JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا إجراءات لوضع العلامات والتنميط الجيني الفئران حديثي الولادة وتوليد الثقافات العصبية الأولية منها. والتنميط الجيني هو سريع وفعال وموثوق بها، ويسمح لاستخراج-نوكليك حمض الآلي. وهذا مفيد خصوصا بالنسبة للفئران المميتة neonatally وثقافاتهم التي تتطلب استكمال مسبق من التنميط الجيني.

Abstract

وغالبا ما يتطلب تحليل عالية الدقة من التشكل وظيفة الخلايا العصبية الثدييات والتنميط الجيني للحيوانات الفردية تليها تحليل الثقافات الأولية من الخلايا العصبية. نحن تصف مجموعة من الإجراءات ل: وصفها الفئران حديثي الولادة ليتم مرمزة، التنميط الجيني السريع، وإنشاء الثقافات منخفض الكثافة من الخلايا العصبية في الدماغ من هذه الفئران. وصفت الفئران الفردية عن طريق الوشم، والذي يسمح لتحديد المدى الطويل الأمد في مرحلة البلوغ. التنميط الجيني بواسطة بروتوكول وصف سريع وفعال، ويسمح لاستخراج الآلي للحامض النووي مع موثوقية جيدة. وهذا مفيد في ظل الظروف التي تكون فيها الوقت الكافي للالتنميط الجيني التقليدي غير متوفر، على سبيل المثال، في الفئران التي تعاني من الفتك حديثي الولادة. يتم إنشاؤها الثقافات العصبية الأولية في منخفض الكثافة، والتي تمكن تجارب التصوير في قرار مكانية عالية. تتطلب هذه الطريقة ثقافة إعداد طبقات المغذية الدبقية قبل طلاء الخلايا العصبية. عيتم تطبيق rotocol في مجملها إلى نموذج الفأر من خلل التوتر اضطراب حركة DYT1 (ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران)، ويتم إعداد الثقافات العصبية من الحصين، القشرة الدماغية والجسم المخطط من هذه الفئران. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على الفئران مع طفرات وراثية أخرى، وكذلك للحيوانات من الأنواع الأخرى. وعلاوة على ذلك، والمكونات الفردية للبروتوكول يمكن استخدامها لعزل المشاريع الفرعية. وبالتالي هذا البروتوكول سيكون لها تطبيقات واسعة، ليس فقط في علم الأعصاب ولكن أيضا في مجالات أخرى من مجالات العلوم البيولوجية والطبية.

Introduction

وقد أثبتت نماذج القوارض من الأمراض الوراثية مفيدة في إنشاء الوظائف الفسيولوجية للبروتينات طبيعية والأحماض النووية، وكذلك العواقب المرضية من العيوب في هذه. وتشمل الأمثلة الفئران ناقص لالبروتينات المشاركة في الوظائف الخلوية الرئيسية، وكذلك نماذج الماوس من الاضطرابات مثل مرض الزهايمر. ومع ذلك، يمكن بعض التلاعب الجيني يؤدي إلى الفتك حديثي الولادة بفترة وجيزة أو بعد بضعة أيام من الولادة. في هذه الحالات، والثقافات الخلية الأولية هي أداة مهمة لخلايا حية يمكن الحصول عليها من الجراء الجنينية أو حديثي الولادة قبل الموت، فإنها يمكن أن يستمر على الأقل لبضعة أسابيع في المختبر، وخلال هذا الوقت اللازم لتطوير الخلايا العصبية في وقت مبكر يمكن أن يتبعه الكيمياء الحيوية والوظيفية والمورفولوجية التجارب. لالثقافات الأولية، يمكن أن يكون مفيدا لوحة الخلايا العصبية في منخفض الكثافة. هذا يجعل من الممكن تصور somata الفردي، التشعبات، ومهاوي محور عصبي وtermi العصبيةالاشارات في قرار مكانية عالية. ومع ذلك، فإن البقاء على قيد الحياة والتفريق بين الخلايا العصبية في منخفض الكثافة عادة ما يتطلب أنهم مطلي على طبقة المغذية الدبقية، وشارك في تربيتها مع الخلايا الدبقية في غياب الاتصال الجسدي معهم، أو مثقف في المتوسط ​​مشروطة الدبقية 1.

يمكن إنشاء منخفض الكثافة الثقافات العصبية على طبقات المغذية الدبقية أن يعتمد على التنميط الجيني سريعة وموثوق بها مسبقا - في غضون بضع ساعة وعلى النقيض من بضعة أيام. السرعة هي أهمية خاصة عندما يحتاج النمط الجيني الخلايا العصبية لتكون مطابقة لتلك التي من طبقة المغذية الدبقية أعدت مسبقا. وكمثال عملي أكثر، قد يكون من الضروري أن تقرر أي الجراء منها الوراثي لاستخدامها في توليد الثقافات، لتحسين كفاءة تجربة.

نحن هنا لشرح بروتوكول العمل التي استخدمت لسرعة، مبسط وموثوق بها الماوس التنميط الجيني في المنشورات السابقة 2-6. ذيول الماوس ووتستخدم مجموعة المتاحة تجاريا. ويشمل هذا البروتوكول خطوة واحدة استخراج الأحماض النووية من الأنسجة، ويتطلب يست تنقية خطوة نوكليك حمض ولا استخدام منطقة عازلة إنهاء ('وقف الحل'). ويتضح موثوقية هذه الطريقة التنميط الجيني من خلال تقديم نتائج سلسلة من الاختبارات عندما يتم إدخال الخلافات مع الاحترام لكمية بدءا من العينات، وعمر الحيوانات وطول amplicons PCR. هذه المجموعة تقدم مزايا استخراج الآلي والموثوقية.

من أجل أن تكون شاملة، ويتجلى أيضا استخدام الوشم لتحديد المدى الطويل من الفئران مرمزة. ويتحقق من خلال تطبيق الوشم الحبر الوشم إلى الأدمة من الجلد (تحت البشرة) 7. ووصف إجراءات الوشم منصات مخلب من الفئران حديثي الولادة أو 1 يوم القديمة، على الرغم من أن الوشم يمكن تطبيقها على أجزاء أخرى من الجسم، مثل ذيول وأصابع القدمين، وأنيمالمرض من جميع الأعمار. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم عرض إجراءات الطلاء وزراعة الخلايا العصبية الماوس في مناطق ذات كثافة منخفضة، استنادا إلى إعداد الأمثل من أنواع مختلفة من طبقات المغذية الدبقية 2،8.

نحن نستخدم نموذج الجيني الماوس للالموروثة اضطراب عصبي DYT1 خلل التوتر - اضطراب حركة جسمية مهيمنة الناجمة عن طفرة في الجين TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG، p.Glu302del / p.Glu303del) 9. البروتين المشفرة، torsinA، ينتمي إلى "ATPases المرتبطة بأنشطة متنوعة الخلوية" (AAA +) عائلة من البروتينات، التي عموما على أداء مهام مثل كوصي، والمساعدة في الأعضاء: البروتين تتكشف، البروتين معقدة التفكيك، والاتجار الغشاء، والانصهار الحويصلة 10-13. نتائج طفرة في الحذف في إطار كودون لحمض الجلوتاميك، ويمكن أن يؤدي إلى مظهر من مظاهر "المبكر بداية المعمم خلل التوتر معزولة" 14،15. ومع ذلك، فإن مسارآليات ophysiological المسؤولة عن هذا الاضطراب لا تزال غير مفهومة تماما. في نموذج الفأر المغلوب في، أليل متحولة هو Tor1a tm2Wtd، المذكورة فيما بعد باسم Tor1a ΔE. متخالف ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران هي المرضى من البشر قابلة للحياة وتقليد وراثيا مع DYT1 خلل التوتر، في حين متماثلة اللواقح الضربة القاضية في الفئران تموت بعد الولادة 16،17، مع الكمون حتى الموت بعد الولادة تتأثر الخلفية الوراثية 18. الوفاة المبكرة لمتماثل الفئران الضربة القاضية في يقتضي أن كلا من التنميط الجيني للحيوانات وإنشاء الثقافات العصبية يتم الانتهاء بسرعة. وكمثال آخر على التنميط الجيني، Tfap2a (عامل النسخ AP-2α، وتفعيل محسن البروتين 2α ملزمة) وسوف تستخدم. البروتين المشفرة بواسطة هذا الجين مهم في تنظيم العمليات الخلوية متعددة، مثل انتشار، والتمايز والبقاء وموت الخلايا المبرمج 19.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوان أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة ولاية ايوا.

1. تحديد المدى الطويل من الفئران عن طريق الوشم على وسادات باو

  1. شل مخلب مع لوحة مخلب (سطح أخمصي) التي تواجه المجرب. عقد مخلب مع الإبهام والسبابة. يجب الحرص على عدم قرصة مخلب.
    ملاحظة: تجميد مستقرة مهم لضمان أن يتم وضع وشم الصباغ في الأدمة لوحة مخلب، وبالتالي هو دائم 7.
  2. مسحة لوحة مخلب مع 70٪ من الإيثانول على اسفنجة الشاش أو مسحة.
  3. تطبيق زيت الجلد لقضيب من القطن ذات الرؤوس، ثم اضغط بلطف طرف ضد سطح لوحة مخلب عدة مرات. فقط استخدام كمية صغيرة من النفط الجلد، عندما تكون موجودة بكميات كبيرة، فإنه سيتم منع الصباغ الوشم من الوصول إلى الجلد.
  4. تراجع نصائح من إبر الوشم في حبر الوشم فقط قبلإلى الوشم. استخدام نظيفة ومعقمة والإبر الوشم حادة، لتقليل الألم وإمكانية العدوى، وكذلك لزيادة كفاءة الوشم.
  5. في حين يتم تغطية سطح لوحة مخلب مع النفط الجلد، واضغط على نصائح الوشم الإبرة عموديا وبخفة على الجلد في وسط لوحة مخلب، وحقن الحبر عدة مرات. انظر الجدول المواد / معدات للحصول على معلومات حول النظام الوشم الكهربائية.
  6. رذاذ الايثانول 70٪ على اسفنجة شاش، اضغط بلطف ضد مخلب لإزالة الوشم اضافية الصباغ على سطح الجلد، وتفقد نوعية الوشم. تأكد من منتصف لوحة مخلب له، بقعة مستديرة داكنة يختلف عن العادي تصبغ الجلد. إذا كان الوشم ليست مظلمة أو كبيرة بما يكفي لسهولة المشاهدة، كرر الخطوات الوشم السابقة.

2. الفئران انماط الوليد باستخدام PCR التنميط الجيني السريع كيت

  1. تطهير النهاية البعيدة من ذيل الفأر مع الايثانول 70٪، وقطع 5 ملم أو أقل من الذيلتلميح وتحويلها إلى أنبوب من الشريط 8 أنبوب من النوع المستخدم لPCR. استخدام شفرة حلاقة من الامم المتحدة والمستخدمة لكل الجرو لتجنب التلوث المتبادل بين العينات. بدلا من ذلك، استخدم مقصا، ولكن في هذه الحالة، بعناية وبدقة إزالة الأنسجة المتبقية على شفرات باستخدام الايثانول 70٪. التحقق من وجود نزيف. إذا كان النزيف يحدث، ممارسة الضغط على لقطع جزء من الذيل مع اسفنجة شاش حتى يتوقف النزيف.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي الحل لكل أنبوب PCR يحتوي على العينة. انظر الجدول المواد / المعدات اللازمة لتكوينها والمعلومات حول عدة.
  3. ضع الشريط أنبوب إلى cycler الحرارية PCR، والبدء في استخراج الحمض النووي باستخدام البرنامج التالي: 1 دورة في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: هذا هو نفس PCR cycler الحرارية التي يتم استخدامها لاحقا لPCR.
  4. بعد الانتهاء من استخراج الحمض النووي، وإزالة الشريط أنبوب من الحرارية cycler على لالثانية عكس 5 مرات.
  5. نقل 4 ميكرولتر من محلول (استخراج DNA) من كل عينة إلى الامم المتحدة وتستخدم أنبوب من الشريط 8 أنبوب، وتخلط مع: 10 ميكرولتر من 2X PCR للخرسانة الجاهزة II، 2 ميكرولتر من مختلطة إلى الأمام وعكس الاشعال (موصى به في 0.5 ميكرومتر؛ انظر جدول المواد / معدات لمتواليات)، و 4 ميكرولتر من nuclease خالية H 2 O، لكل عينة. تدور لفترة وجيزة (على سبيل المثال، 3 ثانية) باستخدام جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات إلا عندما المناولة.
  6. أداء الدراجات الحرارية. شاهد جدول المواد / معدات لبرنامج الحراري.
  7. كشف المنتجات تضخيم الحمض النووي. تحميل حلا شاملا رد فعل من (ميكرولتر 20) PCR مباشرة في بئر من agarose هلام. تحميل علامات الوزن الجزيئي في بئر منفصل. تطبيق حقل كهربائي.
  8. الحصول على صور مضان من العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

