タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

要約

ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。

要約

〜4,200組換え酵母タンパク質を含む高密度機能タンパク質マイクロアレイは、読み出しのためのV5エピトープタグを含むアフィニティー精製酵母キナーゼ融合タンパク質を用いてキナーゼタンパク質 - タンパク質相互作用のために検査されます。精製されたキナーゼは、GAL、誘導性プロモーター下キナーゼ-V5融合構築物を含むプラスミドを有する高コピータンパク質産生のために最適化された酵母株の培養により得られます。酵母は2％ガラクトースで誘導し、続いて6時間、中性の炭素源と制限された培地中で成長させます。次に、培養物を回収し、キナーゼアッセイにおける使用のための高度に精製されたタンパク質キナーゼを得るために、標準的なアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて精製します。精製されたキナーゼアッセイのために適切な範囲のキナーゼ緩衝液で希釈し、タンパク質マイクロアレイは、タンパク質マイクロアレイにハイブリダイゼーションの前にブロックされます。ハイブリダイゼーション後、アレイをモノクローナルV5 antibでプローブしますキナーゼV5タンパク質によって結合したタンパク質を同定するODY。最後に、アレイは、標準的なマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンされ、データは、インビボでの下流の検証のためのタンパク質の相互作用の高い信頼度のセットを決定するために、下流インフォマティクス分析^1,2のために抽出されます。

概要

タンパク質生化学およびインビボでの結合活性のグローバル分析を実行する必要性は、タンパク質-タンパク質相互作用（のPPI）と全プロテオーム^1,3-8の翻訳後修飾をプロファイリングするための新たな方法の開発をもたらしました。タンパク質マイクロアレイは、全長機能タンパク質^4-6,8,9、または抗体^10,11を含む分析タンパク質マイクロアレイを用いた機能性タンパク質マイクロアレイとして製造されています。これらは^、12を解析幅広い生化学的に行うために必要な実験条件の多様を容易にするために、表面化学の様々な顕微鏡スライド上に配列されたタンパク質の高濃度を含むように操作されています。リジンを介して化学結合またはそのような他の¹³の中親和性結合のためのHisタグ付きタンパク質およびグルタチオンを取り付けるためのニッケルキレート化スライドのような親和性結合方法のためのニトロセルロースとアルデヒド表面化学。

タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための機能的なタンパク質マイクロアレイの使用は、高品質な機能性タンパク質のライブラリ¹⁴へのアクセスを必要とする。S.セレビシエは、ハイスループットクロマトグラフィー精製技術とタンパク質構築物をタグ付けし、高コピー親和性の対形成により、このようなライブラリーを作製に適しています。酵母ゲノムの大部分が、配列決定されており、ほぼ全プロテオームの精製および生化学^12を分析するための高コピープラスミドから発現させることができます。タンパク質が得られ、384ウェル形式に配列されると、それらは迅速なパラレルマルチパラメトリック生化学分析およびバイオインフォマティクス尋問^8,14-16を可能に顕微鏡スライド上にプリントされています。タンパク質マイクロアレイは、タンパク質、脂質、小分子、および他の多くの用途の中で核酸と酵素アッセイと相互作用するために使用されています。プロテオームの表面上のタンパク質のアクセシビリティアレイは、免疫​​親和性などの分析的検出の異なるタイプにそれらを敏感に反応する表面プラズモン共鳴、蛍光、および多くの他の技術を表面。また、それは、生体内で行うのは難しいかもしれない実験条件の微調整を可能にします。

このプロトコルの目的は、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、機能性タンパク質マイクロアレイの適切な使用を実証することです。このアプリケーションは、目的の高度に精製された分析物（タンパク質）を用いてタンパク質結合活性のハイスループット並列生化学的解析を可能にします。 C末端（カルボキシ末端）は、関心のV5融合ベイトタンパク質は、タンパク質精製のために最適化された酵母株における高コピープラスミドから生成されるタグ付き。 C末端タグは、全長タンパク質が翻訳されていることを保証します。この研究で使用されるタンパク質は、His6Xタグを介して、ニッケル親和性樹脂を用いて精製するTda1-V5融合タンパク質キナーゼです。 Tda1-V5融合constructは、アッセイで使用するための最も高度に濃縮された画分を溶出するためにイミダゾール勾配を使用して、シリアル溶出により精製されます。

プロトコル

1.プローブの準備

1. 培養し、以下のように他のタンパク質との相互作用を調べるために使用されるV5融合キナーゼプローブを精製します。
   1. 新しく作製した酵母株Y258を使用します（マタpep4-3、his4-580、ura3-53、leu2-3,112）（GATEWAYベクターpYES-DEST52から発現）V5融合タンパク質を含みます。マイクロアレイ上のプローブとして単離されたタンパク質を使用してください。合成完全ウラシル（SC-URA）/ 2％ブドウ糖/寒天に酵母をプレートと凍結培養（-80°Cグリセロールストック）から3日間30℃で成長します。
   2. 単一コロニーからスターター培養物（5〜ml）を接種し、30℃でのプラットフォーム（220〜250 RPM）やホイールを振るのSC-URA / 2％デキストロース中で一晩成長します。
   3. 翌朝は、0.1の最終OD ₆₀₀に十分なスターター培養物を皮下-URA / 2％のラフィノース文化の400ミリリットルを接種します。
   4. 0.6の_600は V5-キナーゼのfuのガラクトース誘導に続いてODまで接種を育てますシオンガラクトースの最終濃度が2％になるように3倍の誘導培地を希釈するのに十分に添加することにより、6％ガラクトースを補った3×酵母抽出物/ペプトン（YEP）の溶液を添加することによって表現を構築します。
   5. 振盪プラットフォーム上で6時間30℃で細胞を誘導します。適切な通気を確保するために2 L三角フラスコを使用してください。
   6. 4℃で5分間、1000×gで細胞懸濁液を400mlの紡糸によってJA-10（または同等の）ローターを用いて収穫細胞。
   7. 氷冷PBS緩衝液50mlで細胞を1回洗浄し、50mlコニカルチューブに移します。溶解のためのチューブキャップスナップ2ミリリットルに溶解し、転送に使用（洗剤または他の添加剤なし）の氷冷PBS緩衝液で再びペレットを洗浄。
   8. ペレットとピペット離れバッファに4℃で1分間20,000×gで細胞をスピン。
   9. 氷の上にチューブを置き、溶解ステップに進みます。
   10. 0の細胞を溶解（250〜350μlのペレット）1：1 0.5ミリメートルのジルコニアビーズ1細胞ペレットの体積、ビーズ、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶解緩衝液と4℃で2分間隔で3回攪拌プラットフォームを用いて混合物をボルテックス。
   11. 4℃で10分間、卓上微量20,000×gで溶解物を遠心します。
   12. ピペットポリカーボネート高速遠心チューブに上清を4℃で15万×gで30分間ulracentrufugationにより明確にします。
   13. ヒスチジンをキャプチャするために4℃で2時間、ニューテーター上で予備洗浄のNi ²⁺親和性樹脂（〜100μl）を含むチューブに清澄化ライセートを移し、インキュベート（彼の）6XがV5融合タンパク質をタグ付けしました。
   14. 洗浄緩衝液で4℃で10分間樹脂を3回洗浄します。 4℃、1,000×gで5分間、卓上遠心機を用いて樹脂をペレット化し、上清を吸引します。各洗浄のために新鮮な洗浄緩衝液を添加し、洗浄の間にチューブを攪拌するための旋回装置を返します。
   15. 洗浄後のSTEPSは、溶出のために新たにG-25カラムに洗浄した樹脂を適用し、完了しています。
   16. 9画分の合計のための50mM刻みで500 mMイミダゾールに100 mMのイミダゾールで始まる段階的に溶出バッファー25μlのを適用します。
   17. アッセイアッセイで使用するための最も高度に濃縮された画分を同定し、に使用するまで-80℃で30％ストアにグリセロールを添加することがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）およびクーマシー染色を用いて回収した画分アッセイ。

2.アレイのプロービング

注：このアッセイを開始する前に、抗体溶液を調製するために、このセクションのステップ2.6を参照してください。

1. 相互作用を検出するために、プローブ·バッファ内の260 ng / mlでのV5 -フルオロフォアコンジュゲート抗体（ すなわちのAlexaFluor 647）を希釈し、振とうして十分に混合します。
   注：使用してnutatにチューブを配置する30分前に、この抗体溶液を準備しますやホイール完全混合し、抗体の均質な懸濁液を確保します。
2. 5-500 / mlの濃度範囲にわたってV5融合タンパク質プローブを希釈します。
   注：プローブ緩衝液を用いて、各タンパク質 - タンパク質相互作用アッセイのために最適化。最適化は、バッファをプローブするための複数のプローブを加えることを含みます。典型的には10μg/ mlの出発点として使用され、信号強度に基づいて、それに応じて調整されます。
3. 冷凍庫（-20℃）からタンパク質マイクロアレイを削除し、使用直前に冷蔵庫に4℃にもたらします。
4. タンパク質micorarraysを含むスライドホルダーに直接ブロッキングバッファー追加し、漏出を防ぐためにパラフィルムでトップをカバーしています。 4℃でのステージ上で50 rpmで振とうすることによって1時間ブロッキング緩衝液中の配列をブロックします。
5. ブロックした後、4℃に冷却加湿チャンバーに配列を転送し、アレイ表面に直接希釈したプローブの90μlを添加します。 ARRをオーバーレイ1.5時間4℃で加湿チャンバーで上昇リフタースリップでaysと静的インキュベート（無振盪）。
6. 3 50mlコニカルチューブにプローブバッファに1分ごとにアレイを3回洗浄します。完全にスライドを包むのに十分な予備冷却プローブ緩衝液を含むコニカルチューブにスライドを追加します。リフタースリップを静かタンパク質マイクロアレイ（これはアレイ表面に損傷を与える可能性があるので、それを強制的にオフにしない）のオフにスライドすることができます。
7. 直前のような隆起したリフタースリップで洗浄（ステップ2.5）とオーバーレイを完了した後、アレイに直接抗体溶液を適用します。加湿チャンバー内で4℃で30分間、アレイをインキュベートします。
8. （プローブ緩衝液中で3回1分）前と同じ洗浄工程を行い、室温で5分間、卓上遠心機で800×gで50mlのコニカルチューブをスピン。 647 nmでの配列をスキャンする前に30分間、暗所でスライドホルダーの配列を空気乾燥させます。

結果

タンパク質-タンパク質相互作用活性は、約4,200ユニークS.を含む酵母機能的タンパク質マイクロアレイに対するベイトタンパク質として構築Tda1-V5タンパク質キナーゼ融合を評価するために、標準的なチップリーダーを用いて観察されましたセレビシエ GST融合タンパク質。 GENEPIXソフトウェアとさらに尋問は、様々な強度の結合事象の多くを明らかにしました。親和性は、その標?...

ディスカッション

プロトコルは提示本来インビボ ¹ で新しいキナーゼ相互作用ネットワークの識別をもたらす酵母プロテインキナーゼの異なるファミリーおよび関連にわたって結合活性を比較するために85のユニークな酵母タンパク質キナーゼ-V5融合タンパク質を用いて行きました。新興プロテオミクスプロファイリング技術として、高スループット（HTP）ペプチドライブラリー、および...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes	VWR	NC-10747	or comparable
Bacto yeast extract	Difco	0217-17
Bacto peptone	Difco	0118-17
Bacto agar	Difco	0140-01
Dextrose	Sigma	D9434
Raffinose	Sigma	R0514
Galactose	Sigma	G0750
Sc-Ura drop out media	MP Bio	114410622
Small Culture tubes	VWR/Fisher
Large Erlenmeyer Flask	VWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 ml)
Falcon tube (50 ml)	VWR/Fisher	21008-951
PBS Tablets	Sigma	P4417
FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube)
FastPrep Machine	MP Biomedicals	116004500
Zircon Beads	BioSpec	11079105
Triton X100	Sigma	P4417
DTT	Sigma	D9779
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S3014
Imidazole (pH = 7.4)	Sigma	I5513
PMSF	Sigma	93482
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)	Roche	11873580001
Phosphatase inhibitor cocktail 1	sigma	P2850
BSA	Sigma	A2153
Tween-20	Sigma	P1379
ATP	Sigma	A1852
Shaking Incubator (30 °C)
Nickel Affinity Resin	Life Technologies	R901-01
G25 column	GE life sciences	27-5325-01
Nutator	VWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)	Life Technologies
Coomassie Blue Stain	Life Technologies
Monoclonal V5 Antibody	Life Technologies	R960-25
Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody	Life Technologies	451098
Protein Microarrays Kit	Life Technologies	PAH0525013
Genepix Scanner	Molecular Devices
Lifter Slips	Thomas Scientific		http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF  (add just prior to use)			Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20			Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA			Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2			Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use)			Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and  60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol)			Galactose should not be autoclaved