Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

Resumo

Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.

Resumo

Microarrays proteicos funcionais de alta densidade contendo ~ 4200 proteínas de levedura recombinantes são examinados para interacções proteína-proteína-quinase, utilizando uma proteína de fusão purificada por afinidade, de levedura de quinase contendo uma etiqueta de epitopo-V5 para read-out. Quinase purificada é obtida através da cultura de uma estirpe de levedura optimizado para a produção de proteínas de cópias elevado contendo um plasmídeo contendo uma fusão de quinase-V5 construir sob um promotor GAL indutível. A levedura é cultivada em meios restritiva com uma fonte de carbono neutro durante 6 horas, seguido por indução com galactose a 2%. Em seguida, a cultura é colhida e quinase é purificado usando técnicas cromatográficas padrão de afinidade para se obter uma proteína-quinase de elevada pureza para utilização no ensaio. A quinase purificada é diluída com tampão de quinase de um conjunto adequado para o ensaio e os microarrays da proteína estão bloqueados antes da hibridação com o microarray da proteína. Após a hibridação, as matrizes são sondados com V5 monoclonal ANTIBody para identificar proteínas ligadas pela proteína cinase-V5. Finalmente, as matrizes são digitalizados utilizando um scanner de microarray padrão, e os dados são extraídos para a análise informática jusante ^1,2 para determinar uma confiança elevada conjunto de interacções de proteínas a jusante para validação in vivo.

Introdução

A necessidade de se realizar análises globais de bioquímica de proteínas e actividade in vivo de ligação resultou no desenvolvimento de novos métodos para perfilar as interacções proteína-proteína (IBP) e as modificações pós-traducionais de proteomas inteiros ^1,3-8. Microarrays da proteína são fabricados como microarrays funcionais de proteínas utilizando proteínas funcionais full-length ^4-6,8,9, ou microarrays da proteína analíticas contendo anticorpos ^10,11. Eles foram concebidos para conter uma elevada densidade de proteínas dispostas em lâminas de microscópio com uma variedade de químicas de superfície para facilitar uma variedade de condições experimentais necessários para a realização de uma ampla análises bioquímicas ^12. Nitrocelulose e de superfície aldeído químicas para fixação química através de métodos de lisina ou de fixação de afinidade, tais como lâminas de quelatos de níquel para a fixação de proteínas His-tag e glutationa para fixação afinidade entre outros ^13.

A utilização de microarranjos de proteínas funcionais para detectar interacções proteína-proteína requer acesso a uma biblioteca de proteínas de alta qualidade funcional ^14. S. cerevisiae é favorável à produção de uma tal biblioteca através do emparelhamento de afinidade de elevada cópia etiquetados com construções de proteínas de alto rendimento técnicas de purificação cromatográfica. A grande maioria do genoma da levedura foi sequenciado e quase todo o proteoma pode ser expresso a partir de um plasmídeo de elevado número de cópias para a purificação e análises bioquímicas ^12. Uma vez que as proteínas são obtidas e dispostos em formato de 384 poços, eles são impressas em uma lâmina de microscópio permitindo a análise bioquímica rápida paralelo multi-paramétricos e interrogatório bioinformática ^8,14-16. Protein microarrays foram utilizadas para ensaios enzimáticos e interacções com proteínas, lípidos, moléculas pequenas, e ácidos nucleicos, entre muitas outras aplicações. A acessibilidade de proteínas na superfície de proteomamatrizes de torná-los passíveis de diferentes tipos de detecção analítica, incluindo imuno-afinidade, Surface Plasmon Resonance, fluorescência e muitas outras técnicas. Além disso, permite o controle preciso da condição experimental, onde ele pode ser difícil de fazer in vivo.

O objectivo deste protocolo é para demonstrar o uso apropriado de microarrays de proteína funcionais para detectar interacções proteína-proteína. Esta aplicação permite a análise bioquímica paralela de alta taxa de transferência de actividades de ligação de proteínas utilizando uma substância altamente purificado (proteína) de interesse. Um C-terminal (C-terminal) com a etiqueta de proteína isco V5-fusão de interesse é produzida a partir de um plasmídeo de elevado número de cópias numa estirpe de levedura optimizado para a purificação de proteínas. Marcação de C-terminal assegura que a proteína de comprimento completo foi traduzido. A proteína utilizada no presente estudo é Tda1-V5 proteína de fusão de cinase, que é purificado utilizando resina de afinidade de níquel através de uma marcação His6X. A construç fusão Tda1-V5t é purificado através de eluição em série, utilizando um gradiente de imidazole para eluir a fracção mais altamente enriquecida para uso no ensaio.

Protocolo

1. Preparação Probe

1. Cultura e purificar as sondas V5-quinase de fusão usados ​​para examinar as interacções com outras proteínas, como segue:
   1. Use recém-riscado estirpe Y258 levedura (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contendo proteína V5-fusão (expressa a partir pYES-DEST52 vetor gateway). Use a proteína isolada como sonda sobre os microarrays. A chapa completa de levedura-uracilo sintético (Sc-Ura) / 2% de dextrose / Agar e crescer a 30 ° C durante 3 dias de cultura congelada (-80 ° C em glicerol).
   2. Inocular culturas de arranque (5-20 ml) a partir de uma única colônia e crescer durante a noite em Sc-Ura / 2% de dextrose em plataforma de agitação (220-250 rpm) ou roda a 30 ° C.
   3. Na manhã seguinte, inocular 400 ml de SC-ura / 2% de rafinose cultura com cultura fermento suficiente para um OD ₆₀₀ de 0,1 definitiva.
   4. Cresça os inóculos para _DO600 de 0,6, seguido pela indução de galactose do fu V5-cinasesion construção de expressão por adição de uma solução de extracto de levedura 3x / Peptona (YEP) suplementado com 6% de galactose, através da adição de suficiente para diluir o meio de indução por um factor de 3 de modo a que a concentração final de 2% de galactose é.
   5. Induzir as células a 30 ° C durante 6 horas na mesa vibratória. Usar um balão de Erlenmeyer de 2 L para garantir arejamento adequado.
   6. Células colheita utilizando um JA-10 (ou equivalente) do rotor de fiação de 400 ml de suspensão de células a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
   7. Lavar as células uma vez com 50 ml de tampão gelado PBS e transferir para um tubo de 50 ml. Lave o pellet novamente em tampão PBS frio gelo (sem detergentes ou outros aditivos) utilizados para a lise e transferência de 2 ml snap-cap tubos para a lise.
   8. Rodar as células a 20.000 xg durante 1 min a 4 ° C, a uma pelete e a pipeta de distância tampão.
   9. Coloque os tubos em gelo e continue com a etapa de lise.
   10. Lisar as células (pelete de 250-350 uL) com 00,5 milímetros esferas de zircónia em um 1: 1: 1 de volume de sedimento celular, os grânulos, e solução salina tamponada com fosfato (PBS) de tampão de lise e vórtice a mistura utilizando uma plataforma de agitação 3 vezes em intervalos de 2 min a 4 ° C.
   11. Centrifugar o lisado a 20.000 x g numa microcentrífuga mesa durante 10 min a 4 ° C.
   12. Pipeta sobrenadante para um tubo de centrífuga de policarbonato de alta velocidade e por esclarecer ulracentrufugation durante 30 minutos a 150.000 x g a 4 ° C.
   13. Transferir o lisado clarificado para um tubo contendo resina de afinidade de Ni ²⁺ pré-lavada (~ 100 mL) e incuba-se em um nutator durante 2 horas a 4 ° C para capturar Histidina (His) 6X com etiquetas V5-proteína de fusão.
   14. Lavou-se a resina três vezes durante 10 min a 4 ° C com tampão de lavagem. Pellet da resina utilizando uma centrífuga de topo de mesa durante 5 min a 1000 xg, a 4 ° C e aspirar o sobrenadante. Adicionar tampão de lavagem fresca para cada lavagem e devolver o tubo do nutator para a agitação durante a lavagem.
   15. Após a lavagem steps estão completos, aplicar a resina é lavada para uma nova coluna G-25 para a eluição.
   16. Aplicar 25 ul de tampão de eluição de uma forma passo a passo começando com imidazole 100 mM a 500 mM de imidazole em incrementos de 50 mm, para um total de 9 fracções.
   17. Ensaio das fracções recolhidas utilizando gel de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida (SDS-PAGE) e coloração com Coomassie para identificar a fracção (s) mais altamente enriquecida para utilização no ensaio e adicionar glicerol a 30% e armazenar a -80 ° C até serem usadas no ensaio.

2. Sondagem os Arrays

NOTA: Por favor consulte o passo 2.6 desta seção para preparar a solução de anticorpos antes de iniciar o ensaio.