3. الثقافة الابتدائية من الفأر الدماغ العصبيةالصورة على الدبقية طبقة الطاعم

ملاحظة: إجراءات تشريح الدماغ والتفكك الخلية (3.1) هي مشتركة بين جميع الإجراءات اللاحقة. يتم وصف إجراءات الثقافات الماوس الدبقية (3.2)، والثقافات الدبقية الفئران (3.3)، والماوس الثقافات العصبية (3.4) بشكل منفصل بعد ذلك.

  1. الدماغ تشريح والخلوية Dissocaiation
    1. تضحية واحدة الماوس أو الفئران الجرو بقطع الرأس، بسرعة إزالة الدماغ، ووضعه في حل هانكس "(انظر الجدول رقم 1 لتكوين) + 20٪ مصل الجنين البقري (FBS) في صحن 35 ملم (أبقى على الجليد).
    2. قطع الدماغ من خلال خط الوسط إلى نصفين. إزالة المنطقة ذات الاهتمام (على سبيل المثال، قشرة المخ، والمخطط الحصين) من كل نصف الكرة الأرضية من الدماغ. إزالة السحايا والأوعية الدموية الرئيسية من على سطح الأرض. قطع منطقة في الدماغ إلى 4-10 شرائح رقيقة باستخدام شفرة جراحية.
    3. شطف شرائح الدماغ في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، مرة واحدة خفة دمح هانكس "حل + 20٪ FBS، ثم 3 مرات مع هانكس" الحل (أي بدون المصل) (كل في 4 درجات مئوية). لشطف، إضافة 5-10 حل مل، والسماح للدماغ شرائح تستقر في أسفل الأنبوب، نضح الحل من أعلى، وإضافة حل جديد. الانتهاء من إجراء الشطف بواسطة الشفط الحل.
    4. تصفية 2 مل من محلول الهضم التي تحتوي على التربسين (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) باستخدام حقنة 3 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة في الأنبوب الذي يحتوي على شرائح الدماغ. السماح للtrypsinization المضي قدما لمدة 13 دقيقة في RT.
    5. تحييد الحل التربسين أولا بواسطة الشفط أكثر من ذلك ومن ثم عن طريق إضافة 7-10 مل من هانكس "حل + 20٪ FBS (4 ° C).
    6. شطف شرائح الدماغ، مرتين مع هانكس "حل + 20٪ FBS، ثم ثلاث مرات مع هانكس" الحل (أي من دون المصل) (كل في 4 درجات مئوية). الانتهاء من إجراء الشطف بواسطة الشفط وsolutأيون.
    7. تصفية 2 مل من محلول التفكك (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) باستخدام حقنة 3 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة إلى أنبوب مع شرائح الدماغ.
    8. ميكانيكيا فصل الخلايا عن طريق الطحن بلطف 10-20 مرات، حتى قطعة نسيج مرئية تختفي. استخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير وتجنب الوقوع في فقاعات خلال سحن.
    9. انتظر 3 دقائق لقطع صغيرة ليستقر.
    10. نقل الغالبية من الحل (~ 1.5 مل، وترك بعض الحلول في أسفل) إلى أنبوب 15 مل الطرد المركزي التي تحتوي على 3 مل من محلول هانكس '+ 20٪ محلول FBS (4 ° C)، وذلك باستخدام-توصيله القطن، النارية مصقول ماصة باستير. لا نقل عن الحل لأن إدراج أي الرواسب في قاع النتائج عادة في تدهور الثقافة.
    11. أجهزة الطرد المركزي لمدة 13 دقيقة في ~ 185 غرام (~ 1،100 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية.
    12. نضح طاف بلطف،إضافة 1 مل من الطلاء المتوسطة (37 ° C) إلى بيليه، و resuspend من قبل pipetting بلطف عدة مرات باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير قبل تحسنت.
      ملاحظة: يتم استخدام ثلاثة أنواع مختلفة من الطلاء وسائل الإعلام لأغراض ثقافة مختلفة: تصفيح المتوسطة 1 للخلايا الدبقية الماوس، والطلاء متوسطة 2 لالخلايا العصبية الماوس، والطلاء متوسطة 3 لالخلايا العصبية الفئران والخلايا الدبقية (انظر الجدول 1 للتركيبات) .
    13. إخراج 10 ميكرولتر من تعليق خلية، ومزجها مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان حل الأزرق، وقياس كثافة الخلايا الحية، وذلك باستخدام إما عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي.
  2. الثقافات الماوس الدبقية
    1. غسل لل coverslips للمساعدة في إنشاء ثقافات صحية من خلايا فأر.
      1. تزج coverslips الزجاج (الجولة، 12 مم) في حامض النتريك 70٪ في طبق بتري الزجاج. يحفظ بعيدا عن الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم، ووضعه على المداري شاكر O / N.
      2. شطف الزجاج coversliملاحظة في طبق بتري ثلاث مرات على الأقل مع الماء المقطر. تزج في الماء المقطر. وضع طبق على شاكر يا المداري / N.
      3. تجفيف coverslips على 150 مم ورق الترشيح هتما في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
      4. الأوتوكلاف لل coverslips.
      5. ضع لل coverslips في صحن ثقافة 24-جيدا.
    2. التسمية وراثى الفئران حديثي الولادة وفقا لالخطوتين 1 و 2.
    3. الحصول على خلايا المخ من الجراء الماوس، وفقا لخطوة 3.1.
      ملاحظة: استخدام قشرة الدماغ هو نموذجي لإعداد طبقة الماوس الدبقية المغذية. ومع ذلك، مناطق أخرى من الدماغ، مثل الحصين والمخطط، ستعمل بعد التعديل السليم للكثافة الخلية نظرا لأعداد وعائدات من الخلايا من مختلف المناطق المختلفة.
    4. إضافة ~ 4 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​1 إلى تعليق خلية النهائي (~ 1 مل). لمرحلة ما قبل ارتفاع درجات الحرارة وسائل الإعلام والثقافة، ووضع الحل في الحاضنة الثقافة (5٪ CO 2 -95٪ O 2، 37 ° C) O / N، لالسماح للقيم درجة الحرارة ودرجة الحموضة لتحقيق الاستقرار.
    5. نقل تعليق خلية إلى غير المصقول ثقافة T25 قارورة، وذلك باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير. ضع قارورة في حاضنة الثقافة.
    6. في 1 يوم في المختبر (DIV)، وشطف الخلايا المستزرعة في قارورة T25 مرتين مع تصفيح متوسطة 1 (4 ° C). ضع قارورة مرة أخرى في الحاضنة. أداء الشطف بواسطة الشفط المتوسطة داخل قارورة تماما مع ماصة باستور، مضيفا ~ 5 مل من المتوسط ​​الطازجة وإمالة بلطف القارورة عدة مرات في حركة دوامات.
    7. في 6-9 DIV، (أي قبل يوم واحد trypsinization والطلاء coverslips على، في خطوات 3.2.8-3.2.13)، وضع 100 ميكرولتر من مواد الطلاء مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية (انظر جدول المواد / معدات تعليقات حول مادة الطلاء) على coverslips الزجاج في طبق ثقافة، ووضع الطبق الثقافة في حاضنة الثقافة.
    8. في 7-10 DIV، عندما كانت الخلايا 20-40٪ متموجة (مستمر مكانيا)، يعرض للتريبسين لهم.
      1. شطف القارورة مرة واحدة، عن طريق الشفط عن الحل داخل القارورة وإضافة ~ 13 مل من محلول هانكس "(4 ° C)، إمالة بلطف القارورة عدة مرات في حركة دوامات، ونضح الحل تماما.
      2. إضافة 40 ميكرولتر من الدناز الحل (تركيز النهائي، 750 وحدة / مل) إلى 4 مل التربسين-EDTA الحل، لتمرير حل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة إلى الخلايا في قارورة.
      3. السماح للtrypsinization المضي قدما لمدة 13 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
      4. تحييد الحل التربسين بإضافة 2 مل من 100٪ FBS (4 ° C) إلى القارورة.
      5. نقل الخلايا trypsinized إلى أنبوب 15 مل الطرد المركزي باستخدام 5- إلى 10 مل ماصة، إضافة ~ 4 مل من محلول هانكس '+ 20٪ FBS (4 ° C)، الطرد المركزي في ~ 185 غرام و 4 درجة مئوية لمدة 13 دقيقة ، ونضح طاف.
    9. resuspend الكرية في 1 مل من قبل WARMEد الطلاء المتوسطة-1.
    10. قياس كثافة الخلايا وفقا لخطوة 3.1.13.
    11. نضح في مواد الطلاء تماما من coverslips الزجاج، وصفيحة ~ 50 ميكرولتر من الخلايا الدبقية معلق coverslips على.
      ملاحظة: هذه الخلايا سوف تنشئ طبقة المغذية الدبقية.
    12. مكان الطبق الثقافة مع coverslips في الحاضنة.
    13. في وقت لاحق 20-60 دقيقة، إضافة 1 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​1 إلى كل بئر، ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. ملاحظة: في حين يتم إضافة المتوسطة تصفيح، وسوف يكون من المفيد استخدام ماصة أخرى إلى الضغط باستمرار على المحيط الخارجي للساترة (حيث هناك خلايا مطلي)، بحيث ساترة لا تطفو على المدى المتوسط.
    14. في 1 DIV طبقة المغذية الدبقية (أي على ساترة الزجاج)، استبدل المتوسطة مع 1 مل من الطلاء قبل تحسنت المتوسطة-1، بواسطة الشفط كل من الحل في بئر ثم ملئه مع المتوسط ​​الطازجة.
    15. في 2-3 DIV طبقة المغذية الدبقية عندما سلليرة سورية هي 80-100٪ متموجة، إضافة مثبط الإنقسامية (10 ميكرولتر من خليط من 5 الفلورية 2'-deoxyuridine + يوريدين، تركيزات النهائية من 81.2 و204.8 ميكرومتر، على التوالي) إلى كل بئر، لمنع تكاثر الحمض النووي، وبالتالي ل قمع انتشار الخلايا الدبقية.
    16. في 7-9 DIV، عندما كانت الخلايا 90-100٪ متموجة (1-2 ساعة قبل الطلاء الخلايا العصبية في طبقة المغذية الدبقية)، استبدال مستنبت مع الطلاء قبل تحسنت المتوسطة 2 (37 ° C).
      سيتم مطلي الخلايا العصبية في نفس اليوم، وذلك باستخدام الخطوة 3.4: ملاحظة.
  3. الثقافات الفئران الدبقية
    1. معطف ثقافة قارورة T25 مع نفس مواد الطلاء.
      ملاحظة: هذا أمر ضروري لإزالة لاحقة من الخلايا غير ملتصقة في الخطوة 3.3.5.
      1. إضافة 2.0 مل من مواد الطلاء إلى القارورة، ووضع القارورة في الحاضنة الثقافة.
      2. بعد 2-3 ساعة، نضح مواد الطلاء تماما، مثل أن الكلمة القارورة يصبح الجاف.
    2. الحصول على خلايامن الفئران الوليدة، وفقا إلى الخطوة 3.1.
      وتستخدم المنطقة CA3-CA1 من الحصين لإعداد طبقة الفئران الدبقية المغذية: ملاحظة. ومع ذلك، مناطق أخرى من الدماغ، مثل قشرة الدماغ والجسم المخطط، ستعمل بعد تعديله طبقا للاختلافات في كثافة الخلية نظرا لأعداد وعائدات من الخلايا من مختلف المناطق المختلفة.
    3. إضافة ~ 4 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​3 إلى تعليق خلية النهائي (~ 1 مل).
    4. نقل تعليق خلية في قارورة المغلفة ثقافة T25، وذلك باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير. ضع قارورة في حاضنة الثقافة (5٪ CO 2 -95٪ O 2، 37 ° C).
    5. في 2-3 DIV، عندما الخلايا هي 20-40٪ متموجة، وإزالة غير ملتصقة أو ضعيفة الخلايا الملتصقة، عن طريق إغلاق الغطاء بإحكام، والهز القارورة بقوة ~ 10 مرات، الشفط الحل، وإضافة 4-5 مل من الطلاء متوسطة 3 (في 4 درجات مئوية). كرر هذا الإجراء مرة واحدة. فحص الخلايا المستزرعة عبر الكلمة قارورة كامل (على سبيل المثال،باستخدام المجهر المرحلة على النقيض) للتأكد من أن تلك التي تظهر العصبية (أي تلك التي الحافة الخارجية من جسم الخلية يظهر على مرحلة مشرقة) يتم إزالتها تماما. كرر الإجراء كلما كان ذلك ضروريا لإزالة هذه الخلايا، ومن ثم العودة القارورة إلى حاضنة.
      ملاحظة: القوة والعدد الإجمالي لل"يهز" المطلوبة قد تختلف بين المجربون الفردية. الشيء المهم هو ليس للحفاظ على العدد الكلي للهزات لعدد محدد، ولكن لتأكيد أن الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا والقضاء عليها.
    6. في 6-8 DIV، عندما الخلايا هي 90-100٪ متموجة، مرور الخلايا الدبقية التي كتبها trypsinizing لهم كما في الخطوة 3.2.8.
    7. بعد الطرد المركزي، resuspend الكرية في 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، إضافة 10 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، ونقل الخلايا trypsinized إلى الامم المتحدة والمغلفة T75 قارورة، والثقافة لها في الحاضنة.
      ملاحظة: سيتم passaged الخلايا الدبقية الفئران مرتين. في المقابل الخلايا الدبقية الماوس عالبريد passaged مرة واحدة فقط لأنها تصبح غير صحية بعد ممرات متعددة. سيتم passaged الخلايا الدبقية الفئران في قوارير T75 التي لم يتم المغلفة مع أي مواد الطلاء. طلاء يسمح الخلايا الدبقية الفئران أن ينمو بسرعة كبيرة جدا وتنتج العديد من الخلايا المهدبة (خلايا البطانة العصبية المفترضة)، والتي سوف تتدهور حالة ثقافة العصبية في وقت لاحق.
    8. في 17-19 DIV الثقافة الدبقية في قارورة (أي 11 يوما بعد الركض وقبل trypsinization يوم واحد والطلاء على coverslips خطوات 3.3.9-3.3.14)، وضع 100 ميكرولتر من مواد الطلاء على coverslips الزجاج غير مغسولة ( الجولة، 12 مم) في طبق ثقافة، ووضع الطبق الثقافة في حاضنة الثقافة.
      ملاحظة: للحصول على الثقافات الدبقية الفئران، لم يلاحظ فرق في النتائج الثقافة مع أو بدون غسل لل coverslips.
    9. في 18-20 DIV الثقافة الدبقية في قارورة (أي بعد 12 يوما من الركض)، وإعداد طبقة المغذية الدبقية التي كتبها trypsinizing في الخلايا المستزرعة، وفقا لشارعالجيش الشعبي 3.2.8.
    10. أثناء الطرد المركزي، ونضح مواد الطلاء تماما من coverslips الزجاج.
    11. بعد الطرد المركزي، resuspend الكرية في 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، وقياس كثافة الخلايا، وفقا لخطوة 3.1.13.
    12. ضبط كثافة الدبقية إلى 10 4 الخلايا الحية / مل، ولوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية الدبقية على coverslips الزجاج المطلي.
      ملاحظة: هذه الخلايا سوف تنشئ طبقة المغذية الدبقية.
    13. مكان الطبق الثقافة مع coverslips في الحاضنة لمدة 20-60 دقيقة.
    14. إضافة 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C) إلى كل بئر، ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة.
    15. في 3-4 DIV طبقة المغذية الدبقية، عندما الخلايا على ساترة هي 40-80٪ متموجة، إضافة 1 مل من وسط النمو قبل تحسنت (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) الذي يحتوي على السيتوزين β-D-arabinofuranoside ( أراك، تركيز النهائي من 4 ميكرومتر) لوقف انتشار الخلايا الدبقية. لوحة الخلايا العصبيةالصورة في 7-9 DIV طبقة المغذية الدبقية عندما الخلايا هي 60-80٪ متموجة، وذلك باستخدام الخطوة 3.4.
  4. الثقافات الماوس العصبية
    1. التسمية وراثى الفئران حديثي الولادة وفقا لالخطوتين 1 و 2.
    2. استخدام الماوس الجراء للخطوة 3.1.
    3. ضبط كثافة تعليق الخلية الحية إلى ~ 2.0 × 10 5 خلية / مل باستخدام الطلاء متوسطة 2 لتصفيح على الخلايا الدبقية الماوس، أو استخدام قبل تحسنت الطلاء متوسطة 3 لتصفيح على الخلايا الدبقية الفئران.
    4. لوحة الخلايا على طبقة المغذية الدبقية، وذلك بإضافة بلطف تعليق الخلية إلى مستنبت من كل بئر. ملاحظة: سيتم تحديد حجم تعليق الخلية التي يمكن ان تضاف من قبل العدد المستهدف من الخلايا في الثقافة أيضا. على سبيل المثال، لوحة ~ 60 ميكرولتر من تعليق خلية لتحقيق 12،000 خلية / جيدا.
    5. لاحظ أن أي تغييرات حل ضرورية بعد أن يتم مطلي الخلايا العصبية. كن حذرا لتجنب التبخر من الحل من الآبار على مدى الثقافة، من خلال ترطيب داخل سو حاضنة الثقافة.

النتائج

كمثال لتطبيق هذا البروتوكول، وتظهر نتائج ممثلة لوصفها الفئران عن طريق الوشم، والتنميط الجيني يمكن الاعتماد عليها تحت ظروف تجريبية مختلفة، وإنشاء الثقافات العصبية الأولية على طبقات المغذية الدبقية.

الوشم

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا يشمل إجراءات الوشم لتسمية / تحديد الفئران، لالتنميط الجيني الفئران من نصائح الذيل، وزراعة الخلايا العصبية مخ الفأر في منخفض الكثافة. في جولة واحدة من التجارب باستخدام 6-8 الجراء، وعادة ما تتطلب هذه الإجراءات ~ 0.5 ساعة، ~ 4 ساعة و ~ 2 ساعة، على التوال...

Disclosures

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Acknowledgements

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS - tattooing
Machine CleanserAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying AgentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NDAR4This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Skin Prep ApplicatorAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Q-tip.
Skin Prep solutionAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacialVWRBDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology graderpiA20090-500 We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)FisherBP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µlDot Scientific IncUG104-96RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml USA Scientific1402-2900Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual rpi145660Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, naturalUSA Scientific1605-0000Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGSee comments section of uridine for more information.
B-27 supplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treatedBD falcon353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 mlBD falcon353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 mlBD falcon353136
Conical Tube, polypropylene, 15 mlBD falcon352095
Countess (cell number counter) chamber slidesGIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mmPyrex3160-101
Distilled waterGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KUStock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene569-0020
Fetal bovine serum (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks' Balanced SaltsSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)Sigma-AldrichH3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagentSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinSigma-AldrichI5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 mlBD Biosciences355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plateBD falcon353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plateBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquidGIBCO-Invitrogen10888-022
Nitric AcidVWRbdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21 prepared in the labSource: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾” Fisher13-678-6AUse this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9” Fisher13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Serological pipet, 2 mlBD falcon357507
Serological pipet, 5 ml BD falcon357543
Serological pipet, 10 mlBD falcon357551
Serological pipet, 25 mlBD falcon357525
Serological pipet, 50 ml BD falcon357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basisSigma-Aldrich480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µmCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, bovine plasmaCalbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XISigma-AldrichT1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GStock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktailMerck MilliporeNE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO–9This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GTBIO–RAD170–4405Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUOur PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, CountessGIBCO-InvitrogenC10310This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2NUAIRENU-425-400This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water JacketNUAIRENU-4850
Horizontal Clean BenchNUAIRENU-201-330This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed ShakerLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeFisher46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. , 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M., Banker, G., Goslin, K. . Ch. 18. Culturing Nerve Cells. , 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

95 AP2 PCR torsinA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved