JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

باستخدام ميكروأرس البروتين تحتوي على ما يقرب من S. كامل تم بحثها الخباز بروتيوم للاستجواب غير متحيز السريع الآلاف من تفاعلات البروتين البروتين بشكل متواز. هذه الطريقة يمكن استخدامها ل-بروتين صغير جزيء أو تعديل posttranslational، وفحوصات أخرى في الإنتاجية العالية.

Abstract

يتم فحص عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية تحتوي على ~ 4200 البروتينات الخميرة المؤتلف للتفاعل بروتين كيناز البروتين باستخدام الخميرة تقارب تنقية بروتين كيناز الانصهار التي تحتوي على علامة V5-حاتمة لقراءة إجراءات المغادرة. يتم الحصول على كيناز النقاء من خلال ثقافة سلالة الخميرة الأمثل للنسخة عالية إنتاج البروتين إيواء البلازميد التي تحتوي على الانصهار كيناز-V5 بناء تحت غال المروج محرض. ويزرع الخميرة في وسائل الإعلام تقييدا ​​مع مصدر الكربون لمدة 6 ساعة تليها التعريفي مع 2٪ سكر اللبن. وبعد ذلك، يتم حصاد ثقافة ويتم تنقيته كيناز باستخدام تقنيات الكروماتوغرافي تقارب القياسية للحصول على بروتين كيناز العالية النقاء لاستخدامها في فحص. غير المخفف كيناز النقاء مع العازلة كيناز إلى مجموعة مناسبة للمقايسة ويتم حظر ميكروأرس البروتين قبل التهجين مع ميكروأري البروتين. بعد التهجين، وحققت في المصفوفات مع وحيدة النسيلة V5 antibODY لتحديد البروتينات ملزمة البروتين كيناز-V5. وأخيرا، يتم فحص صفائف باستخدام الماسح الضوئي ميكروأري القياسية، ويتم استخراج البيانات للتحليل المعلوماتية المصب 1،2 لتحديد ثقة عالية مجموعة من التفاعلات البروتينية للتحقق من صحة المصب في الجسم الحي.

Introduction

وقد أدت الحاجة إلى إجراء تحليلات عالمية الكيمياء الحيوية البروتين والنشاط في الجسم الحي ملزمة في تطوير أساليب جديدة لالتنميط البروتين البروتين التفاعلات (مثبطات مضخة البروتون) والتعديلات بعد متعدية من proteomes كلها 1،3-8. يتم تصنيع البروتين المجهرية كما المجهرية وظيفية البروتين باستخدام كامل طول البروتينات الوظيفية 4-6،8،9، أو ميكروأرس البروتين التحليلية التي تحتوي على أجسام مضادة 10،11. صممت انها تحتوي على كثافة عالية من البروتينات المحتشدة على الشرائح المجهر مع مجموعة متنوعة من كيمياء السطح لتسهيل مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية اللازمة لإجراء واسعة النطاق البيوكيميائية تحليل 12. النيتروسليلوز وسطح ألدهيد كيمياء لمرفق الكيميائية من خلال يسين أو مرفق تقارب أساليب مثل الشرائح بالكلاب النيكل لربط البروتينات صاحب الموسومة والجلوتاثيون لمرفق تقارب بين الآخرين 13.

استخدام ميكروأرس البروتين وظيفية للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات يتطلب الوصول إلى ذات جودة عالية مكتبة بروتين وظيفي 14. S. الخباز غير قابلة للإنتاج مثل هذه المكتبة من خلال المزاوجة بين عالية نسخة تقارب الموسومة يبني البروتين مع الإنتاجية العالية تقنيات تنقية الكروماتوغرافي. وقد التسلسل الغالبية العظمى من الجينوم الخميرة ويمكن التعبير عن ما يقرب من بروتيوم كامل من البلازميد عالية نسخة لتنقية والكيمياء الحيوية ويحلل 12. مرة واحدة يتم الحصول على البروتينات والمحتشدة في شكل 384 بشكل جيد، يتم طباعتها على شريحة المجهر السماح للالموازي تحليل الكيمياء الحيوية متعددة حدودي السريع والاستجواب بيوينفورمتيك 8،14-16. وقد استخدمت المجهرية البروتين لفحوصات الأنزيمية وتفاعلات مع البروتينات، والدهون، والجزيئات الصغيرة، والأحماض النووية بين العديد من التطبيقات الأخرى. سهولة الحصول على البروتينات على سطح بروتيومصفائف جعلها قابلة للأنواع المختلفة من الكشف التحليلي بما في ذلك، المناعة تقارب، سطح مأكل مثل الطحين الرنين، مضان والعديد من التقنيات الأخرى. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لمراقبة دقيقة للحالة تجريبية حيث أنه قد يكون من الصعب القيام به في الجسم الحي.

والهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على الاستخدام المناسب للميكروأرس البروتين وظيفية للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات. هذا التطبيق يتيح تحليل الكيمياء الحيوية مواز عالية الإنتاجية من الأنشطة بروتين ملزمة باستخدام تحليلها عالي النقاء (البروتين) من الفائدة. الموسومة A-C محطة (كربوكسي المحطة الطرفية) تنتج V5 الانصهار بروتين الطعم من الاهتمام من البلازميد عالية نسخة في سلالة الخميرة الأمثل لتنقية البروتين. محطة C علامات يضمن أن بروتين كامل طول تمت ترجمة. البروتين المستخدم في هذه الدراسة هو Tda1-V5 انصهار بروتين كيناز، والتي يتم تنقيته باستخدام الراتنج النيكل تقارب عبر علامة His6X. وTda1-V5 الانصهار CONSTRUCيتم تنقيته من خلال ر شطف التسلسلي باستخدام التدرج إميدازول إلى أزل جزء الأكثر عالي التخصيب لاستخدامه في الفحص.