1. Para detectar interacções, dilui-se o conjugado anticorpo-V5 fluoróforo (isto é AlexaFluor 647) a 260 ng / ml em tampão de sonda e homogeneizar por agitação.
   NOTA: Preparar esta solução de anticorpo 30 minutos antes da utilização e colocar o tubo sobre um nutatou ou roda para assegurar a mistura completa e uma suspensão homogénea de anticorpo.
2. Dilui-se a sonda de proteína V5-fusão numa gama de concentrações de 5-500 ug / ml.
   NOTA: optimizada para cada ensaio de interacção proteína-proteína, usando tampão de sonda. Optimization envolve a adição de mais sondas para sondar buffer. Tipicamente, 10 ug / ml é utilizada como ponto de partida e ajustado em conformidade com base na intensidade do sinal.
3. Remover os microarrays da proteína a partir do congelador (-20 ° C) e trazer a 4 ° C no frigorífico imediatamente antes da utilização.
4. Adicionar tampão de bloqueio directamente para o porta-lâminas contendo as proteínas micorarrays e cobrir o topo com parafilme para evitar fugas. Bloquear as matrizes em tampão de bloqueio durante 1 hora, agitando a 50 rpm em uma fase, a 4 ° C.
5. Após o bloqueio, as matrizes de transferência para uma câmara humidif içada arrefecida a 4 ° C, e adicionar 90 ul de sonda diluída directamente para a superfície da matriz. Overlay o arrays com um deslizamento levantador levantada e incubar estático (sem agitação) na câmara humidificada a 4 ° C durante 1,5 h.
6. Lavam-se as matrizes de três vezes durante 1 min cada em tampão de sonda em três tubos de 50 mL cónicos. Adicionar o slide para tubos cônicos contendo tampão sonda pré-refrigerados suficiente para envolver completamente o slide. Permitir que o deslizamento levantador para deslizar suavemente fora do microarray proteína (não forçá-lo, pois isso pode resultar em danos à superfície da matriz).
7. Aplique a solução de anticorpo diretamente a matriz imediatamente após a conclusão da lavagem (passo 2.5) e sobreposição com um deslizamento levantador criado como antes. Incubar as matrizes durante 30 min a 4 ° C na câmara humidificada.
8. Execute o mesmo passo de lavagem como anteriormente (3 vezes 1 min em tampão de sonda), e centrifugação num tubo de 50 ml a 800 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min à temperatura ambiente. Secar as matrizes em um suporte de slides no escuro por 30 minutos antes de a digitalização da matriz em 647 nm.

Resultados

A actividade de interacção proteína-proteína foi observada usando um leitor de chip padrão para avaliar a Tda1-V5 proteína quinase construção de fusão como uma proteína de isco contra um microarray proteico funcional levedura contendo aproximadamente 4200 único S. proteínas de fusão com GST cerevisiae. Além disso interrogatório com o software GenePix revelou uma infinidade de eventos de diferentes intensidades de ligação. A afinidade foi medida a partir da intensidade do sinal graduada...

Discussão

O protocolo apresentado foi inicialmente realizada usando 85 proteínas de fusão de cinase-V5 únicas proteínas de levedura para comparar a actividade de ligação entre as famílias distintas e relacionadas de proteína-quinases de levedura, resultando na identificação de novas redes de interacção quinase in vivo ^1. Como uma tecnologia de criação de perfil proteômica emergentes, o desenvolvimento de Alto Rendimento (HTP) rastreio de proteomas usando microarrays da proteína contavam com bib...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes	VWR	NC-10747	or comparable
Bacto yeast extract	Difco	0217-17
Bacto peptone	Difco	0118-17
Bacto agar	Difco	0140-01
Dextrose	Sigma	D9434
Raffinose	Sigma	R0514
Galactose	Sigma	G0750
Sc-Ura drop out media	MP Bio	114410622
Small Culture tubes	VWR/Fisher
Large Erlenmeyer Flask	VWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 ml)
Falcon tube (50 ml)	VWR/Fisher	21008-951
PBS Tablets	Sigma	P4417
FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube)
FastPrep Machine	MP Biomedicals	116004500
Zircon Beads	BioSpec	11079105
Triton X100	Sigma	P4417
DTT	Sigma	D9779
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S3014
Imidazole (pH = 7.4)	Sigma	I5513
PMSF	Sigma	93482
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)	Roche	11873580001
Phosphatase inhibitor cocktail 1	sigma	P2850
BSA	Sigma	A2153
Tween-20	Sigma	P1379
ATP	Sigma	A1852
Shaking Incubator (30 °C)
Nickel Affinity Resin	Life Technologies	R901-01
G25 column	GE life sciences	27-5325-01
Nutator	VWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)	Life Technologies
Coomassie Blue Stain	Life Technologies
Monoclonal V5 Antibody	Life Technologies	R960-25
Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody	Life Technologies	451098
Protein Microarrays Kit	Life Technologies	PAH0525013
Genepix Scanner	Molecular Devices
Lifter Slips	Thomas Scientific		http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF  (add just prior to use)			Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20			Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA			Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2			Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use)			Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and  60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol)			Galactose should not be autoclaved