вниз. Со вторым пинцета удалите из двух долей мозга, закрыв вторую щипцов в пространстве между головного мозга и глаз дисков (рисунок 3, красная стрелка) и стремительно тянет мозг от устья крючков.
2. Продолжая удерживать на рот крючки, отщипнутьткань как можно ближе к связи между усиков части глаз-усиков диска и рта крючков (рис 3, синяя стрелка). Примечание: глазные-усиков комплексы дисковые должны быть свободны от всех тканей (рисунок 1А). Продолжайте, пока все желаемый ткани желательно, чтобы можно поместить на слайды не была расчленена. Этот протокол может быть адаптирован, чтобы изолировать крыло, haltere, ноги и генитальные имагинальные диски (рис 1B-E).
3. Добавьте две небольшие кусочки папиросной бумаги (ширина покровные) около 3 в. Друг от друга на вскрытии блюдо. Поместите предметное стекло на блюдо - два куска тонкой бумаги должны находиться под концах слайде. Это предотвратит сползание от прилипания к силиконовой основе рассекает блюдо.
4. Использование P-20 с неразрезанного наконечником, добавить 9 мкл анти-отбеливающего агента в середине стекло микроскопа. Это предотвращает обесцвечивание ткани, если смотреть с флуоресцентнойсвет.
5. Используя тот же режиссерский совет, собрать все глаза-усиков диски и добавьте их в капле анти-отбеливающего реагента. Сведение к минимуму количества промывочного буфера, который осуществляется более. Попытка ограничить объем промывочного буфера 10 мкл или менее.
6. Используйте пару щипцов для разделения и распростерла глаз-усиков дисков в капле анти-отбеливающего реагента. Разрешить диски для инкубации в анти-отбеливающего реагента в течение нескольких минут. Примечание: диски получится ясно, как ткань поглощает анти-отбеливающий реагент.
7. Использование тонкой кистью аккуратно опустите покровное на образец. Это предотвращает образование воздушных пузырьков.
8. Магазин скользит при -20 ° С до готовности для просмотра глаза усиков или другие имагинальные диски, используя свет или флуоресцентной микроскопии.

Результаты

Метод, описанный выше надежно производит высококачественный материал для анализа с в точке зондов, транскрипционных репортеров, белковых ловушек и антител. На рисунке 1 мы показываем глаз-антенны, генитальный, крыло, haltere и ног диски, которые обычно восстановленные с помо?...

Обсуждение

Хотя эта процедура в значительной степени сосредоточены на изоляции и последующего лечения глазных-усиков дисков, она поддается используется выделить и проанализировать крыло, haltere, ногу и генитальные диски (Рисунок 4). Единственным обязательным модификация протокола для выд...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples