Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Riepilogo

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

Una parte significativa di sviluppo post-embrionale nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, si svolge all'interno di un insieme di strutture sac-come chiamate dischi immaginali. Questi dischi danno luogo ad una elevata percentuale di strutture adulti che si trovano all'interno della mosca adulta. Qui si descrive un protocollo che è stato ottimizzato per recuperare questi dischi e li prepara per l'analisi con anticorpi, i giornalisti trascrizionali e trappole di proteine. Questa procedura è più adatto per tessuti sottili come dischi imaginali, ma può essere facilmente modificato per l'utilizzo con i tessuti più spessi come il cervello adulto e dell'ovaio larvale. Il protocollo scritto e video che accompagna guideranno il lettore / spettatore attraverso la dissezione di terza larve instar, la fissazione dei tessuti, e il trattamento di dischi immaginali con anticorpi. Il protocollo può essere utilizzato per analizzare i dischi immaginali dal più giovane primo e secondo instar larve pure. Il vantaggio di questo protocollo è che è relativamente breve e deve essereen ottimizzato per la conservazione di alta qualità del tessuto sezionato. Un altro vantaggio è che la procedura di fissazione che è impiegato funziona bene con il numero enorme di anticorpi che riconoscono le proteine ​​di Drosophila. Nella nostra esperienza, vi è un numero molto piccolo di anticorpi sensibili che non funzionano bene con questa procedura. In queste situazioni, il rimedio sembra essere quello di utilizzare una fissazione cocktail alternativo, pur continuando a seguire le linee guida che ci siamo stabiliti per le fasi di dissezione ed incubazioni anticorpi.

Introduzione

Per più di un secolo il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato un sistema di premier per studiare lo sviluppo, il comportamento e la fisiologia. Sviluppo in volo può essere diviso in due grandi fasi: embrionali e post-embrionali con gran parte quest'ultimo che si svolgono all'interno monostrato epiteli chiamati dischi immaginali ^1-3. Disegni di dischi immaginali sono stati pubblicati nel 1864 da August Weismann, come parte della sua vasta monografia sullo sviluppo degli insetti ^1. Questi dischi iniziano il loro sviluppo durante l'embriogenesi, vengono modellato durante gli stadi larvali, sopravvivere alla massiccia histolysis delle fasi pupa primi, e, infine, dare origine ad una elevata percentuale di strutture per adulti che si trovano dentro l'adulto volare ^1-14. Durante lo sviluppo larvale ogni disco rende diverse decisioni critiche per quanto riguarda il destino, forma e dimensione. Entro i primi e secondi stadi larvali, i dischi hanno il compito di adozione di un destino primario, establishing confini vano, adottando la forma corretta e generando il numero richiesto di cellule ^15-16. Durante il terzo stadio larvale e precoce fase di pre-pupa, i dischi immaginali continuano a dividersi e sono modellati come le cellule adottano i loro destini morsetto ^16.

Durante la prima storia della Drosophila biologia dello sviluppo, dischi immaginali sono stati studiati quasi esclusivamente nel contesto dello sviluppo normale e nei casi limitati in cui una perdita o un mutante di guadagno-di-funzione era praticabile. L'uso di raggi X per indurre ricombinazione mitotica permesso di mutazioni letali da analizzare in cloni di cellule all'interno dei tessuti larvali e adulti. Questo metodo è stato migliorato con l'introduzione di metodi transgenici per analizzare perdita e guadagno-di-funzione mutazioni in entrambi i tessuti larvali e adulti. Il numero di anticorpi, giornalisti trascrizionali e trappole di proteine ​​per descrivere il paesaggio molecolare di tipo selvatico e tessuti mutanti è anche constantly crescente. L'utilizzo di questi marcatori molecolari per analizzare perdita e guadagno-di-funzione di cloni di cellule mutanti ha reso sempre più possibile per ottenere in tempo reale comprensione di come le cellule mutanti deviano dalle loro tipo cugini selvatici durante lo sviluppo. Per sfruttare adeguatamente questi strumenti e reagenti è fondamentale disporre di preparazioni di alta qualità di dischi immaginali che possono essere visualizzati, fotografati e analizzati. L'obiettivo di questo manoscritto è fornire un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la preparazione del complesso disco-occhio antenne (Figura 1A). Può anche essere utilizzato con successo per isolare un'ampia varietà di dischi aggiuntivi compresi quelli che danno origine alle ali, bilancieri, gambe T1-T3 e genitali (Figura 1B-E). Questa procedura, con piccole modifiche, è stato utilizzato per isolare i dischi immaginali da Drosophila per quasi 80 anni.

Come descritto in precedenza, poiché la maggior parte dei geni sono espressi durante il multiple fasi di sviluppo e in una moltitudine di tessuti, è spesso impossibile studiare gli effetti che hanno sulla mutanti nulli l'intero occhio, come l'animale muore ben prima della fase larvale al terzo stadio. Quattro metodi hanno reso possibile lo studio dei tessuti più sviluppate, come la retina significativamente più trattabile. Il primo è il metodo flippase (FLP) / flippase Ricombinazione Target (FRT) di generare cloni di cellule mutanti all'interno di un tipo di tessuto altrimenti selvaggio ^17-19. In questo caso il tessuto mutante è identificato dall'assenza di un marcatore visivo come proteina fluorescente verde (GFP) e può essere confrontato con il tipo selvatico tessuto circostante in cui GFP è presente (Figura 2D). Il secondo è il metodo "flp-out", in cui un transgene viene espresso in una popolazione di cellule ^20. In questo caso i cloni cellulari sono identificati dalla presenza di GFP e rispetto al tipo selvatico tessuto circostante che manca il reporter GFP (Figura2E). Il terzo è l'analisi Mosaico con un marcatore cellulare reprimibile (MARCM) tecnica, che combina elementi del clone mutante FLP / FRT e sistemi di espressione FLP-out ^21. Con questo metodo un transgene può essere espressa all'interno di una popolazione di cellule che sono simultaneamente mutante per un locus genetico individuale. Come cloni FLP-out, cloni marcm sono identificati dalla presenza di GFP e rispetto al tipo selvaggio circostante tessuto che manca il marcatore GFP (Figura 2F). E, infine, i geni ei costrutti RNAi possono essere espressi nei tessuti immaginari sotto il controllo di specifici costrutti promotore-GAL4. Questi quattro metodi hanno aumentato l'interesse per lo studio dei dischi immaginali dal cloni o modelli mutanti o over-espressione può essere direttamente confrontati con il tessuto adiacente wild type. Il metodo descritto in questa procedura è stata sviluppata in modo che i ricercatori che studiano lo sviluppo post-embrionale dei tessuti adulti in Drosophila,particolare di quelli derivati ​​dal disco occhio-antenne, sarà in grado di ottenere tessuti di alta qualità per l'analisi. Anche se i singoli ricercatori hanno fatto lievi modifiche, il nucleo di questa procedura (che descriviamo qui) è rimasto sostanzialmente inalterato. Dal momento che l'ottenimento di tessuti di alta qualità è fondamentale per lo studio dei dischi immaginali Ci auguriamo che questo protocollo scritto e video che accompagna serviranno come risorsa didattica preziosa.

Protocollo

1 Preparazione di larve

1. Riempire una capsula di Petri 35 millimetri con tampone dissezione.
2. Porre larve in piastra di Petri e permettere loro di nuotare in giro per alcuni minuti (step-autopulente).
3. Trasferimento larve ad un pool di buffer di dissezione su un piatto dissezione a base di silicone. Questa piscina deve essere di un bordo della piastra. La piastra dissezione costituita da una soluzione di silicone che è stato versato e indurito in una piastra di Petri di vetro.
4. Usando una pipetta pasteur-, posizionare un grande pool di buffer di dissezione nel centro del piatto dissezione.
5. Utilizzando # 5 pinze, trasferire un singolo larva pulita dalla piccola piscina al più grande pool di buffer di dissezione.

2 Coarse Dissezione di larve

1. Mentre la larva è ancora all'interno della grande piscina di buffer di dissezione stringere la larva con le pinze. Un paio di pinze deve essere usato per afferrare i ganci bocca, mentre l'altra coppia di pinze è utilizzato per contenere la animaltri ancora (afferrare la larva dolcemente terzo lunghezza del corpo).
2. Hold Steady la coppia di pinze contenenti la cuticola vicino i ganci bocca mentre rapidamente tirando il resto del corpo via con la seconda coppia di pinze.
3. Quando la larva comincia a lacerare vi sentirete un leggero rilascio di tensione. Rilasciare la larva dalle pinze e consentire il "coraggio" della larva di fuoriuscire. Questo permette per i dischi immaginali a rimanere nella loro conformazione normale e impedisce loro di deformarsi.
4. Con una coppia di pinze afferrare nuovamente i ganci bocca per tenere l'estremità anteriore della larva in posizione. Usando l'altra coppia di pinze rimuovere minore due terzi delle larve comprese le viscere interne. Nota: un complesso contenente i ganci bocca, i dischi occhio-antenne, emisferi cerebrali, gangliari ventrale, le ghiandole salivari, alcuni dischi gamba, e la cuticola sovrastante rimarranno.
5. Con un paio di pinze rimuovere delicatamente la cuticola sovrastante, ghiandole salivari, dischi gamba ealtri tessuti. Nota: solo tessuto che deve rimanere è i ganci bocca, dischi occhio-antenne, emisferi cerebrali, e ganglio ventrale (Figura 3).
6. Ripetere i passaggi 2,1-2,5 con larve supplementare per 15-20 minuti. Nota: i dischi immaginali che rimangono nel buffer di dissezione per lunghi periodi di tempo tendono a degradare e infine appariranno come meno di esemplari ideali per essere fotografati. Così, dopo un massimo di 20 minuti tutti i tessuti sezionati devono essere trasferiti al fissativo PLP (vedi sotto).

3 Fissazione e colorazione di tessuti con anticorpi

1. Utilizzando una Pipetman P-200, trasferire i tessuti sezionati per un vetro da orologio contenente freddo paraformaldeide-lisina-periodato (PLP) fissativo. Limite volume di tampone dissezione trasferito a 50 microlitri per ridurre al minimo la diluizione di PLP. Assicuratevi di tagliare la punta con una lama di rasoio in modo che l'apertura punta è grande abbastanza per ospitare i tessuti sezionati. Usando un paio di pinze oun ago di tungsteno assicura che i tessuti sezionati sono completamente immersi in ordine per il fissaggio adeguato a verificarsi. Incubare tessuti sezionati a freddo PLP fissativo per 45 min. Questo incubazione può avvenire a temperatura ambiente, senza agitazione.
2. Utilizzando una Pipetman P-200, trasferire i tessuti dissezionati di tampone di lavaggio (RT) utilizzando un altro punta gialla tagliata per 45 min. Il volume Limite di PLP trasferito a 50 microlitri per ridurre al minimo la diluizione del tampone di lavaggio. Nota: tutti i tessuti sezionati devono essere completamente sommerse.
3. Trasferire 20-30 insiemi di tessuto sezionato a 1,5 ml provetta da microcentrifuga. Nota: se un numero maggiore di complessi dischi occhio-antenne vengono combinati all'interno del tubo, vi è la possibilità che il tessuto nella parte inferiore del tubo non sarà esposto correttamente agli anticorpi. Per ottenere risultati ottimali, non più di 20-30 complessi disco occhio-antenne dovrebbero essere presenti all'interno di un singolo tubo. Il tessuto sezionato si depositerà sul fondo della provetta per microcentrifuga. Pertanto, in successive fasi di uSE una Pipetman per rimuovere e sostituire il tampone di lavaggio, soluzione bloccante, e gli anticorpi.
4. Rimuovere il tampone di lavaggio e sostituirlo con 100 ml di soluzione bloccante: il 10% di siero normale di capra in tampone di lavaggio. Incubare a RT con rotazione delicata su un rotatore tavolo per 10 min.
5. Rimuovere la soluzione di blocco e sostituirlo con 100 ml di anticorpi primari che sono stati opportunamente diluito in siero normale di capra al 10%. Incubare a RT con rotazione dolce per 16 ore.
6. Rimuovere gli anticorpi primari e sostituirlo con 750 ml di tampone di lavaggio. Inserire provette su un nutator e lasciare nutate a temperatura ambiente per 10 min. Nota: L'anticorpo primario può essere salvato (conservare a 4 ° C) e riutilizzato in seguito. Riutilizzo anticorpi più volte può aiutare a ridurre legame non specifico.
7. Consenti teste di depositarsi sul fondo della provetta, quindi rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 ml di anticorpi secondari che sono stati opportunamente diluiti in siero normale del 10%. Incubare a RT con rotazione delicato per 2̵1; 4 ore.
8. Rimuovere soluzioni anticorpo secondario da tessuto e sostituirlo con 500 ml di tampone di lavaggio. Lasciare tessuto di depositarsi sul fondo della provetta.
9. Uso di un P-200 e una punta di giallo taglio, trasferire tutti i tessuti sezionati a un pool di tampone di lavaggio che è stato messo sul piatto dissezione. Mentre procedere con la fase successiva di dissezione bene, il tessuto sarà incubare al tampone di lavaggio. Questo aiuta a rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso.

4. fine dissezione di Eye-antenne Disc Complessi e Montaggio su diapositive

1. Utilizzare un paio di pinze per stringere la cuticola dai ganci bocca con il lato ventrale del complesso rivolta verso il basso. Con una seconda coppia di pinze togliere le due lobi cerebrali chiudendo la seconda pinza nello spazio tra i dischi del cervello e degli occhi (Figura 3, freccia rossa) e rapidamente tirando il cervello lontano dai ganci bocca.
2. Continuando a tenere su i ganci bocca, un pizzico fuoriil tessuto più vicino possibile al collegamento tra la sezione antenne del disco oculare antenne ed i ganci bocca (Figura 3, blu freccia). Nota: i complessi del disco occhio-antenne dovrebbero essere liberi di tutti i tessuti (Figura 1A). Continuare fino a quando tutto il tessuto desiderato desiderato che può essere posizionato su vetrini è stato sezionato. Questo protocollo può essere adattato per isolare ala, haltere, gamba e dischi immaginali genitali (Figura 1B-E).
3. Aggiungere due piccoli pezzi di carta velina (dimensione del coprioggetto) circa 3. Parte sul piatto dissezione. Posizionare un vetrino sul piatto - i due pezzi di carta velina dovrebbero essere sotto le estremità del vetrino. Questo consentirà di evitare la diapositiva da attaccare alla base di silicone del piatto dissezione.
4. Uso di un P-20 con una punta tagliata, aggiungere 9 ml di un agente anti-sbiancante al centro del vetrino per microscopio. Questo impedisce sbiancamento del tessuto se visto con fluorescenteluce.
5. Utilizzando la stessa punta tagliata, raccogliere tutti i dischi degli occhi-antenne e aggiungerli alla goccia di reagente anti-imbianchimento. Ridurre al minimo la quantità di tampone di lavaggio che viene riportato. Cercare di limitare la quantità di tampone di lavaggio a 10 ml o meno.
6. Utilizzare un paio di pinze per separare e diffondere i dischi occhio-antenne all'interno della goccia di reagente anti-imbianchimento. Lasciare i dischi di incubare in reagente anti-imbianchimento per alcuni minuti. Nota: i dischi girare chiaramente come il tessuto assorbe il reagente anti-imbianchimento.
7. Utilizzando un pennello fine abbassare delicatamente un coprioggetto sul campione. Ciò impedisce la formazione di bolle d'aria.
8. Conservare scivola a -20 ° C fino al momento di visualizzare i dischi immaginali eye-antennali o altri che utilizzano la luce o la microscopia a fluorescenza.

Risultati

Il metodo descritto in precedenza in modo affidabile produce materiale di alta qualità per l'analisi con sonde in situ, giornalisti trascrizionali, trappole di proteine ​​e anticorpi. In figura 1 mostriamo dischi eye-antenna, genitali, ala, haltere e gambe che vengono regolarmente recuperati con questo metodo. Questi dischi sono stati trattati con un fluoroforo falloidina coniugato, che si lega alla F-actina e quindi delinea ogni cella. Se il tessuto è stato fissato correttamente allo...

Discussione

Anche se questa procedura è in gran parte concentrata sulla isolamento e successivo trattamento di dischi occhio-antenne, è suscettibile di essere utilizzato per isolare e analizzare l'ala, haltere, gamba e dischi genitali (Figura 4). L'unica modifica necessaria del protocollo per isolare questi dischi (in contrasto con il disco occhio-antenne) è il metodo della dissezione grossolana (sezione 2 del protocollo). La prima tappa (T1) coppia toracica si trova alla anteriore della larva e può ess...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150x20mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors	N/A	Used for fixation of imaginal disc complexes
50ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors	N/A
Small Stir Bar	Various Vendors	N/A	Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50ml Conical Tubes	Various Vendors	N/A
1.5ml Microfuge Tubes	Various Vendors	N/A	Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors	N/A
Benchtop Rotator	Various Vendors	N/A	100ul volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum`	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Seondary Antibodies	Various Vendors	N/A	Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18x18mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors	NA	Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors	NA	Use to gently lower coverslip on to samples