Protocol

1. التحقيق التحضير

  1. الثقافة وتنقية تحقيقات كيناز V5 الانصهار تستخدم لدراسة التفاعل مع بروتينات أخرى على النحو التالي:
    1. استخدام يشوبه طازجة الخميرة سلالة Y258 (ماتا pep4-3، his4-580، ura3-53، leu2-3،112) التي تحتوي على البروتين V5 الانصهار (معبرا عنها من GATEWAY ناقلات pYES-DEST52). استخدام البروتين معزولة كما المسبار على المجهرية. لوحة الخميرة على الاصطناعية كاملة-اليوراسيل (SC-أورا) / 2٪ سكر العنب / آجار وينمو بمعدل 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام من ثقافة المجمدة (-80 ° C الجلسرين الأسهم).
    2. تطعيم الثقافات كاتب (5-20 مل) من مستعمرة واحدة وتنمو بين عشية وضحاها في SC-أورا / 2٪ سكر العنب على منصة تهتز (220-250 دورة في الدقيقة) أو عجلة في 30 ° C.
    3. في صباح اليوم التالي، تطعيم 400 مل للأورا SC / 2٪ ثقافة رافينوز مع ثقافة كافية بداية إلى OD النهائي 600 من 0.1.
    4. زراعة اللقاح إلى OD 600 من 0.6 يليه اللبن تحريض فو V5-كينازسيون بناء التعبير بإضافة محلول مستخلص الخميرة 3X / ببتون (YEP) تستكمل مع 6٪ سكر اللبن، وذلك بإضافة ما يكفي لتخفيف وسائل الإعلام تحريض من قبل عامل من 3 بحيث التركيز النهائي من اللبن هو 2٪.
    5. تحريض الخلايا على 30 درجة مئوية لمدة 6 ساعات على منصة تهتز. استخدام 2 L دورق مخروطي لضمان التهوية المناسبة.
    6. حصاد الخلايا باستخدام JA-10 (أو مشابه) الدوار من خلال الدوران 400 مل من تعليق خلية في 1000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. غسل خلايا مرة واحدة مع 50 مل من الجليد PBS الباردة العازلة ونقل إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. يغسل بيليه مرة أخرى في الجليد العازلة PBS الباردة (بدون المنظفات أو غيرها من المواد المضافة) المستخدمة للتحلل ونقل إلى 2 مل الإضافية غطاء أنابيب للتحلل.
    8. تدور الخلايا في 20000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية لبيليه وماصة بعيدا العازلة.
    9. وضع أنابيب على الجليد والمضي قدما في خطوة تحلل.
    10. ليز الخلايا (250-350 ميكرولتر بيليه) مع 00.5 مم حبات زركونيا في 1: 1: 1 حجم بيليه الخلية، والخرز، والمالحة الفوسفات مخزنة (PBS) تحلل العازلة ودوامة الخليط باستخدام منصة التحريض 3 مرات في 2 دقيقة فترات في 4 ° C.
    11. الطرد المركزي المحللة في 20000 x ج في microfuge الطاولة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    12. ماصة طاف في البولي سرعة عالية أنبوب الطرد المركزي وتوضيح من قبل ulracentrufugation لمدة 30 دقيقة في 150000 XG في 4 درجات مئوية.
    13. نقل المحللة أوضح أن أنبوب يحتوي على prewashed ني 2+ راتنج تقارب (~ 100 ميكرولتر) واحتضان على nutator لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية لالتقاط الحامض الأميني (صاحب) 6X الموسومة البروتين V5 الانصهار.
    14. غسل الراتنج ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية مع الاحتياطي اغسل. بيليه الراتنج باستخدام أجهزة الطرد المركزي أعلى الجدول لمدة 5 دقائق في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، ونضح طاف. إضافة غسل العازلة جديدة لكل غسل وإعادة الأنبوب nutator عن الانفعالات خلال يغسل.
    15. بعد غسل الظريفملاحظة كاملة، تطبيق الراتنج غسلها إلى الطازج العمود G-25 للشطف.
    16. تطبيق 25 ميكرولتر من شطف العازلة بطريقة تدريجية بدءا من 100 ملم إلى 500 ملم إيميدازول إميدازول في 50 الزيادات ملم ليصبح المجموع 9 الكسور.
    17. مقايسة الكسور جمعها باستخدام هلام دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) وتلطيخ coomassie للتعرف على جزء الأكثر التخصيب (ق) لاستخدامها في فحص وإضافة الجلسرين إلى 30٪ وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها في فحص.

2. جس صالحة

ملاحظة: الرجاء راجع الخطوة 2.6 من هذا القسم لإعداد الحل الضد قبل البدء في الفحص.

  1. للكشف عن التفاعلات، وتمييع للV5 fluorophore الأجسام المضادة مترافق (أي AlexaFluor 647) إلى 260 نانوغرام / مل في المخزن التحقيق ومزيج دقيق من قبل تهتز.
    ملاحظة: يعد هذا الحل الأجسام المضادة 30 دقيقة قبل الاستخدام ووضع أنبوب على nutatأو أو عجلة لضمان خلط كاملة وتعليق متجانسة من الأجسام المضادة.
  2. تمييع V5 الانصهار البروتين التحقيق على نطاق وتركيز 5-500 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: محسن لكل البروتين البروتين التفاعل الفحص، وذلك باستخدام العازلة التحقيق. الأمثل ينطوي على إضافة المزيد من تحقيقات للتحقيق العازلة. وعادة ما تستخدم 10 ميكروغرام / مل كنقطة انطلاق وتبعا لذلك يعتمد على قوة الإشارة.
  3. إزالة ميكروأرس البروتين من الفريزر (-20 ° C) وتقديمهم إلى 4 درجات مئوية في الثلاجة مباشرة قبل استخدامها.
  4. إضافة عازلة تمنع مباشرة لصاحب الشريحة التي تحتوي على البروتين وmicorarrays تغطية الجزء العلوي مع parafilm لمنع التسرب. منع صفائف في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة عن طريق هز في 50 دورة في الدقيقة على خشبة المسرح في 4 ° C.
  5. بعد حجب، ونقل صفائف إلى غرفة ترطيب المبردة إلى 4 درجات مئوية، وإضافة 90 ميكرولتر من التحقيق المخفف مباشرة إلى السطح مجموعة. تراكب آرآيس مع زلة رافع المطروحة واحتضان ثابت (لا الهز) في غرفة ترطيب عند 4 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  6. غسل صفائف 3 مرات لمدة 1 دقيقة لكل منهما في المخزن التحقيق في ثلاثة أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة الشريحة لأنابيب مخروطية تحتوي على ما يكفي عازلة التحقيق قبل المبردة إلى مغلف تماما الشريحة. السماح للانزلاق رافع إلى الشريحة بلطف من ميكروأري البروتين (لا قوة تشغيله لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف سطح مجموعة).
  7. تطبيق حل الضد مباشرة إلى مجموعة مباشرة بعد الانتهاء من غسل (الخطوة 2.5) وتراكب مع زلة رافع أثار كما كان من قبل. احتضان المصفوفات لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب.
  8. أداء نفس الخطوة غسل كما كان من قبل (3 مرات 1 دقيقة في المخزن التحقيق)، وتدور في أنبوب مخروطي 50 مل في 800 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الهواء الجاف صفائف في حامل الشرائح في الظلام لمدة 30 دقيقة قبل مسح مجموعة في 647 نانومتر.

النتائج

وقد لوحظ نشاط تفاعل البروتين البروتين باستخدام قارئ رقاقة القياسية لتقييم Tda1-V5 بروتين كيناز الانصهار بناء على أنه بروتين الطعم ضد الخميرة وظيفية ميكروأري البروتين تحتوي على ما يقرب من 4200 فريدة من نوعها S. الخباز البروتينات GST الانصهار. مزيد من الاستجواب مع البرن...

Discussion

بروتوكول المعروضة تم إجراء الأصل باستخدام 85 فريدة من نوعها بروتين الخميرة بروتينات كيناز-V5 الانصهار للمقارنة بين النشاط ملزم بين عائلات متميزة وذات الصلة تحركات البروتينات الخميرة مما أدى إلى التعرف على شبكات التفاعل كيناز جديدة في الجسم الحي 1. كتكنولوج...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Petri DishesVWRNC-10747or comparable
Bacto yeast extractDifco0217-17
Bacto peptoneDifco0118-17
Bacto agarDifco0140-01
DextroseSigmaD9434
RaffinoseSigmaR0514
GalactoseSigmaG0750
Sc-Ura drop out mediaMP Bio114410622
Small Culture tubesVWR/Fisher
Large Erlenmeyer FlaskVWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 ml)
Falcon tube (50 ml)VWR/Fisher21008-951
PBS TabletsSigmaP4417
FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube)
FastPrep MachineMP Biomedicals116004500
Zircon BeadsBioSpec11079105
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266 
NaClSigmaS3014 
Imidazole (pH = 7.4)SigmaI5513 
PMSFSigma93482
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)Roche11873580001
Phosphatase inhibitor cocktail 1sigmaP2850
BSASigmaA2153 
Tween-20SigmaP1379 
ATPSigmaA1852 
Shaking Incubator (30 °C)
Nickel Affinity ResinLife TechnologiesR901-01
G25 columnGE life sciences27-5325-01 
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
Monoclonal V5 AntibodyLife TechnologiesR960-25
Alexa647 Tagged monoclonal V5 AntibodyLife Technologies451098
Protein Microarrays KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix ScannerMolecular Devices
Lifter SlipsThomas Scientifichttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF  (add just prior to use)		Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSAAdd the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use)Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and  60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) Galactose should not be autoclaved

References

  1. Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
  2. Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
  3. Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
  4. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  5. Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  7. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
  8. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
  9. Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
  10. Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
  11. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
  12. Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
  13. Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
  14. Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
  15. Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
  16. Im, H., Snyder, M., Coligan, J. E., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. 27, Unit 27 24 (2013).
  17. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

102

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved